Способ конструирования вектора pvm061

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКРЕСПУБЛИК ц 4 С 12 И 5/О ОИСАНИ БРЕТЕН К ПАТЕНТ П Изобретение биотехнологии,ческой инженери руирования плаз выражения экзог формированных шносится к облас р Б С 10единицамиЕсо 81 вдержащей75 ммоль/6 ммоль/л100 мкг/млбумина (Б лу- уемоЦелью изобретениение авторегулируе вля етсяо стимул го вектора.Функционал вектора состо генг Е.со 11, промотора - 1 ас мента ДНК для в течен самолегир таиной Е о о ную щелочИогЬпЕпродолжаю раг со ас 1ржит целыи еакцию з Е. со 11, а цел ся в трансфор жает ракциеи,ляют этан е-. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР(71) Дзе Рисерч Фаундейшн оф СтейтЮниверсити оф Нью-Йорк (ПБ)(72) Масаери Иноуйе, Кензо Накамураи Есихиро Масуи (1 Р)(54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ВЕКТОРАрЧМ 061 частности к генетии касается констидного вектора для нных генов в трансаммах бактерий Е.со 1 ьные элементы данн ят из липопротеино фрагмента стимулир -промотора Е.со 11, репрессора, котор функциональный ген евой полипептид выр мантах Е,со 11.(57) Изобретение относится к областибиотехнологии, в частности к генетической инженерии, и касается конструирования плазмидного вектора длявыражения экзогенных генов в трансформированных штаммах бактерий Е.со 11Целью изобретения является получениеавторегулируемого стимулируемого вектора. Функциональные элементы данноговектора состоят из липопротеиновогогена Е.со 11 фрагмента стимулируемогопромотора 1 ас-промотора Е.со 11, фрагмента ДНК для репрессора, которыйсодержит целый функциональный ген1 ас 1 Е.со 11, а целевой полипептидвыражается в трансформантах Е.со 11.1 табл. м е р 1. 2 мкг ДНК плазмиды переваривают до конца двумя ограничительной эндонуклеазы 50 мкл реакционной смеси, со ммоль/л трис-НС 1 (рН 7,5) л ИаС 1, 6 ммоль МС 1-меркаптоэтанола ибычьего сывороточного альо СА) буфером Есо К 1 при 37 .С 60 мин. Чтобы предотвратить ование ДНК р Б С 101, обрабо- Ь о К 1, добавляют бактериальную фосфатазу (ВАР) (0,1 ед.1 о ВАРЕ) и инкубированиеот в течение 60 мин при 37 С.аканчивают фенольнай эксти линиаризованные Д льным осаждением, 1914790042040 из меньших ограничительных фрагментовХЬа 1 - Есо К 1, предварительно полученных из рКЕИ 024 или рКЕБ 036 путемдвойного переваривания каждой плазмиды ограничительными ферментами ХЬа 15и Есо К 1 с последующей гелевой очисткой. Цепкие концы фрагментовХЬа 1 - Есо К 1 соединяют путем обработки 0;2 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 20 мкллигазного буфера, содержащего0,4 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение7 ч после чего часть легированнойсмеси используют для трансформацииштамма ТА 221 Е. со 1 х,. МККЬ В.Среди резистентных к ампициллинутрансформантов получают плазмидныеЛНК, имеющие рамки считывания АиАих обозначили рКЕИ 039 и рКЕН040 соответственно), 20Указанное представляет собой экспериментальную методику, которую используют в первом случае для конструирования плазмиды рКЕМ 039 (А) ирКЕИ 040 (А-З). 25В частности, последовательностьДНК в окрестности сайта отщепленияплазмиды рКЕИ 037 (А) изменяют,чтобы непосредственно получить структуру плазмиды рКЕМ 039 (А) или 30рКЕН 040 соответственно,Первая стадия при конструированииВ-сайтовых выражаемых плазмид заклю- .чается в конструировании плазмиды,служащей источником фрагментов липопротеинового гена и имеющей сайт.отщенления ограничительного ферментавблизи сайта отщепления сигнального пептида. Выбранный ген кодируетлипопротеин Я. щагсезсеаз и имеетпоследовательность узнавания Гптт4 Нограничительной эндонуклеаэына 3 -конце сигнального пептида,Была выбрана плазмида рВК 322 для приема липопротеинового гена 8. щагсезсепв.2 мкг ДНК-плазмиды рВК 322 переваривают до конца с двумя единицами ограничительной эндонуклеазыВащ Н 1 в 50 мкл буфера Ващ Н 1 при37 С в течение 60 мин, После дезакь,тивации фермента Ващ Н 1 посредствомнагревания при 60 С в течение 10 миндобавляют 2 ед, Есо Р 1 и 100 мкл буфера Есо К 1, Затем смесь инкубируютпри 37 С в течение 60 мин, а реакциюостанавливают фенольной экстракцией,после чего фрагменты линеаризованнойДНК выделяют этанольным осаждением,Фрагмент ДНК длиной 8, 5 тыс, оснований, содержащий липопротеиновыйген 8. щагсевсепв, выделяют отдельноиз гибридного-фага, несущего липопротеиновый ген Я, щагсезсепв (обозначенный Ъ ТррЯщ), Липопротеиновыйген предварительно клонировали в вектор т-фаг С 1 тагоп 14 следующим образом. Всю ДНК (200 мкг), выделеннуюиз 8. щагсезсепз, переваривают с200 ед. ограничительного ферментаЕсо Р.1. Фрагменты ДНК разделяют напрепаративном агарозном геле и собирают фракции фрагментов ДНК длинойпримерно 8,5 тыс, оснований, которыепроявляют положительную гибридизациюс 5 32 р липопротеиновой и-РНК в южном способе гибридизации. Смесь фрагментов Есо К 1 длиной 8,5 тыс, оснований (обогащенную примерно в двадцатьраз) и отщепленной Есо К 1 векторнойДНК Сйагоп 14 обрабатывают Т 4 ДНК-лигазой, Легированную ДИК используютдля трансформации тцтамма К 802 Е. со 1 х, МВКЬ В. Рекомбинантные фаги, несущие липопротеиновый ген,высевают способом зонной гибридизации Бентона и Дэвиса, используя5 Р-липопротеиновую и-РНК, Одну из32изученных зон, которая дала положительную гибридизацию, обозначают как1 ррЯщ,Два микрограмма ДНК 1 ррБщзатем полностью переваривают с.ограничительными ферментами Ващ Н 1. и Есо К 1таким .же образом, как и в отношениилинеаризации рВК 322, и 0,5 мкг фрагментов ДНК 1 ррБщсмешивают с0,5 мкг предварительно линеаризованной ДНК плазмиды рВК 322 в 40 мкглигазного буфера. Смесь нагреваютпри 37 С в течение 5 мин и цепкиеконцы Есо К 1 и Ващ ГТ ренатурируютинкубированием при 4 С в течение16 ч, а затем при 0 С в течение 1 ч,После добавления АТФ (конечная концентрация 0,4 ммоля/л) и 0,4 ед, Т 4ДНК-лигазы смесь инкубируют при12,5 С в течениеч,Четвертую чдсть легированной смеси используют после этого для трансформации мутантного штамма ТЕ 5527 слипопротеиновой делецией Е. со 1,НККЬ В, Трансформацию проводяти резистентные к амг;ициллину трансформанты выращивают в течение ночина фильтровальной бумаге Ватман ЗММ,помещенной на поверхность бульонасодержащего 50 мкг/мп ампициллина,и отбирают липопротеиновые клоны путем гибридизации колоний. ФрагментМзр 1 длиной 0,95 тыс, оснований1 рр Ес, содержащий липопротеиновыйгеп, подвергают меченной трансляциис (Ыр) йАТР и (о(;32 р) ИСТР и егоиспользуют в качестве р-зонда, Былополучено, что один из трансформантов,который дает положительную гибридидацию, содержал плазмиду (эту плазмиду обозначают рКЕ 14 221).Чтобы сконструировать В-сайтовыеклонируемые вектор-носители, Фрагмент Гпц 4 Ндлиной 329 пар оснований, содержащий липопротеиновый промотор и 5 -непереводимый участок,а также участок сигнального пептидалипопротеинового гена Б. шагсезсепзклонируют н рКЕИ 0,005 следуюшим образом: 80 мкг ДНК-плазмиды рКЕМ 221переваривают до конца со 100 ед. ограничительной эндонуклеазы Гпц 4 Н в 400 мкл буфера Нае 111 и фрагментГпц 4 Ндлиной 324 пары основанийочищают электрофорезом на акриламидном геле,Поскольку переваривание ограничительного фермента Гпи 4 Нприводитк образованию фрагментов с цепкимиконцами на обоих концах, эти цепкиеконцы заполняют Т 4 ДНК полимераэой,чтобы получить тупые концы, Два микрограмма очищенного фрагмента Гпц4 Ндлиной 324 пары оснований обрабатывают 3 ед. Т 4 ДНК полимеразы в20 мкл полимеразного буфера в присутствии 0,1 ммоль/л каждого изЙАТР, ЙСТР, ЙСТР и ЙТТР при 12,5 Св течение 45 мин, После фенольнойэкстракции и этанольного осажденияфрагменты ДНК смешивают с 400 пмолями фосфорилированной связки Есо К 1и обрабатывают 4 ед. Т 4 ДНК-лигазыв 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5 О С втечение 16 ч, Смесь разбавляют до300 мкл буфером Есо К 1 и переваривают с .150 ед, ограничительного фермента Есо К 1, чтобы получить цепкие концы Есо К 1.Один микрограмм обрабатываютЕсо К 1 фрагментом, затем смешиваютс 0,5 мкг обработанной Есо К 1 ДНКплазмиды рКЕМ 005 и обрабатываютсмесь 0,4 ед, Т 4 ДНК-лигазы в 40 мкллигазного буфера, содержашето0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5" С н тече 45 50 55 5 10 15 20 25 30 35 40 ние 16 ч, Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТГ 5519 Е. со 11., ЮКК 1, В, При анализе ограничительным Ферментом плазмидной ДНК, полученной из резистентных к тетрациклину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, выясняют, что плазмида несет Фрагмент Есо К 1 длиной 344 пар оснований, полученный иэ Фрагмента Гпц 4 Ндлиной 329 пар оснований (эту плазмиду обозначают рКЕМ 009). Анализ нуклеотидной последонательности ДНК-плазмиды рКЕИ 009 показывает,. что сайт Есо К 1 и рКЕМ 099 находится в В-нстаночном сайте и соответствует рамке считывания В, По причинам, которые н настоящее время не ясны, три пары оснований нставлены н участок в положении +90 (что принелок добавлению одного лишнего аминокислотного остатка в этом положении) и лишняя пара Г-Ц вставлена в положение +99, Удивительным кумулятинным эффектом этих изменений было превращение аминокислотной последовательности на участке сайта отщепления сигнального пептида из соответствующего участка липопротеинового гена Б. шагсенсепз в соответствующий участок липопротеинот ного гена Е. со 1.