Рекомбинантная плазмидная днк 24, кодирующая синтез рестриктазы и метилазы s 11 и штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент рестриктазы и метилазы s 11

)5 С 12 Н 15/00 САНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ ЕЛЬСТВ НАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК .СИНТЕЗ РЕСТРИКТАЗЫИ ШТАММ БАКТЕРИЙ- ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИК(54) РЕКОМБИНАНТ Й 24, КОДИРУЮЩАЯ И МЕТИЛАЗЫ Яяо 11 ЕЯСНЕК 1 СН 1 А СО 1 1 ТАЗЫ И МЕТИЛАЗЫ Яяо 11. (57) Изобретение относи нологии, в частности к инженерии, и представля комбинантную плазмидную ливающую синтез рестрик тилазы Яяо 11 и штамм, эту рекомбинантную ДНК рестриктазы и метилазы изобретения - увеличени теза рестриктазы и мет ся к биотех Изобретениес продукциейЯяо 11 - 3500сырой биомас воляет стрикта и 40000 соответс является уве иктазы и мет лью изобрете е синтеза р о 11. ениЯя Пос лич ла достигается ммом Е.со 11 ая цел авлой и ш плазмидВ 834,Пла лазмидурующая11, сос одер щим э24,стиктазу иследующ плазмид етилазу Я х элемент ора рПС 19 раз ная ДН тпо; ная ДН. яоппед 47., метилазу тпо.риктазы и ансформацизмьщой й 24 4 и ирующая 11, раз Штамм -рестриктазу и ер которой 4, продуцент ресо 11 получен т .со 1 В 834 пл илазыклеток ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИПРИ ГКНТ СССР АВТОРСКОМУ СВИ 1(71) Научно-исследовательский институт медицинской энзимологии АМН СССР и Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова(53) 577.224.2.757.2(088.8) (56) Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1 987, т.1 2, с.26-29Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинатную плазмидную ДНК, обуславливающую синтез рестриктазы и метилазы Яео 11 и штамм, содержащий эту рекомбинантнун 1 ДНК - продуцент рестриктазы и метилазы Яяо 11,Рестриктаза и метилаза Яяо 11 узнает 5-членную вырожденнун 1 последова-.тельность ССЖС, гидролизует ДНК собразованием 5-членных липких концов,обеспечивая высокую эффективностьпри лигировании, и метилирует центральный цитозин в последовательностиузнавания ССИСС, образуя модифицированное основание 5-метилцитозин. генетической ет собой ре- ДНК, обусла тазы и месодержащий - продуцент Яяо 11. Цель е уровня син илазы Яяо 11.олучить штамми метилазы ед.на 1 г твенно. таблСодержание рестриктазы Бяо 11 в сконструированном штамме равно 350000 ед. /гбиомассы клеток, метилазы 400000 ед,П р и м е р 1, Плазмидную ДНК иэштамма Е. со 1 д Х 813, содержащего двеплаэмиды; Р 4 и Р 9, выделяют щелочнымметодом. Отделение ДНК плазмиды Р 4 отвысокомолекулярной ДНК Р 9 проводятметодом колоночной хроматографии на 1 ОДЕАЕ-целлюлозе.Полученный препарат плазмиды Р 4 ипрепарат вектора рПС 19 используют дляконструирования плазмиды й 24, котороепроводят следующим образом, 150,5 мкг ДНК вектора р 11 С 19 инкубируют с эндонуклеазой рестрикцииБа 1 С 1 (5 ед.) в буфере,А .(100 мМНаС 1, 50 мМ трис-НС 1, рН 7,5; 10 мММяС 1, 1 мМ дитиотрейтол), 5 мкг 20,плазмиды Р 4 инкубируют с рестриктазой Ба 101 (10 ед.) в буфере А,Реакции проводят при 37 С 1 ч. После инкубации пробы прогревают при 65 С15 мин. Анализ полноты гидролиза проводят с помощью электрофореэа,Соединение ДНК плазмиды и векторапроводят в буфере: 0,05 М трис-НС 1,рН 7,4; 0,01 М МяС 1, 1 мМ дитиотрейтол; 0,1 мМ АТф с добавлением ДНК.- 30лигазы фага Т 4 (1000 ед/мл) иэ расчета 0,5 мкл Фермента на 5 мкг ДНКв течение 12 ч при 1 О С. 50 35Полученную смесь соединенных фрагментов используют при трансформации клеток Е,со 1 д РБ 200. Трансформацию проводят следующим образом, 50 мкл суспенэии клеток Е.