Способ получения интерлейкина-2 человека

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР 6 ХАЯ" п"И с.,1;. ИСАНИЕ ИЭ ЕНИЯ АТЕН 3 тся-2 чеег 1 сп 1 а ся по- Повытез ин- мидами Изобретение относится к генетической инженерии и касается способа получения интерлейкиначеловека в клетках бактерий ЕвсЬег 1 сЬ 1 а со 11.Целью изобретения является повышение выхода интерлейкина.Повышение выхода белка в клетках Е. со 1 обеспечивается за счет того, что конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК рТ 1 оС 2-22, рТ 11-1 о 2-22, рС 1 оС 2-22, рТ 1 Ы, 2-21 а, рТ 1 Ы 2-21 Ь кодирующие синтез интерлейкина, полученными плазмидами трансформируют бактериальные клетки Е. со 11,П р и м е р 1, Линию клеток ле" кемин Т человека, клетки Джуркат суспендируют в среду КРМ 1 1640, содержащую 107 (об./об.) РСБ, и получают иросту, пов-, культуральения размера ны культиви(21) 3679351/28(56) С 111 в ег7, 125, 11 6, р,юл. Р 17Ко, Лтд, Джапанизнсер Рисерч (ЗР)анигути, Масами Муугано,. Хироси Матси Дзунди Камуро (Л557.2(048)(088.8)1. о. 1 пюцпо 1, 1981709-1719.,80 1479005 А 31511 с 1 С 12 1 Я 15/00, С 12 Р 21/00(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА ЧЕЛОВЕКА(57) Изобретение относится к областигенетической инженерии и касаеспособа получения интерлейкиналовека в клетках бактерий ЕвсЬсо 11. Целью изобретения являетвышение выхода интерлейкина.шение выхода белка в клетках ЕвсЬег 1 сМа со 1 д обеспечивается за счеттого, что конструируют рекомбинантные плазмидные ДНК рТ 1 оС 2-22, рТП 1Ы 2-22, рС 1 оС 2-22, рТ 1 о 2-21 арТ 1 о - 2-21 Ь, кодирующие синтерлейкина, полученными плазтрансформируют бактериальные клеткиЕ. со 1 д3 табл. рентгеновскими лучами до 10000 Р. при комнатной температуре в течение 50 с. Затем клетки, подвергнутые облучению, культивируют.в течение 5 дней при 37 С в инкубаторе, содержащем 5 Е СО, при начальной плотности клеток 1 х 10 кл./мл. Клетки после обработки мутагеном (0,2 кл./углубление) помещают в углубления 10 микропластинок, имеющие плоское дно, причем каждая .микропластинка имеет 96 углублений,о. и культивируют при 37 С в инкубаторе,содержащем 5 Х СО, в течение 21 дня,Клоны, полученные в углублениях и проявляющие тенденциюторно переносят в свежную среду с целью увелклона и размноженные к19 20 1479005 Таблица 3 Проба Разбавление Содержание 9Н-ТдР, отсчетов/мин КоличествоИЛ, ед./мл Контрольная 1 (средадля анализа)Контрольная 11 (верхнийслой жидкой культурынеобработанных яйцеклеток)Продукт трансляции иРНКиРНК .Контрольная 1 (средадля анализа)Контрольная 11х 32х 2х 32 0 0 х 32х 2х 32 88 42 32 Составитель Н. КузенковаРедактор В. Петраш Техред Л.СердюковаКорректор С. Шекмар Заказ 2378/58 Тираж 501 Подписное Производственно"издательский комбинат "Патент", г,ужгород, ул. Гагарина,101ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5руют в течение 24 ч при начальнойплотности клеток 1 х 10 кл./мл в присутствии 50 мкг/мл КОН А, измеряютактивность интерлейкина(ИЛ).Затем линию Т-клеток человека, обозначенную как Джуркат 11 (,7 - 111) иклонированную из клетки-родителяДжуркат, выделяют. В результате этого.выход ИЛувеличивается в 40 раз по 10сравнению с родительскими клетками,Линию 1-11 Т клонированных клетоквыращивают при известных условиях,и скорость их роста почти та же, чтои у обычных клеток Джуркат,Клетки (1 х 10 кл./мл) 3-111 перевивают в 1000 мл синтетической культуральной среды, КХТС 55-9 в роликовой колбе для выращивания культур икультивируют в течение 4 дней при 20о37 С, клетки после размножения собирают путем центрифугирования, Собранные клетки снова превивают в среду, в которую добавляют 25 мкг/млКОН А с тем, чтобы плотность клеток 256. составила 4 х 10 кл, /мл, Используютчетыре роликовые колбы для выращивания, причем в каждую колбу загружают1000 мл привитой культуральной среды,Культивирование продолжают в течение З 06 ч при вращении колб.