Чтобы сконструировать В-сайтоные выражаемые плаэмиды, соответствующие рамкам считывания Вн В-З, исключа ют один из двух сайтон отщепления Есо К 1 рКЕИ 009, Этот способ включает перенос фрагмента ХЬа 1 - Есо К 1 длиной 80 пар оснований (содержащего сигнальный пептид и часть 5 -непереводимого участка липопротеинового гена Б, тпагсезсепв) из рКЕЮ 009 в сайты ХЬа 1 - Есо К 1 рКЕХ 010,Для осуществления этого 5 мкг ДНК плазмиды рКЕН 010 сначала переваривают с 5 ед, ограничительной эндонуклеазы ХЬа 1 в 50 мкл буфера Ватп Н 1, после чего переваривают с 5 ед. ограничительного фермента Есо К 1 в 100 мкг буфера Есо К 1, Затем линеаризованную ДНК обрабатывают 5 мкг бактериальной щелочной фосфотазы н 100 мкл10 ммоль/л трис-НС 1 (рН 8,0) и 0,1 ммоль/л ЭДТА при 37 С в течение 30 мин. Плаэмидные ДНК экстрагируют фенолом и осаждают этанолом и 0,5 мкг ДНК смешивают с 0,2 мкг фрагмента ХЬа 1 - Есо К 1 длиной 80 пар основа 23147900424ний, который получили предварительно путем переваривания 50 мкг ДНК-плазмиды РКЕИ 099 ограничительными ферментами Есо К и ХЬа Т, после чего проводят электрофорез полиакриламидного геля, Смесь ДНК обрабатывают 0,4 ед, Т 4 ДНК-лигазы в 40 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммсчь/л АТФо1 при 12,5 Г в течение 16 ч. Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТЕ 5519 Е. со 1, ИКИ. В. При ограничительном Ферментативном анализе плазмидных ДНК, полученных иэ резистентных, к ампициллину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации находят, что одна плазмида содержит нужный Фрагмент ХЬа 1 - Есо КТ длиной 80 пар оснований, несущий20 участок сигнального пептида липопротеинового гена Я. шагсевсепз в рамке считывания В(эту плазмиду обозначают рКЕМ 017).Рамку считывания в В-вставочном 25 сайте в РЕЕМ 017 затем модифицируют, чтобы получить плазмиды, соответствующие рамкам считывания Ви В-З, в соответствии с описанными способами изменения рамки считывания Ана рамки считывания Аили Асоответственно, Те же способы, которые используют для получения плазмид РКЕИ 024 (А) и РКЕИ 036 (А) из плазмиды РКЕМ 030 (А), можно также испольэовать для получения плазмид РКЕИ 026 (В)и РКЕИ 037 (В) из плазмиды .рКЕИ 017 (В).Последняя стадия конструирования сайтовых векторов заключается в за мене А-сайтового фрагмента РКЕИ 037 ХЬа Т - Есо РТ одним из трех различных В-сайтовых фрагментов ХЬа 1 - Есо КТ РКЕИ 017, РКЕИ 026 и РКЕИ 027,Это нужно для того, чтобы получить В-сайтовые плазмиды с такими же последовательностями узнавания ограничительных ферментов Есо К 1, Нхпй ТТТ и Ваш НТ во вставочном сайте экзогенной ДНК, какие имеются в А-сайте плазмид, Каждый из трех В-сайтовых фрагментов, полученных из РКЕМ 017, РКЕИ 026 и РКЕИ 027, содержит последовательность ДНК, включающий сигнальный пептид, полученный из Фрагмента Епц 4 Нлипопротеинового гена Б, пигсевсепв.Для достижения этого используют такую же методику получения большего Фрагмента ХЬа 1 - Есо КТ плазмиды рКЕИ 037, Аликвоты в один микролитр водной смеси Фрагмента ДНКРКЕМ 037 смешивают ио отдельности сразличными меньшими ФрагментамиХЬа- Есо КТ (примерно О,1 мкгкаждого), предварительно полученнымииэРКЕИ 017, рКЕИ 026 и РКЕМ 027соответственно путем двойного переваривания с ограничительными ферментами ХЬа Т и Есо КТ с последующейгелевой очисткой, Каждую смесь ДНКобрабатывают 0,2 ед, Т 4 ДНК-лигазыв 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ, при 12,5 С втечение 16 ч, Десять микролитров каждой легированной смеси используютдля трансформации штамма ТА 221 Е, со 1 МНЕ В, Из резистентных кампициллину трансформаторов очищаютплазмидные ДНК, имеющие рамки считывания В, Ви В-З, и их обозначают РКЕМ 041, РКЕМ 047 и РКЕИ 048соответственно.Чтобы сконструировать С-сайтовыеклонируемые вектор-носители, фрагментБац ЗА длиной 193 пары оснований,содержащий липопротеиновый промотор и 5 -непереводимый участок, атакже участок. сигнального пептида ипервые восемь структурных кодонов липопротеинового гена Е, со 1 д, сначала клонируют в рКЕИ 005 следующим образом; 200 мкг ДНК-плазмиды рКЕМ 111,полученной обычным образом из Е. со 11 СС 620/рКЕИ 1 Т 1, ЖКТ, В, переваривают до конца с 200 ед. ограничительной эндонуклеазы Бац ЗА в400 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ммоль/л трис-НСТ (рН 7,5),10 ммоль/л МИКСТ , 60 ммоль/л МаС 1 и100 мкг/мл бычьего сывороточного альобумина, при 37 Г в течение одного часа, После окончания перевариванияпроводят Фенольную экстракцию, ДНКвыделяют этанольным осаждением и фрагмент Бац ЗА длиной 193 пары оснований очищают электрофорезом акриламидного геля,Поскольку переваривание ограничи-.тельного фермента Бац ЗА приводит кобразованию Фрагментов с цепкими концами на обоих концах, эти цепкие концы заполняют Т 4 ДНК-полимеразой, чтобы получить тупые концы. Два микрограмма очищенного Фрагмента Бац ЗАдлиной 193 пары основания обрабатывают 3 ед, Т 4 ДНК-полимеразы в 20 мкл50 полимеразного буфера в присутствии0,1 ммоль/л каждого из дАТР, ИСТР,ВСТР и ЙТТР при 12,5 С в течение45 мин. После фенольной экстракции цэтанольного осаждения фрагменты ДНК5смешивают с 400 пмолямц Аосфорилированной связки Есо К и обрабатывают4 ед. Т 4 ДНК-лигязы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/лАТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Смесьразбавляют до 300 мкл буфером Есо К 1и переваривают с 150 ед. ограничительного фермента Есо К 1, чтобы получитьцепкие концы Есо К 1, 15Один микрограмм обработанныхЕсо К 1 фрагментов затем смешивают с0,5 мкг обработанной Есо К 1 ДНК-плазмиды рКЕИ 005 и обрабатывают полученную смесь 0,4 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 2040 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч, Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТЕ 5519 Е. со 11, МКК 1. 25В, При ограничительном ферментативном анализе плазмидных ДНК,полученных из резистентных к тетрациклину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, выявляют,что одна из плазмид несет фрагментЕсо К 1, полученный из фрагмента ЯаиЗА длиной 193 пары оснований, иэтуплаэмиду обозначают рКЕИ 006, Анализнуклеотидной последовательности .ДНКплаэмиды рКЕИ 006 показал, что сайтЕсо К 1 и рКЕМ 006 находится в С-вставочном сайте и соответствует рамкесчитывания С.Чтобы сконструировать.С-сайтовые 40выражаемые плазмиды, соответствующиерамкам считывания Си С-З, сначалаисключают один из двух сайтов отщепления Есо К 1 и рКЕИ 006, Этот способсодержит перенос фрагмента ХЬа 1Есо К 1 длиной 106 пар оснований (содержащего сигнальный пептид, часть5 непереводимого участка и частьструктурной последовательности липопротеинового гена Е. со 1 д) отрКЕИ 006 в сайты ХЬа 1 - Есо К 1 ирКЕИ 010,Дпя осуществления этого 5 мкгДНК-плазмиды рКЕИ 010 переваривают с5 ед, ограичительной эндонуклеазыХЬа 1 в 50 мкл буфера Ваш Н 1, после1чего переваривают с 5 ед ограничительного фермента Есо К 1 в 100 мклбуфера Есо К 1, Затем лцнеяризованную(П 1 К обрабатывают 5 мкл бактериальнойщелочноц фосфятязы в 100 мкл10 ммоль/л трис-НС 1 (р 1 Й,Й) цо0,1 ммоль/л ЭДТЛ прц 87 Г и течение30 мцн, Плязмидные Д 11 К смешивают с0,2 мкг фрагмента ХЬа 1 - Есо К 1 длиной 106 пяр оснований, который предварительно получают путем переваривания 50 мкг ДНК-плязмиды рКЕХ 006 ограничительными ферментами Есо К 1 иХЬа 1 с последующим электрофорезомполиякрилямидного геля. Смесь ДНК обрабатывают 0,4 ед, Т 4 ДНК-лигязы в40 мкл лигазного буфера, содержащегоо0,4 ммоль/л АТФ, при 12,5 Г в течение7 ч. Двадцать микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТЕ 5519, Е. со 1, ИККЬВ. При ограничительном ферментативном анализе плазмидных ДНК, полученных из резистентных к ямпициллину трансформантов способом быстройщелочной денятуряции, находят,чтоодна плазмида содержит нужный фрагмент ХЬа 1 - Есо Р 1 длиной 106 пароснований, несущий участок сигнального пептида липопротеинового генаЕ, со 1 в рамке считывания Сц этуплазмиду обозначают рКЕИ 007,Рамку считывания в С-вставочномсайте в рКЕИ 007 изменяют, чтобы получить плазмиды, соответствующие рамкам считывания Си С-З, согласноописанным способам изменения рамкисчитывания Ана рамки считыванияАили Асоответственно,Способы, которые используют дляполучения плазмид рКЕИ 024 (А) ирКЕИ 036 (А) из плазмиды рКЕИ 030(А-), можно использовать для получения плазмид рКЕИ 046 (С) ирКЕИ 019 (С-З) из плазмиды рКЕМ 007(С).Последняя стадия конструированияС-сайтовых выражаемых плазмид заключается в использовании каждого изтрех различных фрагментов С-сяйтаХЪа 1 - Есо К 1 рКЕИ 007, рКЕИ 046и рКЕМ 019 вместо фрагмента А сайтаХЬа 1 - Есо К 1 рКЕИ 037, Это делаютдля того, чтобы С-сайтовые плазмидысодержали те же последовательностиузнавания ограничительных ферментовЕсо К 1, Ньпй 111 и Ваш Н 1, кяк и плазмиды А-сайта и В-сайта, Каждый изтрех С-сайтовых фрагментов, полученных из рКЕМ 007, рКЕИ 046 и рКЕИ 019,содержит последовательность ДНК, вклю 28147900427чающую сигнальный пептид, полученный из Бац ЗА фрагмента липопротеинового гена Е. со 1,Аликвоты в один микролитр воднойсмеси Фрагментов ДНК рКЕЯ 037 смешива 5ют по отдельности с различными меньшими Фрагментами ХЬа Т - Есо КТ (примерно 0,1 мкг каждый), предварительно полученными из рКЕИ 007, рКЕЮ 046и рКЕН 0,19 соответственно посредством двойного переваривания с ограничительными Ферментами ХЬа 1 и Есо КТс последующей гелевой очисткой, Каждую смесь ДНК обрабатывают 0,2 ед. 15Т 4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ,при 12,5 С в течение 16 ч, Десять микролитров каждой легированной смесииспользуют для трансформации штаммаТА 221 Е. со 1, ИРЛЬ В, Из резистентных к ампициллину трансформантов выделяют плазмидные ДНК, имеющие рамки считывания С, Си С-Зи их обозначают рКЕБ 042, рКЕН 043 и 25рКЕИ 044 соответственно.П р и м е р 2, Лак ич 5 промотороператор получают из плазмида рОР 2033. Лак ич 5 промотор-оператор получают из штамма Е. со 1 4288 гес 30А/рКМ 006, 1 ЖИ. В, Лак ич 5 промотор-оператор. переносят на фрагментеХЬа 1 длиной 95 пар оснований плазми-.ды рК 14 006, Плазмиду получают обычным образом из НККЬ Ви после3этого известными способами выделяют.