со 11 Р 8200 вносят в 20 мкл жидкой питательной среды 1,В и выращивают при 37 С до титра 7 х 10 кл/мл. Клетки охлаждают во льду 1 О мин и центрифугируют при 5000 е в течение 10-15 мин при 4 С, затем тща тельно сливают супернатант. осадок суспендируют в 0,5 мл 0,1 М СаС 1. Клетки выдерживают во льду 10-12 ч, после чего используют для трансформа. - ции.На 200 мкл суспендированных клеток Е.со 11 РБ 200 берут менее 20 мкл соединенных Фрагментов ДНК и инкубируют 40 мин во льду, затем в течение 90 с при 42 С и опять 2 мин во льду,55 добавляют 1,8 мл бульона ЬВ и инкубируют 1 ч при 37 С. Затем 2 мл суспензии трансформированных клегок центрифугируют в течение 3 с в центрифуге "Эппендорф" при комнатной температуре и ресуспендируют в 100 мкл1.В с 0,01 М МАМБО, В пробу добавляют100 мкл суспензни фага Д Ь 221 с титром 2,5 10и инкубируют в течение20 мин при 37 С, Затем клетки высевают на чашки с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл.Из клеток клонов, выросших начашках с ампициллином, выделяют плазмидную ДНК, обозначенную й 24 и содержащую в своем составе вектор рУС 19,несущий ген В 1 а, определявший устойчивость к ампициллину, и плаэмиднуюДНК Р 4, несущую гены рестриктазы иметилаэы Бво 11. Выделенную плазмидную ДНК й 24 подвергают рестрикционному анализу.П р и м е р 2, Определение присутствия рестриктазы и метилазы Бзо 11в штамме Е,со 1 ь Р 8200, содержащемплазмиду й 24.0,1 г биомассы Е.со 1 д Р 8200, содержащей плазмиду й 24, суспендируютв 170 мкл 0,01 мМ ИМС 1, инкубируютпри покачивании 2 ч при 4 С, центрифугируют при 10000 я 15 мин, затем 1 О мкл супернатанта добавляют впробу, содержащую 1 мкг бактериофага 3 в 10 мкл буфера А. Пробу инкубируют 1 ч при 37 С, после чегоанализируют электрофорезом в 1,2 Еном агарозном геле. Картина рестрикции в случае штамма Е, со 1 Р 8200,несущего плазмиду с 1 24, характерназля рестриктазы Бзо 11.1 мкг плазмидной ДНК й 24, выделенной из штамма Е.со 1 Р 8200, обрабатывают 1 О ед. рестриктирующей эндонуклеазы Бво 11 в буфере А в течение 2 ч при 37 С. Электрофорез показывает, что ДНК плазмиды й 24 при такой обработке не фрагментируется, вто время как плаэмида р 11 С 19 даеткартину гидролиза, типичную для плазмиды рЦС 19, обработанной рестриктаэой Бво 11. Эти данные свидетельствуют о защите мест узнавания рестриктазы Бзо 11 в й 24 метилированием.Определение эффективности посевабактериофага В Ь 221 на клетках штаммов, синтезирующих рестриктазу иметилазу Бзо 11, проводят следующимобразом,Штамм Е,со 1 д РБ 200, несущий плазмиду й 24, определяющую синтез рестриктазы и метилазы Бзо 11, снижаетэффективность посева бактериофагаАЬ 221 на 5 порядков по сравнению сэффективностью посева на нетрансформированном штамме Е,со 1 д РБ 200. После пассажа на клетках штамма Е.со 1РБ 200, трансформированных плазмидойд 24, фаг Э.Ь 221 высевали на клетках штамма Е.со 1 РБ 200, несущиеплазмиду й 24 и штамма Е.со 1 Х 813,синтезирующих рестриктазу и метилазу 1 ОБяо 11. Снижения эффективности посевапри этом не происходило, что свидетельствует о модификации ДНК фага3 Ъ 221, происходящей в клетках Е.со 11РБ 200, трансформированных плазмидой 15й 24.П р и м е р 3. Плазмиду й 24трансформируют в штамме Е.со 1 д В 834по методу, описанному в примере 1, иполучают штамм - продуцент рестриктазы 20и метилазы бяо 11.Штамм ЕясЬег 1 сЬа со 11 В 834, несущий плазмиду й 24 - продуцент рестриктазы и метилазы Бяо 11, характеризуется следующими признаками,Культурально-морФологические. Клетки прямые, палочковидные, неподвижные,граматрицательные, лактозопозитивные.