Клетки Джуркат (1,2 х 10 ), стимуллированные 25 мкг/мл КОН А в течение6 ч, суспендируют в 8000 мл фосфатного буфера, сбалансированного солянымраствором. Клетки промывают дваждыс помощью центрифугирования и вновьсуспендируют в 800 мл раствора КЯВ(10 ммоль трис-НС 1, рН 7,5; 10 ммоль/БаС 1; 1,5 ммоль МяС 1 ), содержащего 40комплекс Ринуклеозиды-Ванадил 11 0 мМ)в качестве ингибитора нуклеазы. Затем добавляют детергент БРтакимобразом, чтобы его конечная концентрация составила 0,057.; содержимое 45энергично перемешивают, а ядра клеток удаляют с помощью центрифугирования в течение 5 мин со скоростью3000 об/мин при 4 С. В верхний слойдобавляют ЯРЯ (0,57) и ЗДТК (5 ммоль)и цитоплазматическую РНК экстрагируютдобавлением равного объема фенола.После трехкратного экстрагированияфенолом РНК осаждают двумя объемамиэтанола и осадки собирают с помощьюцентрифугирования, затем их растворяют в 10 ммоль трис-НС 1 при рН 7,5.Количество полученной РНК составляет196 мг,Фракционирование иРНК осуществляют с использованием хроматографии на олиго (дТ) -целлюлозе. Раствор абсорбции - раствор при рН 7,5, содержащий 20 ммоль трис-НС 1, 0,5 моль ИаС 1, 1 ммоль ЗДТК и 0,5 Е ЯВЯ, а элюирование осуществляют водой и 10 ммоль трис-НС 1 (рН 7,5) по очереди после промывки колонны буфером (20 ммоль трис-НС 1, рН 7,5; 0,5 ммоль МаС 1;1 ммоль ЗДТК). В результате элюирования получают 3,6 мг иРНК, Затем 2,4 мг полученной иРНК фракционируют с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы (градиент плотности сахарозы от 5 до 2,5 в растворе с рН 7,5, содержащем 50 ммоль трис - НС 1, 1 ммоль ЭДТК и 0,2 моль ИаС 1), подвергают центрифугированиюсо скоростью 26 000 об/мин в течение24 ч при 4 С, и фракции с 11 по 12 СиРНК подвергают фракционированию нафракции У 12, 13 и 14 в количестве59; 46 и 60 мкг соответственно.РНК, полученную во фракции Ф 13,вводят в форме микроинъекции в овоцит Хепорцз 1 а 1 чз (50 нг иРНК/яйцеклетку) и культуральный верхнийслой используют для анализа активности ИЛ,Как показано в табл. 1, увеличение полученной дозы Н-ТДР и увеличение количества активированных Тлимфоцитов согласуется, что указывает на то, что иРНК в этой фракциисодержит ИЛиРНК человека,Далее кДНК синтезируют в лабораторных условиях из фракции Р 13 с.11-12 С иРНК, содержащей ИЛиРНК,и рекомбинантную ДНК строят с помощью вектора плазмида рВК 322. С помощью рекомбинантной ДНК трансформируют кишечную палочку ЕзсЬег.сй 1 асо 11 и клон, содержащий клоны ИЛ кДНК, изолируют следующим образом:50 ммоль трис-НС 1 буфера (рН 7,5), -30 ммоль МаС 1, 6 ммоль МяС 1, 5 ммоль дитиотрейтола (ДТТ), 0,5 ммоль каждого из дАТФ, дГТФ, дПТФ, дТТФ (дЦТФ состоит из радиомеченого "Р дЦТФ), 0,7 мкг олиго(дТ)д, 1 О мкг иРНК и 15 ед, А 1"Р обратной транскриптидазы смешивают и поддерживают в течение 90 мин при 41 С.После завершения реакции ДНК извлекают в виде этаноловых осадков после обработки фенолом, а затем ДНК растворяют при рН 7,5. в растворе5 147содержащем 20 ммоль трис-НС 1 и 1 ммольЭДТК. В результате синтезируют2,5 мкг он-кДНК. Чтобы удалить иРНК,содержащуюся в этом растворе, приготавливают 0,33 н. раствор ИаОН путемдобавления ИаОН, затем раствор выдерживают в течение 15 ч при комнатнойтемпературе и нейтрализуют равнымобъемом 1 М трис-НС 1 при рН 7,5. Далее полученный раствор пропускаютчерез колонну "Сефадекс С. Всего получают 1,8 мкг кДНК.50 ммоль фосфатного буфера рН 7,5)10 ммоль М 8 С 1, 10 ммоль ДТТ,0,75 ммоль каждого из дАТФ, дГТФ,дЦТФ, дТТФ (дЦТФ состоит из радиомеченого Н дЦТФ), 1,8 мкг он-кДНК и8 ед, полимеразысмешивают в течеоние 15 ч при 15 С, После завершенияреакции ДНК извлекают в виде этанолового осадка после нескольких обработок фенолом и хлороформом. Образуется 1,10 мкг дн-кДНК. Смесь 50 ммольацетата натрия (рН 4,5), 0,2 ммольИаС 1, 1 ммоль ЕпС 1 и 1,10 г дн-кДНКинкубируют в течение 20 мин при 37 С)затем в нее добавляют 0,25 ед, нук.-.леаэы Я и смесь инкубируют еще втечение 15 мин.После завершения реакции полученный продукт дважды обработанный фе)иолом, пропус кают через "СефадексС", в результате чего получают0,55 мкг дн-кДНК.