фрагмент ХЬа 1 длиной 95 пар оснований.Лак ич 5 промотор-оператор вставляют в сайт отщепления ХЬа 1 рКЕН 037 40(в 5-непреводимый участок липопротеинового гена) следующим образом:200 мкг ДНК-плазмиды рОП 203-3 переваривают до конца с 200 ед, ограничительного фермента А 1 ц 1 в 400 мкл буфера Нхпй 111, и очищают электрофорезом полиакриламидного геля фрагментА 1 ц Т длиной 95 пар оснований, несущий участок лак ич 5 промотора и оператора, Один микрограмм фрагментаА 1 ц 1 длиной 95 пар оснований смешивают с 400 пмолями фосфорилированнойХЬа Т фосфорилированной связки (5ЦТЦТАГАГ ) и легируют тупые концы с5 ед, Т 4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/лАТФ, при 12,5 С в течение 16 ч,Легированную смесь разбавляют до.300 мкл буфером Ваш Н 1 и нагревают при 60 С в течение 1 О мин, Затем смесьобрабатывают 100 ед, ограничительногоофермента ХЪа 1 при 37 С в течение одного часа, чтобы получить цепкие концы ХЬа 1. Смесь экстрагируют фенолом,осаждают этанолом и лиофилизируют.Затем фрагменты ДНК растворяют в10 мкл воды и 0,3 мкг полученного таким образом лак-фрагмента смешивают с0,5 мкг ДНК-плазмиды рКЕИ 037, которую предварительно переваривали сограничительным Ферментом ХЬа 1.Смесь обрабатывают 0,4 ед, Т 4 ДНКлигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТЬ, при12,5 С в течение 16 ч, чтобы ренатурировать ХЬа 1 цепкие концы, посредством чего повторно циклизуютплазмиду. Десять микролитрон легированной смеси используют для трансформации Е. со 1 ТА 221/Р Тас 11,Ь В, который конструируютпутем переноса Р , Фактора от Х 90/Г 1 ас 1 ф Тас рго+./ +При ограничительном Ферментативноманализе плазмидных ДНК из резистентных к ампициллину трансформантов способом быстрой щелочной денатурациивыявляют, что одна из них содержитодну копию Фрагмента А 1 и Т длиной95 пар оснований, вставленную в сайтХЬа 1 рКЕН 037 в правильной ориентации и эту плазмиду обозначаютрКЕН 038,Чтобы упростить конструкцию, стимулируемых плазмид, содержащих В и С вставочные сайты, удаляют один из двух сайтов отщепления ХЬа Т в рКЕН 038, окружающих фрагмент лак-промотора-оператора, Сайт отщеплепия ХЬа 1, расположенный выше Фрагмента лакпромотора-оператора, исключают, Это осуществляют, используя тот Факт, что присоединение связки ХЬа Т к фрагменту лак-промотора-оператора длиной 95 пар оснований приводит к появлению нового сайта отщепления за Т только на конце лак-промотора, расположенного выше, а не ниже, Последовательность узнавания ограничительного фермента ББ Т перекрывается с аналогичной последовательностью фермента ХЬа 1. Таким образом, делеция 4-основного цепкого конца сайта отщепления ББ 1 с помощьюнуклеазы Б 1 приводит к делеции части последовательности узнавания ХЬа 1, что равносиль 1479004но эффективному исключенитп сайта отщелления ХЬа 1,Для достижения этого пять микро"граммов ДНК плазмиды рКЕИ 038 переваривают с 10 ед. ограничительной эн 5донуклеазы ЯБС 1 в 50 мкл буфераВатэт НТ и обрабатывают 500 ед, нуклеазы Я 1 в 200 мкл буфера Я 1 лри20 С в течение одного часа, Тупыеконцы соединяют путем обработки0,5 мкг обработанной Б 1 ДНК 5 ед,Т 4 ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТтэ,лри 12,5 С в течение 16 ч. 1 тять микро 15олитров легированной смеси используютдля трансформации штамма ТА 221/Р Тас 1 Г. со 1 т., ЮККЕР. В, Пот ,сле проведения ограничительного ферментативного анализа ллазмидных ДНК, 20полученных из резистентных к амлициллину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, находятплазмиду, которую обозначают рКЕИ045 (рТИА). 25Существует несколько способов конструирования рТИплазмид, соответствующих рамкам считывания А-А и А-З,Полагая доступность ллазмид рТИ Аи А-З, в одном способе вставляют 30фрагмент лак-промотора-оператора вплазмиды рКЕМ 039 и рКЕИ 040 в связи с плазмидой рКЕИ 037, В альтернативном и предпочтительном способе переносят меньшие фрагменты ХЬа Т -Есо КТ рКЕИ 039 и рКЕИ 040 в сайтХЬа 1 - Есо К 1 плазмиды рКГ;1 045,получают плазмиды рКЕ 1 э 1049 (р 10-11,А) и рКЕИ 050 (рТБ - 11, А-З),Последовательность ДНК в окрестности сайта отщепления Есо К 1 рКЕИ045 модифицируют, чтобы непосредственно получить структуру плазмид рКЕИ049 (А) или рКЕИ 050 (А-З), соответственно, Это наиболее лредлочтитель ный способ конструирования этихплазмид, поскольку для него не нужнопредварительно конструировать соответствующие структурные плазмиды,Полагая, что уже сконструированысоответствующие рТИ-Т плазмиды, каждую из них можно модифицировать, чтобы вставить фрагмент лак-лромотораоператора либо, что более предпочтительно, можно меныций ФрагментХЬа 1 - Есо К 1 рКЕ 1 э 1 045 (рТИ-ТТ,А)последовательно заменить меньшимифрагментами ХЬа 1 - Есо КТ из каждойиз структурных плазмид В-сайта и Ссайта, что дает в любом случае рТИ плаэмиды согласно таблице Плазмллы рЩ тРамка считы вания Встаяочный сайт Плазмидьф р 13-11 рКЕИ 051 рКЕИ 052 рКЕБ 053 рКЕЯ 054 рКГИ 055 рКЕЫ 056 рКЕБ 041 рКЕБ 047 рКЕ 1 э 1 048 рКГИ 042 рКЕ 11 О 43 рКЕВ О 44 Наиболее ттредпочтительно конструировать рТИвыражаемые плазмидыбез предварительного получения соответствующих рТМплазмид, В случаевставочного сайта В плазмиду рКЕИ 051(р 10-11, В) получают лз плазмидырКЕ 1 э 1 221 сначала путем перевариванияДИК плазмиды рКЕИ 221 ограничительнымферментом Гпц 4 Н, а затем путем присоединения цепких концов Есо К 1 кконцам полученного Фрагмента в соответствии с описанным способом, Полученный таким образом Фрагмент Есо К 1переваривают ограничительным ферментом ХЬа 1, расщелин фрагмент на двав сайте расщепления ХЬа 1, находящемся в 5-непереводимом участке. Очищая полученный таким образом меньший Фрагмент ХЬа 1 - Есо К 1 и используя его вместо меньшего ФрагментаХЬа 1 - Есо К 1 рКЕИ 045 (рТЯ-ТТ,А), получают Встимулируемый клонируемый вектор-носитель, Полученнуюплазмиду рКЕИ 051 (рТИ-ТТ, В)затем модифиттируют, чтобы получитьрТЯ-ТТ плазмиды, соответствующие рамкам считывания Ви В-З, рКЕЫ 052 ирКЕИ 053 соответственно,Аналогичным путем можно следоватьчтобы получить рТИплазмиды С-сайта непосредственно без первоначального конструирования соответствующихрТМ-Т.плазмид. После перевариванияДНК плазмиды рКЕ 1 э 1-111 ограничительным ферментом Яаи ЗА и присоединения цепких концов Есо К 1 к концамполученного фрагмента полученный таким образом Фрагмент Есо К 1 переваривают ограничительным Ферментом ХЬа 1,расщепив фрагмент на два в сайте тэасщепления ХЬа Т (расположенном в 5непереводимом участке). ФрагментХЬа 1 К 1, несущий участок сигнальногопептида, затем вставляют в сайтХЬа Т - Есо К 1 рКЕМ 045, получив плдзмиду рКЕБ 054 (рТН-ТТ, С).Первая стадия конструирования А выражаемой плдзмиды серии рТИ заключается в клонировании гена 1 ас 15в рВК 322, Чтобы получить это, фрагмент ДНК длиной 5,1 тыс. оснований,содержащий ген 1 ас 1, получают изплазмиды рР В 140 следующим образом:15 мкг ДНК-плдзмицы рР В 40 переваривают с 80 ед, ограничительного фермента Есо КТ в 200 мкл буфера Есо К 1при 37 С в течение 2 ч, Реакционнуюосмесь экстрагируют фенолом, фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанолаи сушат под вакуумом. Затем ЛНК переваривают до конца с 12 ед, ограничительной эндонуклеазы Ря 1 в 300 мклреакционной смеси, содержащей 206 ммоль/л трис-НС 1 (рН 7,5), 5 ммоль/лМВС 1, 50 ммоль/л ИаС 1, 6 ммоль/лР-меркдптоэтанолд и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (эту смесьназывают буфером Ряй Т) при 37 С в 25течение 2 ч, Фрагмент Ря 1 - Есо КТдлиной 5,1 тыс, оснований, несущийген Тас 1, очищают электрофорезомагарозного геля, фрагменты ДНК в агарозном геле подкрашивают бромистым 30этидием (один микрограмм/мл,. и выре 1зают полосу, соответствующую фрагменту 5,1 тыс, оснований, Фрагменты ДНКв этой полосе элюируют из геля после замораживания, Бромистый этидийудаляют из фрагментов ДНК фенольнойэкстракцией, и ДНК выделяют осаждениемэтанолом,Чтобы клонировать фрагмент РяС ТЕсо КТ длиной 5,1 тыс, оснований,содержащий ген Тас 1 в рВК 322, сначала осуществляют делецию меньшегофрагмента ДНК, лежащую между сайтами расщепления Гяе 1 и Есо К 1 РВК 322следующим образом; 10 мкг ДНК рВК 322 45переваривают с 2 ед, ограничительного фермента РяТ Т в 100 мкл буфераРяС 1 при 37 С в течение 3 ч, Послефенольной экстрдкции и этанольногоосаждения ДНК сушат под вакУУмом, азатем переваривают с 80 ед, ограничительно фермента Есо К 1 в общем объеме 200 мкл буфера Есо К 1 при 37 С втечение 2 ч, Большие фрагменты Ря 1 1 Есо КТВ содержащие примерно 3 7 тыс 55оснований, очищают электрофорезом наагарозном геле,Очищенные фрагменты (0,07 мкг)смешивают затем с О, мкг предварительно полученных фрагментов рГ В 140длиной 5,1 тыс, оснований, и цепкиеконцы Ря 1 1 и Есо КТ легируют путемобработки 20 ед. Т 4 ДНК-лигдзы в25 мкл лигазного буфера, содержащего0,48 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Пятнадцать микролитров легированной смеси используют для транс.формации штамма И 620, гесА Е, со 1,НККЬ В, Выделяют плазмиду рЧМ 051, ИККЬ В. Плазмиду получают из ИККЬ Вобычными способами,Плазмида рЧ М 051 несет фрагментДНК Ря 1 1 - Есо К 1 длиной 5,1 тыс,оснований, содержащий не только ген1 ас 1, но также и существенную частьгена 1 ас Е, Этот фрагмент содержиттри сайта расщепления Нкпс 11. в окрестности гена Тас 1, два из которыхокружают или "берут в скобки" ген1 ас 1 и один из которых попадает всам ген Тас 1. Чтобы укоротить этотфрагмент ДНК длиной 5,1 тыс, оснований и в то же время сохранить ген1 ас 1 целым для последующего использования, применяют следующую методику: 5 мкг ДНК плазмиды рЧ М 051 частично переваривают с 0,32 ед, ограничительного фермента Ндпй ТТ в75 мкл буфера Ндпй 111 при 37 С в течение 1 ч, После экстракции феноломи осаждения этанолом ДНК сушат подвакуумом. Этот способ дает фрагментыДНК различной длины, один из которых несет целый ген 1 ас 1.