При рассеве на чашки с 1,37-ным МПАрост в виде отдельных колоний, иногда в К"форме с неровными краями. Хорошо растет на плотных и жидких питательных средах (МРА, МПБ, ЬВ-бульон и ЬВ-агар).физиолого-биохимические. Клеткирастут в пределах 4-45 С при оптимуме рН 6,8-7,5. Штамм разлагает глюкозу, лактозу, маннит с образованнемкислоты, не разлагает сахарозу, сбраживает мальтозу, ксилозу, сорбит, 40дульцит, рамнозу, образует индол исероводород, проявляет устойчивостьк ампициллину (до 100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды 4 24.П р и м е р 4. Культуру клеток 45Е.со 1 д В 834, несущих плазмиду й 24,выращивают в 1 л среды ЬВ с 50 мкг/млампициллина при 37 С до титра 4АЙ 0 ф кл/мл. Клетки осаждают центрифугированием (5000 , 1 5 мин). 50 1 г сырой биомассы суспендируют в 5 мл буфера, содержащего 50 мМ трисНС 1, рН 7,6; О, М ХаС 1; 7 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл лизоцима и выдерживают при О С 1 О мин. Клетки разрушают ультразвуком. Экстракт поо лучают центрифугпрованием при 2 С (48000) в течениеч,Активность рестриктазы Бяо 11 определяют в серийных десятикратных разведениях супернатанта, 1 мкг ДНК фага Э в 30 мкл буфера А (см.пример 1)инкубируют с 2 мкл каждого разведения. Уровень активности рестриктазыБяо 11 составляет 350000 ед.на 1 гбиомассы,Активность метилаэы определяют вреакционной смеси с общим объемом100 мкл, с-держащей 1 мкг акцепторной ДНК, 0,5 МкКи ЗН-Б-аденозилметионина и 5 мкл каждого из десятикрат.ных разведений супернатанта. Инкубацию проводят в течение различныхвременных промежутков от 1 до 24 чпри 37 С. Пробы наносят на фильтрыСР/С, осаждают 57.-ной трихлоруксусной кислотой, отмывают 70 Х-ным этанолом, высушивают и просчитывают радиоактивность в толуоловом сцинтилляторе. За единицу ферментативнойактивности принимают количество фермента, обеспечивающего полную модификацию 1 мкг акцепторной ДНК за24 ч.Уровень активности метилазы, определенный в штамме Е, со 1 д В 834, несущим плазмиду й 24, соответствует400000 ед. на 1 г биомассы.В таблице приведены значения уронней синтеза рестриктаэы и метилазыБяо 11 в штаммах Е.со 1, полученныхтрансформацией плазмиды й 24,Изобретение позволяет получить уровень синтеза рестриктазы и метилазыБяо 11 в штамме, содержащем плазмидуй 24, не менее 350000 и 400000 ед. на1 г биомассы соответственно.Формула изобретения1, Рекомбинантная плазмидная ДНК й 24, кодирующая синтез рестриктазы и метилазы Бяо 11 мол.м, 4,5 МД и размером 7,1 тпо, содержащая:плазмидная ДНК вектора рПС 19 размером 2,7 тпо;плазмидная ДНК Р 4 с геном рестриктазы и метилазы БяоП размером 4,4 тпо,по одному участку расщепления эндонуклеазами Вя 111, С 1 а 1, Есор, Бас 11, РяС 1, БрЬ 1, Н 1.пй 111, Ба 61,Крп 1, Бша 1, ВашН 1, ХЬа 1;по два участка узнавания энцонуклеазами - СЕг 01, Ба 101;четыре участка расщепления ЕсоКТ;Ь 1 а ген, кодирующий 1-лактамазу;1539205 Активность, ед./г Штамм рестриктазы метилазы Е.со 11 Р 8200/й 24 10000 12000 Е.со 1 ь В 834/д 24 350000 400000 Составитель Т.ЗабойкинаРедактор Т. Лазоренко Техред М.Ходанич Корректор Л.Патай Заказ 191 Тираж 487 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открьггиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101 Фрагмент гена 1 ас, соединенный с синтетическим полилинкером, расположенный по обе стороны клонированной ДНК плазмиды Р 4;гены рестриктазы и метилазы Бзо 11, расположенные на клонированной ДИК плазмиды Р 4, фланкированной сайтами Ба 161, детерминирующие синтез рестриктазы и метилаэы 8 во 11.2. Штамм бактерий РвсЬег 1 сИа 4со 1 д ГИСК- продуцент рестриктазы и метилазы Яво 11,