Смесь 0,14 моль какодилата калия,30 ммоль трис-основания, 0,1 ммольДТТ, 1 ммоль СоС 1, 0,64 ммоль РдЦТФ (уд, активность 2,7 х 10 отсчетов мин нмоль), 0,55 мкг дн-кДНК и5 ед, терминальной трансферазы инкуобируют в течение 7 мин при 37 С, затем пропускают через "Сефадекс С"после обработки фенолом, чтобы получить 0,50 мкг ДНК в виде этаноловыхосадков. Извлеченная ДНК содержитпримерно 50 дЦМФ-остатков на обоих3 -терминалах,1 О мкг плазмиды рВК 322 ДНК рассекают ферментом сечения Рз 1 и к3 -терминалам рассеченной ДНК добавляют дГМФ-цепь с использованием тогоже метода, что при добавлении дЦМФ кдн-кДНК за исключением того, что вместо дЦТФ используется дГТФ,Смесь 50 ммоль трис-НС 1 (рН 7,5),0,1 моль ИаС 1, 5 ммоль ЭДТК, 0,05 мкгрВК 322, удлиненного дГМФ-остатками,и 0,01 г кДНК, удлиненной дЦМФ, ин 9005 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 кубируют сначала в течение 2 мин прио65 С, затем в течение 120 мин прио о46 С, в течение 60 мин при 37 С и втечение 60,мин при комнатной температуре,Е, со 11 Х 1776 прививают в 50 млЛ-бульона, содержащего 100 мкг/млдиаминопимелиновой кислоты, 50 мкг/млтимидина, 1 Х триптофана, 0,5. экстракта дрожжей, 0,5 Е ХаС 1 и 0,1 Е глюкозы, и культивируют при встряхиваниипри 37 С до тех пор, пока поглощениекультуральной жидкости в области562 нм не даст оптическую плотность0,3. После завершения культивированиякультуральную жидкость выдерживаютпри 0 С в течение 30 мин, затем бактериальные клетки собирают с помощьюцентрифугирования, промывают дважды25 мл раствора, содержащего 5 ммольтрис-НС 1 (рН 7,6), 0,1 моль МаС 1,5 ммоль М 8 С 1 и 10 ммоль КЬС 1.Полученные таким образом клеткисуспендируют в 20 мл раствора, содержащего 5 ммоль трис-НС 1 (рН 7,6),0,25 моль КС 1, 5 ммоль МеС 10,1 моль СаС 1 и 10 ммоль КЬС 1, иовыдерживают при 0 С в течение 25 мин,Далее клетки собирают и вновь суспендируют в 1 мл того же раствора. Затем описанную выше рекомбинантную ДНКдобавляют в 0,2 мл суспензии клеток иосуспензию выдерживают при 0 С в течение 60 мин, В культуру добавляют0,7 мл Л-бульона и смесь .инкубируютпри встряхивании в течение 30 минопри 37 С. Полученную таким образомкультуральную среду (0,1 мл) равномерно распределяют на поверхностисреды, содержащей 1,5 агара, состоящей из Л-бульона, содержащего100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты, 50 мкг/мл тимидииа и 15 мкг/млотетрациклина, и инкубируют при 37 Св .течение 2 дней,Образующиеся в результате 432 колонии разделяют на 18 групп, каждаяиз которых содержит 24 различных бактериальных клона, прививают в 200 млЛ-бульона, содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты, 50 мкг/млтимидина и 10 мкг/мл гетрациклина,и культивируют при встряхивании при37 С в течение 5 - 7 ч. Затем 200 млсвежего Л-бульона, содержащего хлор-.амфеникол с концентрацией 170 мкг/мл,добавляют в культуру и культивирование продолжают еще в течение ночи.7 14790Полученную таким образом после амплификации дНК-плаэмиду подвергают очистке с использованием известныхсредств. Клоны, содержащие кДНК ИЛ,отбирают с помощью аналитического метода гибридизации - трансляции иРНК(Г - Т-анализ).Г-Т-анализ осуществляют следующимобразом. 10Очищенную ДНК (25 мкг) рассекаютферментом рестрикции Нпй 11, обрабатывают три раза фенолом, смесью фенол - хлороформ и хлороформом соответственно, осаждают этанолом, промывают этанолом (80 ) и растворяют в40 мкл .80 .-ного формамида,Затем реакционную смесь нагреваютс целью денатурирования до температуоры 90 С, которая поддерживается 5 мин, 20разбавляют 1,3 мл с 10 х ССЦ (1,5 мольНаС 1, 0,15 моль цитрата натрия). Далее ДНК фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах, фильтраты сушат приодо 80 С в течение 3 ч и инкубируютв течение 18 ч при 37 С в растворе,содержащем 50 формамида, 20 ммольР).рев (рН 6,5), 0,75 моль БаС 1,5 ммоль ЭДТК, 0,2% ЯЭБ и 250 мкг. поли(А) иРНК, полученной из индуцированных 1-11 клеток, с целью получе,ния гибрида ДНК, зафиксированной нафильтрах, с ИЛиРНК. Затем фильтрыопромывают, при 65 С три раза раствором, содержащим 10 ммоль Рдрев (рН6,5), 0,15 моль БаС 1, 1 ммоль Р 1 рев,.10 ммоль БаС 1, и обрабатывают0,5 ммоль ЭДТК, 0,1%-ным растворомЗЭЯ при 95 С в течение 1 мин с тем,чтобы извлечь с фильтров гибридизированную иРНК. Экстрагированную таким образом иРНК подвергают очисткена колонне из олиго-дТ-целлюлозы всоответствии с иввестными методамии инъецируют .