Чтобы получить вектор-носительдля переноса укороченного фрагментаДНК, несущего ген 1 ас 1, конструируют плазмиду, обозначенную рЧ МТ 11,Эту плазмиду можно получить из Е.со 1 д А 221/1 ас 1 Ч/рЧ М 111,. ИККЬВ, Эту плазмиду получают изБККЬ Вобычными способами.рЧ МТТТ включает сайт расщепленияНра Т, сравнительно близко окруженный двумя сайтами отщепления Есо КТ.Эта плазмида является приемлемымреципиентом для фрагмента гена 1 ас 1,поскольку она является членом класса плазмид, имеющих следующие характеристики: содержит единственныйсайт рестрикции ограничительного фермента (т,е, сайт, встречающийся только один раз в плазмиде), который .предпочтительно дает тупые концы,такие как Нра Т, Нпй ТТ или Рти Пвыведена из рВК 322 и единственныйсайт рестрикции не находится во фрагментее ДНК, который отвечает за копирование самой плазмиды, содержит двасайта рестрикции, окружающих единственный сайт рестрикции и находящихся в пределах примерно 400-700 пароснований от единственного сайта рестрикции, причем для окружающих сайты рестрикции предпочтительно могутбыть узнаны одним и тем же легко доступным ограничительным ферментом,таким как Есо К 1, Н 1 пй 11 Т, Ваш Н 1,или РзС Т, при условии, что ни одиниз двух окружающих сайтов рестрикцииотщепления также не повторяется впределах гена 1 ас ,Плазмида рЧ М 111 является пригодной, поскольку она содержит толькоодин сайт рестрикции Нра 1, окруженный в пределах 400-700 пар основанийдвумя сайтами рестрикции Есо КТ, атакже потому, что ген 1 ассам посебе не содержит никаких сайтов рестрикции Есо К 1,Фрагмент ДНК,несущий ген 1 ас ,вставляют в плазмиду рЧ И 111, следующим образом: четыре микрограмма ДНКплазмиды рЧ М 111 переваривают с 4 ед.ограничительной эндонуклеазы Нра Тв буфере Нра 1 общим объемом 50 мклпри 37 С в течениеч. Провели экстракцию фенолом, после чего ДНК выделяют этанольным осаждением и сушатпод вакуумом, Чтобы предотвратитьсамолегировани обработанных Нра 1фрагментов ДНК, высушенные ДНК обрабатывают О,5 ед, бычьего сывороточного альбумина в полном объеме 0000 мкл реакционной смеси, содержащейО ммоль/л трис-НС 1 (рН 8,0) иО, ммоль/л ЭДТА эту реакционнуюсмесь называют буфером бычьего сывоороточного альбумина), при 37 С в течение 45 мин, Фенольные экстракциипроводят три раза, чтобы полностьюудалить бычий сывороточный альбумин,после чего ДНК выделяют этанопьнымосаждением с последующей сушкой под вакуумом.Чтобы вставить фрагмент ДНК длиной ,7 тыс, оснований, несущий целый ген 1 асв рЧ МТТТ, О, мкг обработанной Нра 1 ДНК плазмиды рЧ М 111 смешивают с 0,275 мкг фрагментов ДНК, полученным частичным перевариванием Нкпс Т 1 рЧ М 05, и ДНК легируют 320 ед, Т 4 ДНК-лигазы в лигазном буфере (общий объем 20 мкл)5 1 О 5 20 25 30 35 40 45 50 55 содержащем 0,6 ммоль/л ЛТФ ири 2,5"Св течение 6 ч, Половину смеси легирования используют для трансформацииштамма И 620 гес АЕ, со 1., ИККТ,В, и трансформанты помешаютна поверхность 1.-чашки, содержащей50 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл5-бромо-хлоро-индолилП-галактозида (называемого Х-гал),Собираюттрансформанты, даюшие белые колонии,что указывает на вставление фрагмента Нпс Т 1 длиной ,7 тыс. оснований,несущего неповрежденный ген 1 ас ,в плазмиду рЧ М 111, Поскольку этатрансформация дает плазмиды, несущиеген 1 асв двух различных ориентациях, полученные плазмиды обозначили рЧ И 052 и рЧ М 053,Чтобы еще больше ограничить размервыражаемой плазмиды, а также чтобыисключить возможное ингибиторное действие на выражение гена 1 асот небольшой части гена 1 ас Е, все еще оставшегося в плазмиде, осуществляютделецию фрагмента гена 1 ас Е, одновременно сохраняя нетронутым ген1 ас .Получают способом отщепления ограничительного фермента участка междудвумя сайтами рестрикции Есо К 1 плазмиду рЧ М 053, содержащего ген 1 ас. .Этот участок вк лючает три сайта расщепления Н 1 пд 111. Два из этих сайтов рестрикции Нкпс 11 также узнаются ограничительной эндонуклеазойНра 1, Кроме того, имеются три сайтарасщепление МБрТ в этом участке, дваиз которых находятся в фрагменте гена1 ас Е, а один - в последовательностиДНК, отделяющей 3 конец гена 1 асот 5 конца фрагмента гена 1 ас Е.Указанное расположение позволяетлегко выделить фрагмент длиной 789пар оснований, лежащий между двумясайтами рестрикции Нра 1. Этот фрагмент можно затем поделить, чтобы получить смесь фрагментов МЯРТ, один изкоторых содержит 3 участок гена1 ас 1, но не содержит гена 1 ас 2. Последний фрагмент вставляют в правильной ориентации, чтобы реконструировать целостный ген 1 ас ,Для осуществления этого 00 мкгДНК-плазмиды рЧМ 053 переваривают с60 ед, ограничительного ферментаНра 1 в 800 мкл буфера Нра 1 при37 С в течение 2 ч, Фрагмент длиной789 пар оснований очищают электрофо35 1479004 резом с 5 Е-ным полиакриламидным гелем: фрагменты ДНК в полиакриламидном геле красят бромистым этидием(один микрограмм/мл) и вырезают полосу, соответствующую фрагменту дли 5ной 789 пар оснований, Фрагменты ДНКв этой полосе элюируют из геля с помощью электрофореза, Бромистый этидий удаляют из фрагментов ДНК фенольной экстракцией, а ДНК выделяют этанольным осаждением,Очищенные фрагменты ДНК длиной789 пар оснований (1,1 мкг) затемпереваривают с 12 ед, ограничительного фермента МБр 1 в 75 мкл буфераНра 1 при 37 Г в течение 1 ч, Провели фенольную экстракцию, после чегоДНК выделяют этанольным осаждениеми сушат под вакуумом, Фрагменты ДНКзатем обрабатывают 2000 ед нуклеазыБ 1 в полном объеме 150 мкл буфераБ 1 при 20 Г в течение 1 ч. Реакциюостанавливают путем добавления15 мкл 500 ммоль/л трис-НС 1 (рН 8,0) 25и 15 мкл 250 ммоль/л ЭДТА, после чегопроводят фенольную экстракцию. Чтобыудалить фенол и ионы цинка, смесьэкстрагируют эфиром и диализуют проотив 0,01 х ББС при 4 С в течение 301,5 ч дважды, а затем ДНК выделяютэтанольным осаждением,Десять микрограммов ДНК-плазмиды р 7 М 053 переваривают с 12 ед. огра ничительного фермента Нра 1 в 100 мкл буфера Нра 1 при 37 С в течение одного часа, Фрагмент длиной 8 тыс. оснований очищают электрофорезом с 0,7 Х-ным агарозным гелем, и ДНК 40 (1,1 мкг) затем обрабатывают 0,12 ед, бычьего сывороточного альбумина в 75 мкл буфера бычьего сывороточного альбумина при .37 С в течение одногоочаса, чтобы предотвратить самолеги рование тупых концов Нра 1, Фенольную экстракцию проводят три раза, чтобы полностью удалить бычий сывороточный альбумин и ДНК выделяют этанольным осаждением, затем сушат под вакуумом.Фрагменты Нра 1 длиной 8 тыс. оснований (0,4 мкг), полученные из р 7 М 053, затем смешивают с 0,05 мкг фрагментов ДНК, полученных в результате МБр 1 переваривания фрагмента длиной 789 пар оснований из рЧ М 053, и ДНК легируют 400 ед, Т 4 ДНК-лигазы в лигазном буфере (полный объем. 15 мкл), содержащем 0,8 ммоль/лоАТФ, при 12,5 Г в течение 16 ч, Десять микролитров легированной смесииспользуют для трансформации штаммаИ 620 гес АЕ. со 1, ЖКЬ В,и трансформанты помещают на поверхность Ь-чашки, содержащей 50 мкг/млампициллина и 40 мкг/мл Х-гла. Собирают резистентные к ампициллину трансформанты, дающие белые колонии, чтоуказывает на реконструкцию целостного гена 1 ас 1. Одну из плазмидныхДНК, выделенных из отобранных трансформантов, обозначают рЧМ 058,Конечная стадия конструированияпервой авторегулируемой стимулируемойвыражаемой плазмиды серии р 1 Н заключается во вставлении гена 1 ас 1в рКЕИ 045 (р 1 М, А). Для осуществления этого используют следующуюметодику: 30 мкг ДНК плазмиды р 7 М 058переваривают с 100 ед. ограничительного фермента Есо Р 1 в 250 мкл буфера Есо К 1 при 37 С в течение 1,5 ч,Фрагмент Есо К 1 длиной 2,4 тыс, оснований очищают электрофорезом на агарозном геле, Фрагменты ДНК (2,0 мкг)затем обрабатывают 600 ед, нуклеазыБ 1 в полном объеме 150 мкл буфераБ 1 при 20 Г в течение 1 ч, Реакциюостанавливают путем добавления15 мкл 500 ммоль/л трис-НС 1 (рН 8,0)и 15 мкл 250 ммоль/л ЭДТА, после чего проводят экстракцию фенолом, Чтобы удалить фенол и ионы цинка, смесьэкстрагируют эфиром и диализуют проотив 0,01ББС при 4 С в течение1,5 ч дважды, а затем ДНК выделяютэтанольным осаждением.Десять микрограмм ДНК-плазмидырКЕЮ 045 частично переваривают с1 ед. ограничительного ферментаНч.пй 11 в 751 мкл буфера Н 1 пй 111 при37 С в течение 30 мин, рКЕН 045 вклю-,чает два сайта отщепления Нпй 11,один из которых является также сайтом отщепления Ба 1 1. Частичное переваривание с ограничительным ферментом Нпй 11 дало смесь линейных фрагментов ДНК, самый длинный из которыхбыл расщеплен только в одном из сайтов расщепления Нг.пд 11. Эти фрагменты (каждый длиной примерно 5,0 тыс,оснований) выделяют электрофорезомна 0,77-ном агарозном геле,Линеаризованные ДНК (2,5 мкг) обрабатывают 0,15 ед, бычьего сывороточного альбумина в 50 мкл буфера бычье 47900420 га сывороточцо 1 о яльбумиця при 37 Св течецис.ч, чтобы предотвратитьсамолегиравяцие тупых коппсв Нз.по 11.Фецольную экстрякиию прОвадят трижды,5чтобы полностью удалить бычий сывороточный яльбумиц, 1 ПК выделяют этянольным осаждением, я затем высушивают под вакуумом,Фрагменты Есо КТ. ллицой 2,4 тыс,оснований (О,5 мкг), полученныерЧ М 058, затем смеп 1 ивяют с 0,3 мкгФрагментов рКЕИ 045 длиной 5,0 тыс,оснований и обрабят 1,1 вают 400 ел.Т 4 ДНК-лигязы в э мкл лигазнаго буфера, содержащего 0,8 ммоль/л АТФ,при 2,5 С в течение б ч. Десятьмикролитров легированной смеси используют для трансформации Е, со 1штамма И 620 гесА, КККТ, Виотбирают резистентные к ямпипиллинутрансформанты, используя Х-гал, Появление белых колоний подтвердиловставление гена 1 асв сайт Нкпс 11,расположенный ниже от гена Ап 1 р 1, 25Эта трансформация дает плазмиды,несущие ген Тасв двух рязличнь 1 хориентациях. Плаэмиды с этой структурой обозначены рЧ М 06 (рТИ-ТТТ,А-). 30Есть несколько методов конструирования плазмид рТМ-ТТТ, соответствующих рамкам считывания Аи А Если имеются в наличии копии плазмидАи Асерий рТИи рТИ-ТТ, тоспособ включает вставление Фрагмента гена Тасв плазмиды рКЕИ 049(рТБ-ТТ, А), и рКЕИ 050 (рта-ТТ,А)В альтернативном и предпочтительном способе просто требуется использовать меньшие Фрагменты ХЬа 1Есо К 1 рКЕИ 049 и рКЕИ 050 или рКЕИ039 (рТИ - 1, А) и рКЕИ 040 (рТИ - 1,А) вместо меньшего Фрагмента ХЪа 1Есо К 1 рЧ М 06 аналогично тому, чтобы получить плазмиды Аи Асериир 1-111,Полагая, что еще нет соответствующих структурных (рТИ) и стимулируемых (рТИ) плазмид, можно получитьавторегулируемые стимулируемые плазмиды Аи Анепосредственно изплазмиды рЧ"06 (А-), Последовательность ДНК в окрестности сайтарасщепления Есо К 1 рЧ М 06 изменяют,чтобы непосредственно получить структуру плазмид Ли Асоответственно серии рТИ. Это наиболее предпочтительный способ конструирования Д 111 ЦЫ;: П 1 ЛЗ МИЛПОСКОЛЬКУ ЛЛЛ и Р ГОцР нужна прРлвс 1 ритгльца кОцструира -лять сс с 1 твгтствукпп 1 ие цлязми;111 рТИ-рт 1-тт,Есть также нескал 1,ко возможцОстецкоцструирс 1 вяния рТИ-ТТТ цлазмип, сОдержащих встявОчн 11 е сяйты В и С, ПО -лагяя, что уже сконструированы саатветствукппие рТЯ-Т и рТИ-ТТ плязмцДы их мациФп 1 иръют чтОбь 1 встлвитьФрагмент геня Тас , чтО каисОлегпредпочтительна, мецыпиР 1 фрягмецтХЬа 1 - Есо К 1 рЧ М 06 (рТИ-ТТТ, А-)последовательно заменяют мен 1 п 1 имР 1фрагментами ХЬа 1 - Есо КТ ат каждойиз структурной или стимулируемОй 1 плязмиды В-сайтя или С-сяйтя, что дает влюбом случае рТИВ-сайтавую и Ссайтовую плазмиды.Наиболее предпачтительнс, Опцяко,конструировать рТИ-ТТТ выражагмыеплазмиды без первоначал 1 ного получения соответствующих плазмид рТМ-Тили рТИ. В случае встявочцагО сяйта В-плязмиду В- рТИ в 1 получают 11 зплазмиды рКЕИ 22 путем переваривания ДНК-плазмиды рКЕИ 22 ограничительным ферментом Гпц 4 Н- с последующим присоединением цепких концовЕсо К 1 к концам полученного фрагмента, Полученный таким образом фрагментЕсо К 1 затем переваривают с помощьюограничительного фермента ХЬа 1, расщепив фрагмент на двя в сайте расщепления ХЬа 1, расположенном в 5-непереводимом участкеПосредством очистки полученного таким образам меньшего фрагмента ХЬа Т - Гсо К 1 и использования его вместО; Р 1 ц,шега фрагмента ХЬа 1 - Есо КТ р" .06 (рТИ)А-) получают В- авторегулируемыйстимулируемый клонируемый вектор-носитель, Полученную плазмиду модифицируют, чтобы получить рТМплазмиды, соотгетствующие рамкам считывания Ви Всоответственно.Аналогичным образом мажна непосредственно получить рТИплязмиды С-сайта без первоначального конструирования соответствующих плазмидрЮили рТИ-ТТ, В частности, послепереваривания ДНК-плазмиды рКЕИ 111ограничительным Ферментам Вац ЗА иприсоединения цепк 11 х каццсв Есо К 1 кконцам полученного фрагмента полученный таким образам Фрагмент Есо КТзатем переваривают с Ограничительнымферментом ХЬа Т, расп 1 епив фрагмент цяФрагмент ДНК длиной 2,8 тыс. оснований, содержащий липопротеиновый ген Е.со 11., получают отдельно из гибридного 5 -фага, несущего лцпопротеиновый ген Е.соЫ (обозначенный как1 рр Гс). Липопротеиновый ген предварительно клонируют в Ъ -фаговый вектор %540 следующим обр,.зом: всю ДНК (200 мкг), выделенную из штамма КЕ.со 1, меродиплоидного для липопротеинового гена (Те 5519/Р 506) переваривают с 200 ед, ограничительного фермента Нпс 111. фрагменты ДНК разделяют на препаративном ага 5 розном геле и собирают фракции фрагментов ДНК длиной примерно О тыс. оснований, ко торые проя вляют положи -/тельную гибридизацию с 5 -32 р-липопротеиновой и-РНК, при использовании южного способа гибридизации, Смесь фрагментов Н 1 пй 111 длиной 1 О ты с. оснований (обогащенную примерно в двадцать раз) и расщепленной Н 1 пй 111 Ъ 540 векторной ДНК контактируют с 15 Т 4 ДНК-лигазой, Легированную ДНК используют для трансфекции Е.со 1 д К 302, ЫКК 1 В. Рекомбинантные фаги, несущие липопротеиновый ген, отбирают с помощью зонного способа гибриди зации, при,использовании 5 -32 р-липопротеино.вой и-РНК. Было найдено, что одна из исследованных зон, дающая по-. ложительную гибридизацию, несет полный функциональный липопротеиновый ген, и ее обозначили как 1 рр Ес.35 Двести микрограммов ДНК 1 рр Ес полностью переваривают с 200 ед, ограничительного фермента Нае 111 в40500 мкл реакционной смеси, содержащей6 ммоль/л трис-НС 1 (рН 7,5),6 ммоль/л ГяС 1 ммоль/л ГаС 1,6 ммоль/л- меркаптоэтанола и100 мкг/мл. бычьего сывороточного 45альбумина (буфером Нае 111).при37 С в течение 2 ч, и фрагмент Нае 111длиной 2,8 тыс. оснований, несущийлипопротеиновый ген Е.со 1., очищают.фракционированием на 5%-ном полиакриламидном геле по следующей методике. Сначала реакционную смесь экстра -гируют фенолом, а затем фрагментыДНК осаждают 2,5 объемами этанола,сушат под вакуумом, растворяют в200 мкл буфера, содержащего 5% глицерина, 20 ммоль/л ЭДТА, 0,5% бромофенола голубого и 0,05% ксилолцианола (эту смесь называют гелевым бу -фером) и поспе этого фракционируютна 5%-ном полиакриламидном геле. Новлоску ДК, которая мигрировала в положение 2,8 тыс. оснований, вырезаютиз геля и фрагменты ДНК элюируют изгеля электрофорезом. Краситель бромистый этидий, используемый для локализации полосы ДНК в геле, удаляютиз фрагментов ДНК фенольной экстракцией, Фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, центрифугируют, растворяют в 200 мкл 0,3 м/л ацетатанатрия, повторно осаждают 0,5 млэтанола и снова сушат под вакуумом,Выделяют примерно 1 О мкг очищенногофрагмента Нае 111 длиной 2,8 тыс,оснований,Для того, чтобы клонировать фрагмент Нае 111 длиной 2,8 тыс. оснований в рЯ С 101, синтетические молекулы Есо К 1 связки присоединяют к концам фрагмента Нае 111 длиной 2,8 тыс.,зоснований. Связку Есо К 1 (5 ГГААТТЦЦфосфорилируют Т 4 полинуклеотиднойкиназой вместе с АТФ в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 3 моль связки, 66 ммоль/л трис-НС (рН 7,5),10 ммоль/л МяС 1 10 ммоль/л р-меркаптоэтанола, 60 мкмоль/л АТФ и1 О ед. 74 полинуклеотидной киназы,оПосле инкубирования смеси при 37 Св течение 30. мин, ее нагревают при60 С в течение 10 мин и охлаждают до37 СПять мкл 0,1 моль/л э -меркаптоэтанола и 10 ед, Т 4 полинуклеотидной киназы добавляют к смеси и реакоцию продолжают при 37 С в течение30 мин, Реакцию останавливают путемзамораживания смеси в бане из сухогольда-этанола.Фрагмент Нае 111 длиной 2,8 тыс.оснований (2 мкг) смешивают со150 пмоль фосфорилированной связкиЕсо К 1 и обрабатывают 4 ед. Т 4 ДНКлигазы в 12,5 мкл реакционной смеси,содержащей 66 ммоль/л трис-НС 1 (рН7,5), 10 ммоль/л Г 1 ЕС 1, 1 О ммоль/лдитиотреитола (лигазным буфером) ио0,6 ммоль/л АТФ при 2,5 С в течение15 ч. Реакцию останавливают путем разбавления смеси в двадцать раз с помощью буфера Есо К 1 и путем нагреваония смеси при 60 С в течение 10 минДобавляют тридцать единиц ограничительного фермента Есо К 1 и смесь инкубируют при 37 С в течение одногочаса, чтобы получить цепкие концыЕсо К 1Реакцию останавливают путем-рансформантов 1 Е 559 Е, со 1.6 КЬ В отбирают клоны, содержащиеплазмиду рКЕИ 010, клонируют фрагмент с фосфорилированной За 1 1 "связкой плазмиды рКЕЮ 111 длиной0,95 кв, кодирующий 3 -непереводимыйучасток и сайт окончания транскрипции 1 рр гена в плазмиду рКЕМ 014,предварительно полученную иэ плазмиды рВК 322 делецией Нпй-Ваш Н 1 фрагмента длиной 0,35 кв, получают рекомбинантную плазмиду рКЕЯ018, далее соединяют фрагмент липопротеинового промотора с фрагментомокончания транскрипции, для этого заменяют Рчи 1 - Есо К 1 фрагмент размером 0,65 кв плазмиды рКЕМ О 8 наФрагмент Рчи 1 - Есо К 1 размером1,1 кв плазмиды рКЕИ 010, полученную плазмиду рКЕИ 0,21 модифицифруют, вставив Ндпй 111 сайт междусуществующими сайтами Есо К 1 и ВашН 1, промотор-оператор 1 ас ич 5 кло 5 нируют в ХЬа 1 сайт плазмиды рКЕИ037, в полученной плазмиде рКЕИ 038удаляют ХЬа 1 сайт, отбирают ашрклоны, содержащие рКЕИ 045, послечего клонируют 1 ас 1 ген в плаэмидурЧМ П 1, выделяют плазмиду рЧМ 052 ирЧМ 053, производят делецию фрагмента гена 1 ас Е, сохраняя нетронутымген 1 ас 1 в плазмиде рЧМ 0,53 связывают Есо К 1 фрагмент размером 2,4 квполученной плазмиды рЧМ 058 сНдпй П 1 фрагментом размером 5,0 квплазмиды рЧМ 045. и выделяют конечнуювекторную плазмиду рЧМ 061 из трансформированных клонов штамма бактерий40 Е. со 1 НККЬ В,два в сайте расщепления ХЬа 1 (рас 1положенном в 5 -непереводимом участке), Фрагмент ХЬа 1 - Есо К 1, несущий участок сигнального пептида, за" тем вставляют в сайт ХЬа 1 - Есо К 15 плаэмиды рМ 061, чтобы получить Сплаэмиду р 1 М. Последующей модификацией плазмидной ДНК получают р 1 ЯП 1 плазмиды, соответствующие рам- О кам считывания Си Ссоответственно.Структурный ген, кодирующий гормон человека или другой нужный полипептид, можно выразить в трансформи рованных бактериальных хозяевах,используя рекомбинантный плазмидный клонируемый вектор-носитель по предлагаемому способу и при этом получить значительные количества нужного . 20 полипептида. Ф о р м у л а изобретения Способ конструирования вектора рЧ М 061, заключающийся в том, что смесь Ньпйфрагментов ДНК штамма ЕзсЬегсМа со 1 д К 12 клонируют в-фаг 2540, отбирают фаг Ъ 1 рр Ес, содержащий полный липопротеиновый ген, субклонируют Ндпйфрагмент длиной 2,8 кв данного фа га с фосфорилированной Есо К 1 связкой в плазмиду р 8 С 101, отбирают трансформанты, содержащие плазмиду рКЕЯ 111, далее субклонируют А 1 и 1 фрагмент размером 0,46 кв плазмиды рКЕМ в рВК 322, отбирают клоны, содержащие плазмиду рКЕИ 008, исключают сайт Есо К 1 в рКЕЯ 008, среди Составитель Н,КузенковаРедактор В.