в овоциты Хепорив с 45целью определения активности ИЛ транслированных протеинов, Одна из18 групп, каждая из которых состоитиз 24 клонов, дает положительнуюактивность ИЛ48 ед./мл в испыта 3нии на поглощение Н-ТдР в то времякак другие группы дают четкий отрицательный результат,Затем 24 отдельные колонии, принадлежащие положительной группе, при" 55вивают в 200 мл Л-бульона, культивируют в аэробных условиях в течение5-7 ч при 37 С и добавляют свежийЛ-бульон, содержащий хлорамфеникол, 05 8 После амплификации ДНК-плазмиды впроцессе культивирования в течениеночи плазмиду подвергают очистке в соответствии со стандартными процедурами. После рассечения примерно 5 мкг каждой ДНК-плазмиды с помощью Ндпй 111 каждую ДНК-плазмиду фиксируют на нитроцеллюлозных фильтрах. Фильтры подвергают гибридизации с ИЛиРНК.и гибридизированную иРНК извлекают, а затем в виде инъекции вводят в овоцит Хепорив с тем, чтобы определить активность ИЛтранслированных протеинов.Как показано в табл. 2, только ДНК-плазмида, полученная после очистки из единственной колонии, обозначенная р 3-16; дает положительную активность ИЛ, Поэтому этот клон идентифицируют как клон, содержащийИЛкДНК (Е. со 11. Х 1776/р 3-16, АТ 11995 (ГЕЖ-ВР). Таким образом,ДНК-плазмида рЗдействительно содержит ДНК (ген ИЛ), способную образовывать специальный гибрид с ИП иРНК.кДНК-вставка плазмиды рЗобладает такими свойствами, которые псз -воляют рассекать ее Ферментом сеченияХЬа 1 в единственном сайте, а ферментом Вв 1 И 1 - в двух сайтах (вверх ивниз от сайта сечения ХЬа). Однакоплазмида рЗсодержит кДНК-вставку,состоящую из примерно 650 пар оснований, которая соответствует частиИЛиРНК с 11-12 С,Поэтому получают другую кДНК-библиотеку, используя ИЛиРНК в качестве шаблона, Однонитевую кДНК(дГ) ,в в качестве затравки дйяДНК-полимеразы 1 (Фрагмента Кленова),кНДНК (0,6 мкг), по длине превышающую маркер размера ДНК в 680 пар оснований, получают с помощью центрифугирования градиентом сахарозы ивставляют в сайт РвплазмидырВК 322 с помощью стандартного методаотсечения С-С-концов, После трансформации Е. со 11 Х 1776 с помощью рекомбинантной ДНК отбирают приблизительно 2000 колоний с помощью методагибридизации на месте с транслированньии концами вставки кДНК р 3-16 в качестве зонда, выявляют колонию, со 1479005держащую плазмиду р 1 ь 2-50 А, размером 850 пар оснований (Е. со 1 дХ 1776/р 1 Ы 2-50 А, АьЬ 11996 (РЕВИ-ВР 226),Чтобы изолировать ген, кодирующийИЛ-пептид, из трансформированнойкультуры Е. со 11 Х 1776 р 1 ьг,2-50 А,ДНК-плазмиды обрабатывают с ферментом рестрикции Ряй 1, выделяют фрагменты ДНК из клеток известными методами. Получающийся таким образомфрагмент меньших размеров среди двухфрагментов ДНК является геном ДНК,кодирующим ИЛ-пептид.П р и м е р 2. Плазмида рКСКсостоит из сегментов ДНК вирусаЯЧ 40, содержащих промотор исходногогена, начало репликации (0,7250,648 м.е.), сайт нолиаденилированияиз исходного гена (0,169-0,144 м.е.,части гена -глобина кролика (фрагмент ВашН 1-РЧ 11),сегмента из рВБ 322(фрагмент ЕсоК 1-ВатН 1),содержащего начало репликации и ген стойкости кампициллину. Эту плазмиду рассекаютс помощью ВашН 1 и после заполненияобоих концов рассеченной ДНК ДНК-полимеразой 1 (Фрагмент Кленова) вводятсинтетическую ДНК линкера РяС 1 стем, чтобы закончить построение рКСК(Ряй 1). Ппазмиду рКСР. (Ряй 1) рассекают ферментом Яа 11, обрабатываютфрагментом Кленова с целью заполненияконцов, а затем частично рассекаютферментом ЕсоК 1 с тем, чтобы получитьфрагмент ЕсоК 1-Яа 11, который содержит всю ДНК, полученную из вирусаЯЧ 40, и ген глобина. Этот фрагментзатем подвергают лигации с .кускомрВК 328 ДНК, который содержит генстойкости к тетрациклину и началорепликации. Полученная в результатеплазмида рСЕсодержит единственныйсайт РяС 1 в направлении вниз сразупосле полученного ранее промотораЯЧ 40.