Данко Техред Л,Сердюкова Корректор С.Шекмар Заказ 2378/58 Тираж 501 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 13035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/55 4нагревания смеси при 60 С в течение10 мин,Покрученную таким образом смесь до -бавляют к 2 мкг предварительно линеаризованной ДНК плазмиды рБ С 101 иосуществляют фенольную экстракцию,После экстракции эфиром ДНК осаждаютэтанолом, высушивают под вакуумоми растворяют в 100 мкл лигазного буофера, Смесь нагревают при 37 С в течение 5 мин, и цепкие концы Есо К 1ренатурируют путем инкубирования при4 С в течение 16 ч, а затем при 0 Со йв течение одного часа, После добавления АТФ (0,4 ммоль/л конечная концентрация) и 1 ед, Т 4 ДНК-лигазысмесь инкубируют при 12,5 С в течение 7 ч,Четвертую часть легированной смеси используют после этого для трансформации мутанного штамма ТЕ 5527с липопротеиновой делецией Е.со 1 дИККЬ В, Проводят трансформацию и трансформанты резистентные ктетрациклину выращивают в течениеночи на фильтровальной бумаге ВатманЗММ, помещенной на поверхности Ьбульонной чашки, содержащей 10 мкг/млтетрациклина, и отбирают липопротеиновые клоны путем гибридизации колоний, Фрагмент МБр 1 длиной 0,95 тыс.оснований 1 рр Ес, содержащий липопротеиновьгй ген, подвергают меченойтрансляции с Ы,-32 р с АТФ и .1-32 рЙ ЦТФ и его используют как р-зонд,Было показано, что один из трансформантов, дающих положительную гибридизацию, содержит, плазмиду со структурой и эту плазмиду обозначаютрКЕМ 111. Эту плазмиду получают изЕ.со 1 г, СС 620/рКЕИ 111, МККТ-В.Плазмиду можно получить из НКК 1-В 15011 обычным способом,Родительской плазмидой, выбраннойдля конструкции плазмиды, выражающейлипопротеиновый ген, была рВК 322(молекулярный вес примерно 2,6 мега-дальтонов), несущая гены резистентности к ампициллиновым (Ашр) итетрациклиновым антибиотикам.,рВВ. 322 включает сайт расщепленияЕсо К 1, расположенный на 5 концегена тетрациклиновой резистентности,а также сайт расщепления Н 1 пд 111,находящийся в промоторе гена тетрациклиновой резистентности, и сайтотщепления Рчи 1, находящийся в генеампициллино во й р ез и ст ен тно с ти, 79004 6.5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ДНК используют для трансформации штамма ЗЕ 5519, Е.со 1. 1 КК 1 В/ Р-, агоП, шап, агяЕ, 1 ас, яа 1, грзЬ, яугА, гесА 1. Десять трансформантов,Для того, чтобы клонировать фрагмент А 1 ц 1 длиной 462 пары основаьщц,содержащий участок липопротеиновогопромотора в рВВ. 322, первоначальнопроводят делецию фрагмента ДНК, лежащего между сайтами отщепления ЕсоК 1 и Ндпй 111 рВК 322 (содержащимипромотор гена тетрациклиновой резистентно сти), используя следующую методику: 11 мкг ДНК плазмиды рВК 322переваривают 11 ед, ограничительнойэндонуклеазы 1 йпй 111 в 200 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ммоль/лтрис-НС 1 (рН 7,5), 1 О ммоль/л ИяС 160 маколь/л, ИаС 1, 6 ммоль/л,-Мер каптоэ танол и 100 мкг /ипбычьего сывороточного альбумина буофера Нхпй 111 переваривают при 37 Св течение одного часа, После окончания переваривания проводят фенольнуюэкстракцию и ДНК выделяют этанольнымосаждением. Чтобы удалить цепкиеконцы Н.пй 111, ДНК обрабатывают1,5 мкл Б 1 нуклеазы (111 ез ЬаЬэгагогдез) в конечном объеме 300 мкл буфера, содержащего 30 лыоль/л ацетатанатрия (рН 4,25), 0,3 моль/л ИаС 1 и4 ммоль/л ЕпБО буфера Б 1 при 20 Св течение одного часа. Реакцию оста-навливают путем добавления 30 мкл500 ммоль/л трис-НС 1 (рН 8,0) и30 мкл 250 ммоль/л ЭДТА, после чегопроводят фенольную экстракцию. Чтобыудалить фенол, смесь экстрагируютэфиром и диализуют против 0,01" ББС(ББС=0,15 ИаС 1+0,015 цитрата натрия)при 4 С в течение ночи и ДНК удаляют,этанольным осаждением.Затем добавляют фосфорилированнуюсвязку Есо К 1 (200 мкмоль) и смесьобрабатывают 4 ед. Т 4 ДНК-лигазы в12,5 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч, Цепкие концы Есо К 1 помещают в 75 мкл буфера Есо К 1 при37 С в течение 2 ч, Реакцию останавливают путем фенольной экстракции иДНК выделяют этанольным осаждением,Цепкие концы Есо К 1 легируют иплазмиду повторно зажимают путем обработки с 0,3 ед, Т 4 ДНК лигазы в20 мкл лигазного буфера, содержащего0,4 ммоль /л АТФ при 12,5 С в течение7 ч, Апиквоту 0,5 мкг легированнойкоторые быпи резистентны к ампициллину, чувствительны к тетрациклину,выращивают в течение ночи в 1 мл бульона Ь, содержащего 50 мкг/мл ампициллина. Плазмидные ДНК выделяют из0,5 мл культур способом быстрой щелочной денатурации и их анализируют картированием с помощью ограничительногофермента, Выделяют плазмиду рКЕ Г 1005.Фрагмент А 1 ц 1 из 462 пар оснований,содержащий липопротеиновый промотор,получают следующим образом: 100 мкгДНК плазмиды р КЕЯ 111 перевариваютс ограничительным ферментом МБр 1 в600 мкл буфера, содержащего10 ммоль/л трис-НС 1 (рН 7,5),10 ммоль/л И 8 С 1, ммоль/л КС 1,1 ммоль/л дитиотреитола и 100 мкг/мпбычьего сывороточного альбумина (эту 20смесь называют буфером Нра 1), прио37 С в течение 3 ч. После экстракциифенолом фрагменты ДНК осаждают 2,5объемами этанола, сушат под вакуумом,растворяют в 10 мкл гелевого буфера 25и фракционируют на 57,-ном полиакриламидном геле. Примерно 6 мкг очищенного фрагмента МБр 1 длиной 0,95 тыс.оснований переворачивают затем с ограничительной эндонуклеазой А 1 ц 1 30в 400 мкл .буфера Н 1 пй 111 при 37 Св течение 2 ч,.получив фрагмент А 1 ц Тдлиной 462 пар оснований, которыйочищают гель-электрофорезом.Один микрограмм фрагмента А 1 ц 1длиной 462 пар оснований затем смеши. вают со 150 пмоль фосфорилированнойсвязки Есо К 1 и обрабатывают 4 ед.Т 4 ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего О,б ммоль/л АТФ 40при 12,5 С в течение 16 ч. Легированную ДНК переваривают с 40 ед. ограничительного фермента Есо К 1 в 100 мклбуфера Есо К 1 при 37 С в течение одного часа, чтобы создать цепкие концы Есо К 1. Переваривание останавливают путем нагревания смеси приО60 С в течение 10 мин и к смеси добавляют 0,6 мкг переваренной Есо К 1ДНК-ппазмиды рКЕГ 0,05 и проводятфенольную экстракцию. ДНК выделяютэтанольным осаждением и цепкие концыЕсо К 1 соединяют путем обработки0,4 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/ло)АТФ при 12,5 С в течение 7 ч. Легированные ДНК используют для трансформации штамма ХЕ 5519 Е со 11 Г 1 ККЬ В и траноформанты отбирают на тетрациклиновую резистентность па чашке с бульоном 1., содержащим 12,5 мкг/млтетрациклина. Анализ плазмидной ДНК,выделенной из резпстентных к тетрациклину трансформантов способом быстрой щелочной денатурации, показываетвставку фрагмента А 1 ц 1 длиной 462пар оснований в сайте Есо К рКЕГ005, и полученную таким образом однуиз плазмид обозначают рКЕИ 008,Следующей стадией конструированияклонируемых вектор-носителей А сайталипопротеинового гена было исключитьодин из двух сайтов отщепления ЕсоК 1 в рКЕИ 008, Это необходимо длятого, чтобы гарантировать единственную точку для вставления для экзогенного гена, выбранного для клонирования, сразу же ниже фрагмента А 1 ц 1и длиной 462 пар оснований ( фрагментЕсо К 1), содержащего промотор липопротеинового гена и 5 - непереводимый участок.4 мкг переваренной Есо К 1 ДНКплазмиды рВК 322 обрабатывают сначала Б 1 нуклеазой, чтобы удалить цепкие концы Есо К 1, а затем бактериальной щелочной фосфотазой, чтобы пр:дотвратить самолегирование. ЗатемДНК смешивают с 0,76 мкг очищенногофрагмента А 1 ц 1 длиной 462 пар оснований (полученного из РКЕГ 111) илегируют тупые концы с 2,4 ед. Т 4ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера,содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 Св течение 16 ч. Половину легированнойДНК используют для трансформацииштамма Е 5519 Е.со 1 д Г 1 ККЬ В,один из трансформантов содержит плазмиду. Эту плазмиду обозначают рКЕГ002 и после переваривания 25 мкг ДНКплазмиды рКЕИ 002 с ограничительнымиферментами Рчц 1 и ХЬа 1 в 500 мкл буфера, содержащего б ммоль/л трисНС 1 (рН 7,9), ммоль/л 11 д С 1,150 ммоль/л Г 1 аС 1, 6 ммоль/л/Ъ-меркаптоэтанола и 100 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина (указанную смесьоназывают буфером Ваш Н 1), при 37 С втечение одного часа очищают гельэлектрофорезом фрагмент ДНК длиной1,04 тыс. оснований Рчц 1-ХЬа 1. Фрагмент ДНК длиной 24 пары основанийХЬа 1-Есо К 1 получают из рКЕГ 008следующим образом: 25 мкг ДНК плазмиды рКЕГ 008 переваривают с ограничительным ферментом Есо К 1 длиной470 пар оснований очищают гель-элект 147900420 40 рофорезом, Один микрограмм фрагмента Есо К 1 длиной 470 пар оснований затем переваривают с ограничительным ферментом ХЪа 1 и смешивают с одним микрограммом фрагмента ДНК длиной 1,04 тыс. оснований Рчц 1 - ХЬа, полученным ранее, а также с 075 микро- граммами ДНК плазмиды рКЕМ 005, предварительно переваренной с ограничительными ферментаю Ръц 1 и Есо К 1. Смесь ДНК обрабатывают 0,8 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 50 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 7 ч.15Полонину легированной ДНК исполь - зуют для трансформации штамма ЗЕ 5519, Е.со 11, ИКЮ.Ви выбирают трансформанты, чувствительные к тетрациклину. Анализируют плазмидную ДНК, полученную из 0,5 мл культуры трансформантов, чувствительных к тетрациклину, способом быстрой щелочной денатурации и выделяют плазмиду ркЕИ ОО. 25Фрагмент Есо К 1 длиной 2,8 тыс. оснований получают из ДНК плазмиды рКЕИ 111 путем переваривания с ограничительным ферментом Есо К 1 с последующим фракционированием на полиак риламидном, геле и 10 мкг этого очищенного фрагмента полностью переваривают с ограничительной эндонукпеазой . Рц 11 в 500 мкл буфера Нае 111 прио37 С в течение одного часа. Реакцию останавливают посредством фенольной экстракции и смесь экстрагируют эфиром, Фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, подвергают центрифугированию, повторно растворяют в 200 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия и повторно осаждают с помощью 0,5 мл этанола. Пять микрограмм переваренного Рчц 11 фрагмента Есо К 1 длиной 2,8 тыс. оснований смешивают с 45 390 пмоль фосфорилированной связки Ваш Н 1 и легируют тупые концы с 6 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 25 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляют до 150 мкл с помощью буфера Нае 111 и нагревают при 60 С в течение 1 О мин, чтобы дезактивировать Т 4 ДНК-лигазу. После добавления 60 ед. ограничительного фермента Нае 111 смесь инкубируют при 37 С в течение одного часа.оПоскольку использованная здесь связка Ваш Н 1 имела последовательность оснований 5 ЦЦГГЛТЦЦГГ , последовательность узнавания для огра -ничительного фермента Нае 1115 ГГЦЦ ПЦГГ создавалась в месте сое 3динения двух любых фрагментов3 ЦЦГГ 5 связки. Таким образом, прииспользовании указанного ограничительного фермента Нае 111 для переваривания лег иро ванных свя з кой Ваш Н 1фрагментов Рчц 111 (эти фрагментыне содержат внутренних сайтов отщепления Нае 11) осуществляют удалениеизлишних множественных фрагментовсвязки Ваш Н 1, связанных с концомРчц 11, при этом остается толькоодин такой фрагмент связкинепосредственно присоединенный к этомуконцу. Эта процедура сильно упрощаеточистку фрагмента ДНК, содержащего3 конец липопротеинового гена.После дезактивации фермента Нае 111путем нагревания реакционной смесиопри 60 С в течение 10 мин фрагментыДНК полностью переваривают с ограничительным ферментом Нрав 400 мклобуфера Нра 1 при 37 С в течение 2 ч.Реакционную смесь экстрагируют фенолом и фрагменты ДНК осаждают этанолом, сушат под вакуумом, растворяютв 100 мкл гелевого буфера и фракционируют на 57-ном полиакриламидномгеле. Полосу ДНК, которая мигрировала в положение 0,95 тыс. оснований, вырезают из геля, и фрагментыДНК элюируют из геля электрофорезом,После удаления красителя бромистогоэтидия с помощью фенольной экстракции, фрагменты ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, центрифугируют, растворяют в 200 мкл 0,3 моль/л ацетатанатрия, повторно осаждают с помощью0,5 мл этанола и снова сушат под вакуумом. Выделяют примерно один мкгочищенного фрагмента Нае 111-Нра 1длиной 0,95 тыс. оснований,Сто двадцать пикомолей фосфорилиз/рованной связки Ба 1 1 (5 ГГТЦГАЦЦ )смешивают с 0,75 мкг очищенного фрагмента Нае 111-Нра 1 длиной 0,95 тыс.оснований и тупые концы легируют с3,5 ед. Т 4 ДНК - лигазы в 25 мкл лигазного буфера, содержащего0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Реакционную смесь разбавляют достаточным количеством Ваш Н 1буфера, чтобы получить конечный объем300 мкл, а затем смесь нагревают прио60 С в течение 1 О мин. Добавляют дос 1479004 12таточные количества ограничительных ферментов Ваш Н 1 и Яа 1 1 и смесь инкубируют при 37 С в течение 2 ч, чтобы получить цепкие концы путем отщепления связок Ваш Н 1 и Яа 1 1, присоединенных к концам Рчи 11 и Нра 1 со - ответственно, в результате чего получают фрагмент Ваш Н 1 - Ба 1 1 длиной 0,95 тыс. оснований, Переваривание ограничительной эндонуклеазой оста-;о, навливают путем нагревания при 60 С в течение 10 мин.На этой стадии половину объема смеси (150 мкл), содержащей примерно 0,38 мкг фрагмента Ваш Н 1-Ба 1 1 длиной 0,95 тыс, оснований, смешивают с одним микрограммом ДНК-плазмиды рКЕИ 014, которую предварительно переваривают с ограничительными ферментами Ваш Н 1 и Ба 1 1 и обрабатывают бактериальной щелочной фосфотазой, Плазмиду рКЕМ 014 предварительно получают из рВК 322 путем делеции фрагмента Нпй 111 - Ваш Н 1 длиной 25 346 пар оснований (содержащего большую часть гена тетрациклиновой резистентности) из рВК 322. Этот фрагмент удаляют, чтобы свести до минимума размер выражаемой плазмиды (примерно 30 5 тыс. оснований). Делецию этого фрагмента проводят путем переваривания Ндпй 111 с последующей обработкой нуклеазой 81 в течение одного часа при 20 С, после чего присоединяютосвязку Ваш Н 1, полностью переваривают Ваш Н 1, повторно циклизуют с помощью Т 4 ДНК-лигазы и выбирают трансформанты, чувствительные к тетрациклину, 40Смесь линеаризованной ДНК-плазмиды рКЕИ 014 и фрагментов Ваш Н 1 - Ба 1 1 длиной 0,95 тыс. оснований экстрагируют фенолом, и ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, подвергают центрифуги рованию и растворяют в 200 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия, ДНК повторно осаждают с помощью 0,5 мл этанола, центрифугируют и сушат под вакуумом. Цепкие концы фрагментов ДНК50 ренатурируют с помощью 0,4 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 60 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,55 С в течение 7 ч. Двенадцать микролитров легированной смеси затем используют для трансформации штамма ,1 Е 5519, Е.со 1 д, НККЬ В, и двенадцать резистентных к ампициллину трансформантов выращивают в течение ночи в одном миллилитре бульона Ь,содержащим 50 микроорганизмов/млампициллина. Плазмидные ДНК выделяютиз 0,5 мл культур способом быстройщелочной денатурации и анализируютагарозным гель-электрофорезом. Былонайдено, что лять плазмидных ДНК несут фрагмент Ваш Н 1 - Ба 1 1 длиной0,95 тыс. оснований и одну из этихплазмид обозначают рКЕН 018.Следующая стадия при конструировании клонируемых вектор-носителейА-сайта липопротеинового гена заключается в том, чтобы соединить фрагмент липопротеинового промотора сфрагментом окончания транскрипции водинаковой ориентации. Эту стадиюосуществляют, заменяя фрагмент Рчи 1 Есо К 1 длиной 630 пар основанийрКЕИ 018 фрагментом Рчи 1-Есо К 1 длиной 1,1 тыс. оснований плазмидырКЕН 010.Чтобы это осуществить, 20 мкгДНК-плазмиды рКЕМ 010 полностью переваривают с ограничительной эндонуклеазой Рчи 1 в 100 мкл буфера Ваш Н 1опри 37 С в течение 1,5 ч. После дезактивации фермента Рчц 1 посредствомнагревания реакционной смеси при60 С в течение 10 мин, добавляют52 мкл воды, 40 мкл 0,5 моль/л трисНС 1 (рН 7,5), 4 мкл 0,1 моль/л МцС 1и 40 ед. ограничительного ферментаЕсо К 1. Реакционную смесь инкубируютпри 37 С в течение одного часа и пеореваривание останавливают фенольнойэкстракцией. Фрагменты ДНК осаждают2,5 объемами этанола, сушат подвакуумом, растворяют в 100 мкл гельного буфера и фракционируют на 57-номполиакриламидном геле. После элюирования отдельных фрагментов ДНК из геля получают четыре микрограмма очищенных фрагментов Рчц 1-Есо К 1 длиной 1,1 тыс. оснований,Очищенный фрагмент (0,75 мкг)затем смешивают с 0,6 мкг ДНК-плазмиды рКЕН 018, которую предварительноподвергают двойному перевариваниюс ограничительными ферментами Рчц 1и Есо К 1, а затем обработкой бактериальной щелочной фосфотазой. Цепкиеконцы Рчц 1 и Есо К 1 легируют путемобработки с 0,4 ед, Т 4 ДНК-лигазы в50 мкл лигазного буфера, содержащегоо0,4 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение7 ч. Двадцать пять микролитров легированной смеси используют для транс 479004формации штамма 1 Е 5519 Е.со 1 г, НКЮ Ви отбирают трансформанты, с.тойкие к ампициллину. Плазмидные ДНК выделяют из резистентных к ампициллину трансформантов и их анализируют с помощью агарозного гель-электрофореза, Отбирают плазмиду рКЕМ 021.рКЕБ 021 несет как фрагмент липопротеинового промотора, так и фрагмент окончания липопротеиновой транс - крипции, которые разделены фрагментом длиной 32 пары оснований, получены из рВК 322. Посредством делеции последнего фермента и вставки последовательности ДНК, кодирующей целевой полипептид, обеспечивается функциональная группа для выражения целевого полипептида. Однако в силу того, что на концах фрагмента длиной 32 пары оснований находятся сайты отщепления Есо К 1 и Ваш Н 1, структура плазмиды рКЕН 021 допускает только вставку вставочных фрагментов экзогенной ДНК, имеющих цепкие концы Есо К 1-Есо К 1, Ваш Н 1-Ваш Н 1 или Есо К 1-Ваш Н 1. Поэтому, чтобы расширить класс экзогенных генов, которые можно вставлять, чтобы они включали гены, сшиваемые с другими сочетаниями цепких концов, последовательность ДНК на этом участке можно модифицировать и добавить сайт расщепления Нгпй 111 между существующими сайтами Есо К 1 и Ваш Н 1,Для достижения этого сначала желательно уменьшить размер плазмиды, исключив фрагмент Нгпй 111-С 1 а 1 длиной 200 пар оснований в рКЕМ 021 с помощью следующей методики: пять микрограммов ДНК плазмиды рКЕИ 021 час - тично переваривают с одной единицей ограничительного фермента С 1 а 1 в 1-0 мкл реакционной смеси, содержащей 10 ммоль/л трис-НС 1 (рН 8,0), 10 ммоль/л И 8 С 1 и 100 мкг/мп бычьегоо сывороточного альбумина, при 37 С в течение одного часа. После фенольной экстракции и этанольного осаждения цепкие концы С 1 а 1 удаляют посредством обработки с 600 ед. нуклеазы Б 1 в 200 мкл буфера Б 1 при 20 С в течение одного часа. Реакцию останавливают путем добавления 20 мкл 0,5 моль/л трис-НС (рН 8,0) и 20 мкл 0,25 моль/л ЭДТА, Смесь экстрагируют фенолом и диализуют в течение четырех часов против 0,0 ББС. ДНК осаждают 2,5 объемами этанола, 5 1 О 15 20 25 30 35 40 45 50 55 цен трифугир уют и по втор но су сп е иди руют в 100 мкл 0,3 моль/л ацетата натрия, ДНК повторно осаждают 250 мклзтанола, центрифугирувт и высушиваютпод вакуумом.