Вставку кДНК-плазмиды р 1 Ы 2-50 Аотсекают путем рассечения ферментомРя 1 1 и подвергают лигации с рСЕ,рассеченным РяС 1, с целью построениярСЕ 1 о, в котором экспрессия структурного гена ИЛдолжна осуществляться под контролем ранее вставленного промотора ЯЧ 40, Плазмида рСЕ ранее строилась для клонированиякДНК методом Г-С-концов в бактериии прямой экспрессии в клетках млекопитающего, 35 40 45 50 дые 24 ч 500 мл среды заменяют свежей средой, Каждую порцию среды, собранную в определенный момент времеони, хранят при 4 С до использования. Спустя 2-3 дня после трансфекции культуральную среду анализируют на активность ИЛчеловека,Как показано в табл. 1, получен ный в результате верхний слой культуры клеток СОЯпосле трансфекции с использованием рСЕ 1 ю-,2, обладает активностью ИЛ. Однако в культуральной среде клеток после трансфекции с использованием рСЕактивности ИЛне обнаружено.Активность ИЛ, обнаруженная в культуральной среде клеток после трансфекции клетки СОЯс помощью рСЕ 1 Ы, нейтрализует с помощью моноклонального анти-ИЛчеловека антитела мыши (ВА 1.В/с). Тот Факт, что СОЯклетки после трансфекции с использованием рСЕ 1 осекретируют ИЛчеловека, показывает, что эукариотические клетки, трансформированныерекомбинантной ДНК, содержащей ген,Эту плазмиду обрабатывют ири помощи НЬа 1, а затем вводят с помощьюДНК-трансфекции в линию СОЯтранс"Формированных клеток обезьяны, которая позволяет осуществить репликациюДНК, содержащей начальные последов- тельности вируса ЯЧ 40,Важным этапом является обработкаО плазмиды с помощью Нйа 1 перед трансфекцией для повышения эффективностиэкспрессии кДНК, так как последовательности, которые могли бы препятствовать репликации ДНК после трансфек 5 ции в СОЯ клетки, удаляют из существенной части плазмиды для экспрессиикДНК. Клетки СОЯ(6 х 10 /мл) суспендируют в 0,5 мл ДИЕМ, содержащего57 Р 1 Я, которые находятся на пластине20 для культивирования с 24 углублениями (типа Нунк), и инкубируют в тече-ние 4 ч при 37 С. Затем смесь 1 мкгописанного выше вектора, 17,6 мкл1 мИ трис-НС 1, содержащего 0,1 ммоль25 ЭДТК, 2,4 мкл 2 И СаС 1 и 120 мкл 2 хх НВЯ, содержащего 50 ммоль Разрез,280 ммоль ИаС 1 и 1,5 ммоль ИаНРО хх 12 Н О (рН 7,10), добавляют в культивируемые клетки, которые инкубируют1о30 в течение 4 ч при 37 С. Культуральная среда обезвоживается. Затем клетки промывают 1 мл РВЯ и культивируют, в 1 мл ДИЕМ, содержащем 5 Е РСЯ, Каж 11 14кодирующий полипептид ИЛ, и векторДНК, способный к релликации в указанных клетках, может быть использовандля получения ИЛ,П р и м е р 3, ЕзсЬег 1 сМа со 11Х 1776/рТЫ 2-50 А, АТ 11996/РЕКМ-ВР 226 прививают в 250 мл Л-бульона, содержащего 100 мкг/мл диаминопимелиновой кислоты, 50 мкг/мл тимидина, 1 триптофана, 0,5 экстрактов дрожжей,0,5 ИаС 1 и 0,1 . глюкозы, и культивируют при встряхивании и температуре37 С до достижения оптической плотности в области 562 нм культуральнойсредой 0,5После завершения культивирования культуральную среду выдерживают при 0 С в течение 30 мин иклетки собирают с помощью центрифугирования, промывают один раэ20 ммоль трис-НС 1 при содержанииЗО.ммоль ИаС 1 и вновь суспендируют в1, 8 мл того же буфера, Раствор, со 1держащий 0,2 мкл лизоцима (10 мг/мл)и 20 мл 0,5 М ЭДТК, добавляют в,- оклетки и смесь выдерживают при 0 Св течение 20 мин, а затем заморажийают - размораживают 3 раза последовательно, Далее экстракты клеток(1,5 мл) получают после центрифугирования со скоростью 40 000 об/мин втечение 30 мин, Экстракт подвергаютвысаливанию с помощью 85 -ного раствора сульфата аммония, пропускаютчерез "Сефадекс С" с целью удаления солей, затем помещают на колонкухроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе ифракцию, элюированную с помощью0,06 М буфера трис-НС 1 (рН 7,6), собирают. Собранную таким образом фракцию сушат вымораживанием и помещаютна стеклянные шарики с определеннымаразмером пор 250 А, содержащемся вколонне для хроматографии, для анализа активности ИЛв элюенте с использованием 0,3 М буфера глицин-НС 1.фракция, содержащая ИЛ, обладаетактивностью ИЛ12 ед./мл. Полученные результаты указывают на то, чтоЕ.Со 1 ь Х 1776/р 1 Ы 2-50 А, АТ 11 996,цействительно производит ИЛ.П р и м е р 4. Конститутивнуюлинию клеток-производителей ИЛтипа Т-А 1886 (АТСС СК 1, 8130) выращивают аналогичным образом в роликовойколбе для культуры. Выращенные клетки суспендируют в свежую синтетическую среду К 1 ТС-9 при начальнойбплотности клеток 1 х 10 кл,/мл и спус 79005 12 5 10 15 2025ЗО 35 ао 45 50 55 тя 8 ч после начала культивирования клетки используют для экстрагирования ИЛиРНК в виде фракции 11 - 12 С,Синтезируют двунитевую кДНК, а кДНК длиной, превыаающей 600 пар оснований (2,4 мкг), получают после фракционирования с использованием градиента плотности сахарозы, кДНК затем удлиняют с помощью дЦМФ-остатков с использованием терминальной деоксинуклеотидилтрансферазы (50 нг), ее подвергают ренатурации с 250 мг плазмиды рВК 322, удлиненной с помощью дГМФ и рассеченной с помощью Рзг 1, Полученные в результате гибридные плазмиды используют для трансформации Е, со 1 Х 1776, в результате чего получают примерно 4000 трансформированных клонов. Отбирают три клона, комплементарных с кДНК плазмидыр 3-16, которая используется в качестве зонда.П р и м е р 5. Плазмиду, которая кодирует синтез ИЛчеловека в кишечной палочке Е. со 1 х, строят следующим образом. Плазмиду рТТ Ы 2-22строят из рТг Я-З и р 1 Ы 2-50 А, содержащей кДНК ИЛ. Плазмида рТг Я-Зсодержит вставку области промотора Тгр и Шайи Далгарно (ЯЬпе Ва 18 агпо - ЯР) между сайтом ЕсоК 1 и сайтом С 1 а 1 плазмиды рВК 322. Кроме того, эта плазмида содержит кодон АТС в 13 п.о. расположенный вниз от ЯР-последовательности, а также единственный сайт ЯрЬ . Этот вектор является эффективным для продуцирования указанного протеина, если ДНК-последовательность, соответствующую указанному протеину, вставляют в область, расположенную в направлении вниз сразу же после кодона АТС, которая образуется в результате ЯрЫ ферментации и последующей обработки при помощи ДНК - полимеразы Т 4 плазмиды рТг Я-З, Плазмиду рТг Я-З (30 мкг) рассекают ферментом сечения ЯрЬ 1 известными методами и после серии обработок фенолом и хлороформом этаноловые осадки извлекают, затем оба конца снабжают "наплывом" путем обработки ДНК-полимеразой Т 4. Далее ДНК (21,4 мкг) извлекают путем аналогичной обработки фенолом, хлорофор мом и осаждения этанолом, С другой стороны, 380 мкг плазмиды р 1 Ы 2-50 А, содержащей кДНК ИЛ, рассекают с помощью фермента Рзг 1 и ИЛкДНК- вставку изолируют с помощью электро 13 1 47 905фореза на агаровом геле. кДНК-вставку (11 мкг) рассекают с помощью НягАТ, обрабатывают с помощью ДНК-полимеразы Т 4 и 10 мкг ДНК больших размеров изолируют с помощью электрофореза на агаровом геле. Получают кДНК(7,2 мкг), содержащую информацию относительно синтеза 132 аминокислот,причем этот фрагмент ДНК имеет тупыеконцы,Затем полученный таким образомфрагмент кДНК сшивают с векторомрТг Б-З, предварительно подвергнутьмферментации с использованием Бр 1 1 иобработанным ДНК-полимеразой Т 4, вточке, расположенной в направлениивниз сразу после АТС-последовательности. Сшитую таким образом плазмидузатем используют для трансформацииклеток Е. со 1 г НВТ 01 известными методами.Сшивку осуществляют следующим образом. Более длинный фрагмент кДНКИЛ(0,4 мкг) и 0,2 мкг ДНК векторарТг Б-З смешивают с 0,8 ед. ДНК-лигазы Т 4 в 66 ммоль трис-НС 1 при рН 7,5при содержании 6,6 ммоль М 8 С 11 ммоль АТФ и 1 О ммоль ДТТ, Смесидают возможность взаимодействоватьпри 4 С в течение ночи. Среди трансформированной культуры, образующейся на агаровой пластине с Л-бульоном, содержащим ампициллин, отбирают коло - нии, содержащие порцию ИЛкДНК, которая включает информацию относительно 132 аминокислот, Такую селекцию осуществляют на месте аналитическим методом гибридизации колоний. Выбранныетаким образом колонии культивируют(10 мл), чтобы получить ДНК-плазмидыв результате обработки лизоцимом и замораживания-размораживания, ДНК- плазмиды рассекают с помощью Рзс 1и ХЬа 1 и полученные,в результате продукты подвергают анализу с помощьюэлектрофореза на агаровом геле, чтобыидентифицировать рТТ ы, 2-22, в кото, ром кДНК сшита с АТС в последовательностью плазмиды рТг Б-З с правильной ориентацией. Е. со 1. НВ 1 ОТ, содержащую рТТ Ы.2-22, выращивают при стандартных условиях, которые используютдля размножения микроорганизмов, Клетки выращивают в 1 О мл Х в бульо (2,57. бактотриптона, 1,0% экстрактов дрожжей, О, 1% глюка зы, 20 ммоль М 8804, 50 ммоль трис - НС 