Затем один микрограмм обработаннойБ 1 ДНК смешивают с 70 пмолями фосфо рилированной связки Нгпй 111(5 ЦЦААГЦТТГГ ) и легируют тупыеконцы 4 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 20 мкл лигазного буфера, содержашего 0,6 ммоль/л АТФ при 12,5 С в течение16 ч. Затем смесь разбавляют до100 мкл с помощью буфера Нгпй 111 и нагревают ее при 60 С в течениео1 О мин. Добавляют двадцать единиц ограничительной эндонуклеазы Нгпй 111,осмесь инкубируют при 37 С н течение одного часа, чтобы удалить избыточныемолекулы связки и получают цепкие концы Нгпй 111, Затем реакционную смесь экстрагируют фенолом и ДНК осаждают этанолом. Плазмидные ДНК(0,5 мкг) повторно циклизуют посредством обработки с 0,8 ед, Т 4 ДНК-лиг азы в 15 мкл лиг аз ного буфер а, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при 12,5 Св течение 7 ч. Восемь микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма Та 221 Е.со 1 г, НКВД В/гесА, 1 г, Ь, Ь ггрЕ 5, гЬг, 1 еп, гМ, 1 асуЧтобы исключить сайт отщепления Нгпй 111 рКЕИ 030, 2,5 мкг ДНК-плазмиды рКЕИ 030 переваривают с 5 ед. ограничительного фермента Нгпй 111 в 50 мкл буфера Нгпй 111 при 37 С в течение одного часа. После фенольной экстракции и осаждения этанолом цепкие концы Нгпй 111 удаляют путем обработки 400 ед. нуклеазы Б 1 в 200 мкл буфера Б 1 при 20 С в течение одного часа, После выделения ДНК, 0,75 мкг обработанной Б 1 ппазмидной ДНК повторно циклизуют посредством обработки 2 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 10 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 12,5 С в течение 16 ч. Три микролитра легиро-. ванной смеси используют затем для трансформации штамма ТА 221 Е.со 1 г, МКК 1, В, и выдсляют плазмиду рКЕБ 033, которая не содержала сайтов отщепления Нгпд 111.Последовательность ДНК-плазмиды рКЕМ 033 модифицируют, чтобы создать сайт отщепления Нгпй 111 между сайтами Есо К 1 и Ваш Н 1 следуюшим обра 1479004зом: 5 мкг ДНК-плазмиды рКЕМ 033переваривают с 1 О ед, ограничительнойэндонуклеазы Ватп Н 1 в 50 мкл буфераоВатп Н 1 при 37 С в течение одного ча 5са. После дезактивации ферментаВатп Н 1 путем нагревания реакционнойосмеси при 60 С в течение 10 мин линеаризованные фрагменты Д.К переваривают с 10 ед. фермента Есо Р 1 вО100 мкл буфера Есо К 1 при 37 С в течение одного часа После фенольцойэкстракции и осаждения этанолом,ДНК (3,6 мкл) обрабатывают тремяединицами Т 4 ДНК полимеразы в 20 мкл 15реакционной смеси, содержащей50 ммоль/л трис-НС 1 (рН 8,0),100 ммоль/л КС 1, 6 ммоль/л МрС 1 и6 ммоль/л дитиотреитола (эту реакционную смесь называют полимеразным 20эфером) в присутствии 0,1 ммоль/лкаждого из соединений.с 1 АТФ, йСТР,ЙСТР и ЙТТР при 12,5 С в течение45 мин,После выделения ДНК добавляют 2530 пмолей фосфорилизированной связки Нпт 1 111, после чего проводяттупоконечное легирование 4 ед. Т 4ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,6 ммоль/л АТФ, при 30о12,5 С в течение 16 ч. Затем смесьразбавляют до 100 мкл с помощью буфера Н.пй 111 и переваривают со100 ед. ограничительного ферментаНпт 1 111. Смесь инкубируют при 37 Св течение одного часа, чтобы удалитьизбыточные молекулы связки и получитьцепкие концы Нхпт 1 111, которые потомсоединяют (при этом повторно циклизуют плазмидные ДНК) посредством обработки 0,8.мкг ДНК 0,4 ед. Т 4 ДНКлигазы в 20 мкл лигазного буфера,содержащего 0,4 ммоль/л АТФ при12,5 С в течение 7 ч, После трансформации штамма ТА 221 Е. со 1 т., ЯКЮ 45Вс помощью части легированнойсмеси плазмидные ДНК выделяют из резистентных, ампициллину колоний иплазмиду обозначают рКЕХ 037, Анализнуклеотидной последовательностиДНК рКЕИ 037 показал, что в последовательности ДНК имеется делеция однойГ-Ц пары между сайтами отщепленияНпт 1 111 и Ватп Н 1 (по неизвестнымпричинам) и рКЕМ 037 представляет собой структурный Аклонируемый вектор-носитель,Для того, чтобы согласовать вставочные фрагменты ДНК с рамками считывация, отличцыми от рамок рКЕИ 037,конструируют клоцируемые вектор-носители Аи Алцпопротеицовогогена посредством регулирования рамок считывания рКЕМ 030 в сайте отщеплеция Есо К 1, Эта последовательность включает сайт отщепления А 1 и 1между положениями +45 и +46. При получении плазмиды рКЕИ 008 связкуЕсо К 1 присоединяют к концу А 1 ц 1,получая последовательность ДНК вплазмидах рКЕМ 008, рКЕН 010, рКЕИ021 и рКЕИ 030 и получая сайт отщепления Есо К 1 между положениями +47и +48, Последовательность ДНК рКЕИ030 модифицируют в сайте Есо Р 1, чтобы сдвинуть ее рамку считывания наодно и на два основания .соответственно,Чтобы добиться этого результатав первом случае и получить плазмидус рамкой считывания А, 5 мкг ДНКплазмиды рКЕМ 030 полностью переваривают с ограничительным ферментомЕсо К 1 в 100 мкл буфера Есо К 1 прио37 С в течение 60 мин. После фенольной экстракции и этанольного осаждения ДНК обрабатывают 3 ед, Т 4-полимеразы в 30 мкл полимеразного буфера вприсутствии 0,1 ммоль/л с 1 СТР и0,1 ммоль/л ЙАТР при 12,5 С в течение45 мин,Реакциюостанавливают путемдобавления ЭДТА до конечной концентрации25 ммоль/л. После чего проводят фенольную экстракцию, Таким образомполовину 4-основных Есо К 1 "цепкихконцов" заполняют двумя А-остатками.Остальные два однонитчатых А-остаткаудаляют посредством обработки нуклеазой 81 в 200 мкл буфера 81 при 20 Св течение одного часа, Реакцию останавливают путем добавления 20 мкл0,5 моль/л трис-НС 1 (рН 8,0) и 20 мкл0,25 моль/л ЭДТА, Смесь экстрагируют фенолом и диализуют в течение ночи против 0,0188 С, ДНК осаждают2,5 объемами этацола, центрифугируюти повторно суспендируют в 100 мкл0,3 моль/л ацетата натрия, ДНК повторно осаждают с помощью 250 мклэтанола, центрифугируют и сушат подвакуумом.Чтобы восстановить сайт отщепления Есо К 1, один микрограмм обработанной Б 1 ДНК сначала смешивают с70 пмолями фосфорилированцой связкиЕсо К 1 и тупокоцечно легируют с3,2 ед. Т 4 ДНК-лигазой в 11 мкл лигаз 17181479004ного буфера, содержащего 0,6 ммоль/ль,АТФ при 12,5 С в течение 16 ч. Затем смесь разбавляют до 50 мкл буфером Есо К 1 и нагревают при 60 ьС в течение 10 мин, Добавляют двадцать единиц ограничительной эндонуклеазыЕсо К 1 и смесь инкубируют при 37 Св течение одного часа, чтобы удалитьизбыточные молекулы связки и получить цепкие концы Есо К 1. Затем реакционную смесь экстрагируют Фенолом,и ДНК осаждают этанолом. ПлазмидныеДНК (0,5 мкг) повторно циклизуютпосредством обработки с 0,8 ед. Т 4ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,4 ммоль/л АТФ,при 12,5 С в течение 7 ч, Восемь микролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТА 221Е. со 11, ККК 1. В, ПлазмидныеДНК очищают из 3 трансформантов резистентных к ампициллину, которыевыращивают в течение ночи в .100 млбульона 1., содержащего 50 мкг/млампициллина, определяют последовательности ДНК в их сайтахотщепления Есо К 1, выделяют плазмиду иобозначают рКЕМ 024 (А),Чтобы сконструировать плазмиду срамкой считывания А5 мкг ДНКплазмиды рКЕН 030 полностью переваривают с ограничительным ферментомЕсо В 1 в 100 мкл буфера Есо Р 1 при37 С в течение 60 мин, После фенольнои экстракции и этанольного осаждения "цепкие концы" Есо Р 1 удаляютпосредством обработки ДНК (4,4 мкг),500 ед, куклеазы Б 1 в 150 мкл буфераБ 1 при 20 С в течение одного часа,Реакцию останавливают путем добавления 15 мкл 0,5 моль/л трис-НС 1(рН 8, О) и 1 5 мкл О, 25 моль/л ЭДТА,Смесь экстрагируют Фенолом и диализуют в течение четырех часов против0,01 ю ББС. ДНК осаждают с помощью2,5 объемов этанола, центрифугируюти повторно суспендируют в 100 мкл0,3 моль/л ацетата натрия. ДНК повторно осаждают 250 мкл этанола, центрифугируют и высушивают под вакуумом,Чтобы восстановить сайт отщепления Есо К 1, один микрограмм обработанной Б 1 ДНК смешивают с 240 пмолями Фосфорилированной Есо К 1 связки илегируют тупые концы с помощью 4 ед,Т 4 ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буФера, содержащего О,б ммоль/л АТФ при 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 12,5 Г в течение 16 ч. Затем смесьразбавляют до 250 мкл буфером Есо К 1ьи нагревают при 60 С в течение 10 мин.Добавляют сто единиц ограничителейэндонуклеазы Есо ВТ и смесь пнкубируют при 37 С в течение одного часа,чтобы удалить избыточные молекулысвязки и получить цепкие концы Есо Р 1Затем реакционную смесь экстрагируютФенолом и ДНК осаждают этанолом,Плазмидные ДНК (0,3 мкг) повторноциклизуют посредством обработки0,8 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 15 мкл лигазного буфера, содержащего 0,5 ммоль/лАТФ, при 2,5 С в течение 7 ч, Восемьмикролитров легированной смеси используют для трансформации штамма ТА 221Е. со 1 д, НКК 1 В, ПлазмидныеДНК очищают из 3 трансформантов, резистентных к ампициллину, которыевыращивают в течение ночи в 100 млбульона 1 содержащего 50 мкг/мл ампициллина, и после этого определяютпоследовательности ДНК в их сайтахотщепления Есо К 1. Была выделенаплазмида, которую обозначают рКЕН036 (А-З).Чтобы изменить трансляционную рамку считывания рКЕХ 037 (О) на дведругие рамки считывания (Аи А-З),меньший Фрагмент ХЪа 1 - Есо К 1рКЕИ 037 заменяют меньшими Фрагментами ХЪа 1 - Есо К 1 из рКЕМ 024 (А)или из рКЕМ 036 (А-З), 3 мкг рКЕИ 037сначала переваривают с 6 ед, ограничительного Фермента ХЬа 1 в 50 мкл буфера Ваш Н 1 при 37 С в течение одного часа, а после дезактивации фермента ХЬа 1 Фрагменты линеаризованнойДНК переваривают с 6 ед. ограничительного фермента Есо К 1 в 100 мклбуфера Есо К 1 при 37 С в течение одного часа, Больший Фрагмент ХЬа 1 -Есо К 1 отделяют от меньшего фрагмента посредством агарозного гель-электрофореза, фрагменты ДНК в агарозномгеле красят бромистым этидием (одинмкг/мл) и вырезают полосу, соответствующую большему фрагменту, Фрагменты ДНК в этой полосе элюируют из геля после замораживания, Бромистыйэтидий удаляют из фрагментов ДНК Фенольной экстракцией и ДНК выделяютэтанольным осаждением,Высушенные фрагменты ПНК растворяют в 20 мкл воды и аликвоты в одинмикролитр смеси этого фрагмента ДНКрКЕИ 037 смешивают с 0,1 мкг каждого