1, рН 7,5), содержащего 25 мкг/мл стрептомицина и 25 мкг ампициллина при 37 С в тенекние ночи,Суспензию объемом 1 мл культурыпрививают на том же бульоне (100 мл)и куль тивиров ание осущес твляю т и ри37 С, Когда оптическая плс тность достигает примерно 1,5-2,0, добавляют3-индолакриловую кислоту (ИАК), Спу 10 стя 3 ч после добавления пндуктораклетки собирают, промывают 20 ммольтрис-НС 1 (рН 7,5 30 ммоль 11 аС 1) ивновь суспендируют в 8 мл того же буфера. Для эффективного фунхциониро 15 вания промотора Тгр такой индуктор,как ИАК, добавляют так, чтобы егоконечная концентрация составила50 мкг/мл. Полученнье таким образомв бактериальных клетках протеины экс 20 трагируют в результате обработки ультразвуком (ОС, 2 мин) или в результате ферментации лизоцюол 8 мкг/л(О С, 20 мин) и осуществляют триждыпоследовательно замораживание-размораживание. В соответствии с этимипроцедурами ИЛв общем случае экстрагируется из организмов, Активностьэкстрагированного ИЛизменяется вобласти 10000 - 120000 ед./мл.30 П р и м е р 6, Плазмиду рТПТфГ,2-22, несущую ИЛкДНК, строят изрТПВТРи рТТ Ы,2-22, Плазмида рТрТУВТРвключает вставку промоторнойпоследовательности гВ в рВК 322.Кроме того, плазмида содержит единственный сайт СТа 1, и он расположенвниз на 2 п,о, от БО-последовательности. Так как рТг Б-З кроме того, содержит сайт С 1 а 1 между БЭ-последова 40 тельностью и кодономАТС инициирования и так как этот сайт С 1 а 1 не разрушается в процессе конструкции плазмиды экспрессии с использованием рТгБ-З и кДНК ИЛ, бактериальньп про 45 мотор Ггр просто заменить промоторомгГВ так, что ИЛкДНК подвергаетсяэкспрессии при управлении промоторомг 1 В.Поэтому плазмиду рТ 1,2-22 (30 мкг)50 рассекают ферментами рестрикции С 1 аТи Р 7 П 11 с использованием стандартныхпроцедур. Фрагмент (2,2 1 Ь), содержащий кДНК ИЛ, изолируют и подвергают очистке с помощью электрофореза55 на агаровом геле, в результате чегополучают 3 мкг ДНК. С другой стороны,20 мкг вектора рТ 1)ВТРрассекаютаналогичным образом с помощью С 1 а 1 иРЧ 11 111 и больший фрагмент (3,4 1 сЬ).1479005 16 15содержащий ген стойкости к ампициллину, изолируют и подвергают очистке с помощью электрофореза на агаровом геле, чтобы извлечь 3, 5 мкг ДНК.5Затем полученные таким образом два фрагмента, один из которых (3,4 1 Ь) содержит промотор СОЧВ, а другой (2, 2 ЕЬ) - кДНК ИЛ, подвергают лигации, которую осуществляют следую щим образом. Фрагмент, содержащий кДНК ИЛ(1,2 мкг) и 0,3 мкг фрагмента, содержащего промотор гцГВ, смешивают с 0,8 ед. ДНК-лигазы Т 4 в 66 ммоль трис-НС 1 (рН 7,5) при со держании 6,6 ммоль Г 18 СТ, 1 ммоль АТФ и 10 ммоль ДТТ, и смеси дают воэможность взаимодействовать прио4 С в течение ночи, Эту плазмиду после лигации используют для транс п формации кишечной палочки. Е. со 1 НВ 101 в соответствии со стандартными процедурами. Среди трансформированных клеток, образующихся на агаровой пластинке с Л-бульоном, содер жащим ампициллин, отбирают восемь колоний, содержащих порцию кДНК ИЛтакую, как рТБТЫ 2-22 и получают ДНК. плазмиды. Клетки Е. со 11 НВТОТ, со:держащие рТУТ Ы,2-22, культивируют в З 0 Л-бульоне (100 мл) при 37 С. Когда оптическая плотность в области 650 им достигает примерно 0,5-.1,0 бактериальные клетки собирают, промывают 20 ммоль трис-НС 1 (рН 7,5; 30 ммоль ЮаСТ) и вновь суспендируют в 2 мл того же буфера. Полученные таким образом протеины экстрагируют. Активность экстрагированного ИЛизменяется в области 6000 - 56000 ед/мл.П р и м е р 7. Плазмиду рС 1 2-22, несущую кДНК ИЛ, строят из рСсй 01 и Т 1 о(2-22.Плазмиду рСо 101 (20 мкг), содержащую промотор 1 ас, рассекают фер ментом сечения Р 711 11 стандартным методом, чтобы получить 17 мкг ДНК путем последовательной обработки фенолом, хлороформом и осаждения этанолом. С другой стороны, рТТо 2-22 50 (75 мкг) рассекают с помощью С 1 а 1 и Яа 11,с тем, чтобы извлечь 2,2 мкг фрагмента ДНК, содержащего кДНК ИЛс помощью электрофореза на агаровом геле. Этот фрагмент снабжают "наплывом" путем обработки ДНК-полимеразой 1 (фрагмент Кленова), затем полученные таким образом два фрагмента (0,25 мкг и 0,66 мкг) подвергают лигации с 1,0 ед. ДНК-лигазы Т 4. Полученную таким образом после лигацииплазмиду затем используют для трансформации клеток Е, со 1 д НВ 101 постандартной методике.Среди трансформированных клетокотбирают клетки, содержащие вставкуфрагмента С 1 а 1 - Яа 11, включающегокДНК 1.Л. Эти трансформированныеклетки затем культивируют в Х"бульоне (10 мл), содержащем 26 мкг/мл ампициллина, получают ДНК-плазмицы,ДНК-плазмиду, содержащую последовательность АТС инициирования кДНК ИЛ в направлении вниз сразу же послепромотора 1 ас, получают путем рассечения с использованием ферментов:Рвг 1 и ХЬа 1.Полученную таким образом плазмидурС 1 ь 2-22 помещают в 100 мл Л-бульона, содержащего 25 мкг/мл ампициллина и 25 мкг/мл стрептомицина, и затемкультивируют. Когда оптическая плотность в области 650 нм достигает примерно 0,5, добавляют изопропил-В-тиогалактопираноэид (ИПТГ) концентрации 1 мМ, а спустя 1 ч бактериальные клетки собирают. Активность экстрагированного ИПизменяется в области 6000 - 80000 ед./мл,П р и м е р 8. Плаэмиду рТг Я-З(10 мкг) сначала рассекают ферментомрасщепления ЯаТТ и сайт Яа 11 снабжают "наплывом" путем обработки ДНКполимеразой (фрагмент Кленова) илиДНК-полимеразой Т 4, После рассеченияферментом С 1 а 1 больший фрагмент, софдержащий область промотора Ггр, изолируют с помощью электрофореза наагаровом геле с использованием стандартных методов, в результате чегополучают 3 мкг ДНК,11 мкг кДНК-вставки, полученнойв результате сечения ферментом Рвг Тплаэмиды рТс,2-50 А, рассекают с помощью Н 8 д А 1, обрабатывают ДНК-полимеразой Т 4 и больший фрагмент изолируют и подвергают очистке с помощьюэлектрофореза на агаровом геле, Таким образом, фрагмент кДНК, содержащий информацию о 132 аминокислотахИЛ, получают в количестве 7,2 мкг.Затем 0,45 мкг фрагмента, содержащего промотор гр, 0,5 мкг фрагментаН 8 дАТ-Рвг. 1, содержащего кДНК ИЛисинтетические олигонуклеотиды (5)СС79005 18Л-бульоне при 37 С, чтобы получить сосоответствующие рекомбинантные ДНК втрансформированных клетках, и отделения штаммов, которые становятся чувствительными к тетрациклину и ампициллину, в качестве клеток-хозяев. 17 14 каждый из которых фосфорилирован в5 -терминале, подвергают лигации с 1 ед. ДНК-лигазы Т 4.Полученную таким образом после лигации плазмиду затем используют для трансформации клеток Е, со 1 НВ 101. Среди образующихся трансформированных клеток искомые трансформированные клетки отбирают следующим образом.Сначала отбирают в качестве кандидатов трансформированные клетки, способные к гибридизации как с кДНК ИЛтак и с синтетическими олигонуклеотидами (эту процедуру осуществляют с использованием метода гибридизации колонии). Затем с помощью сечения ферментами РзС 1, ХЬа 1 отбирают трансформированные клетки, содержащие вставку фрагмента ДНК, начинающегося с ССТ-последовательности в позиции с 111 по 113 ССТАСТ - в направлении вниз сразу же после АТ СС СА-последовательности.Трансформированные клетки после селекции культивируют Л-бульоне, при этом высокую активность ИЛустанавливают в экстрактах клеток.Результаты исследований приведены в табл, 2 и 3.Клетки-хозяева Е. со 1 1776 и НВ 101, которые использовались, получены из сданных на хранение трансформированных клеток с помощью культивирования трансформированных клеток в Та бл ица 1 25 Рост Тлимфоцитов ДНК, при помощи которой осущест вляется транс 30 фекция Активность 1 Л, изме ренная с омошью по глощения Н-ТИР, ед./мл р СЕ 1 ы.-2рСЕ12 1(верхний слой культуры необработанных яйцеклеток)Продукт трансплантации фракцииКонтрольная 1 (среда для анализа)Контрольная 11(верхний слой необработанной культуры яйце- клеток)Продукт трансплантации фракции 13 Формула изобретения10 Способ получения интерлейкина человека, предусматривающий культивирование клеток в среде с последующимвыделением и очисткой полученного .15 продукта, о т л и ч а ю щ и й с ятем, что, с целью повышения выходаинтерлейнина, штамм бактернальныхклеток Езсйетдсйда со 11 трансформируют рекомбинантной плазмидной ДНК 2 О рТ 1 ос,2-22 или рТБ 1 сС 2-27 или рС 1042-22, или рТ 1 Ы, 2-21 а, или рТ 1 о 2-21 Ь,содержащей вставку, кодирующую интерлейкин,