C12N 15/70 — векторы или системы экспрессий, специально приспособленные для E.coli

Номер патента: 1708848

Опубликовано: 30.01.1992

Авторы: Бобков, Бобкова, Гараев, Казеннова, Колот

МПК: C12N 15/48, C12N 15/70

Метки: pga9, антигенными, бактерий, белка,обладающего, вируса, днк, еsснеriснiа, иммунодефицита, кодирующая, конструирования, первого, плазмидная, продуцент, рекомбинантная, свойствами, синтез, типа, человека, штамм

...ген устойчивости к канамицину, и раг-участок СоА выделяют из плазмиды рАК 25. Для этого рАК 25 подвергают гидролизу рестриктазой Е,сой 1, ин кубируя 20 мкг ДН К рАК 25 с 20 ед, 10 фермента в присутствии 50 мМ МаС 3, 10 мММцС 32 10 мМ трис-НС 3, рН 7,5, 1 мМ ДТТ в течение 2 ч г.ри 37 С с последующим прогреванием при 75 С в течение 15 мии. Далее гидрслизовзииую ДНК разделяют в 0,8% 15 дгзрозном геле и выделяют нужный фрагмент ДНК, используя бумагу ДЕ 81.В качестве вектора используют плазмиду р 630, полученную следующим образом.Клетки бактерий Е.со 3 НВ 101, содержа щие плазмидную ДНК рОВ 290 выращиваютв 200 мл бульона до титра 1 х 10 клеток/мл. Клетки осаждают центрифугирсванием(5000 ц,5 мии,4 С) и ресуспендируют в 35 мл раствора,...

Номер патента: 1713930

Опубликовано: 23.02.1992

Авторы: Берзин, Борисова, Грен, Лосева, Озолс, Осе, Петровский, Пумпен, Пушко, Цибиногин

МПК: C12N 1/21, C12N 15/51, C12N 15/70 ...

Метки: 1-55, аминокислот, бактерий, гепатита, днк, кодирующая, конструирования, концевых, кор-антигенвируса, лишенный, плазмидная, поверхности, рекомбинантная, штамм, экспонированным, эпитопом

...и инкубируют 30 мин при . 4 С, Лизат осветляют центрифугированием 30(10 000 д, 4 С, центрифуга). НВс Ад Ь - рге 52 (1-55) очищают следующим образом, Ли. зат подвергают фракционированию сульфатом аммония. НВс Ад Ь - рге 52 (1-55) собирают в осадке, полученном при 30% 35 насыщения. сульфатом аммония. Осадок растворяют в 0,04 М фосфате натрия, рН 8,0;0,15 М йаС, 0,1 тритоне Х 100 до конечйой концентрации белка 25-50 мг/мли 6-7 мл этого раствора наносят на колонку с Сефа-. 40 розой С 4 В (2,1 х 75 см), уравновешенную .тем же буфером, но без тритона Х 100, Фрак- ции. проявляющие НВсАд-активность, собирают и используют либо непосредственно, либо после концентриро вания переосаждением 50%-ным сульфатом аммония.Определение...

Номер патента: 1732814

Опубликовано: 07.05.1992

Авторы: Масакацу, Масаюки, Митито

МПК: C12N 15/58, C12N 15/70

Метки: активатора, активность, гибридного, область, ответственную, плазминогена, проурокиназного, содержащего, средство, ткани, ферментную, фибрином

...Гибридизацию проводятпри 60 С.Фильтр. сушат на воздухе после промывания два или три раза 2 хЯЯС при 60 С иклоны, гибридизирующиеся с указаннымзондом, обнаруживают с помощью авторадиографии, Получают восемь положительных клонов. Плазмиды в этих клонах далееобозначают как плазмиды рРЕ 1 - рРЕ 8. Прирасщеплении ДНК этих плазмид рестриктазой Рва подтверждают, что плазмида рРЕЗсодержит вставку кДНК длиной приблизительно в 420 п.о,Фрагменты, полученные расщеплениемДНК плазмиды рРЕЗ эндонуклеазной рестрикции Рва, субклонируют в М 13 рв 8 ипроводят определение последовательности оснований. Результаты подтверждают,что кДН К содержит не только кодирующуюобласть достаточной длины на 5-концевой стороне гена проуроклиназы, но также...

Номер патента: 1744110

Опубликовано: 30.06.1992

Авторы: Грен, Дрейлиня, Козловская, Озолс, Платцер, Пумпен, Пушко, Розенталь, Сиаккоу, Соминская, Ульрих

МПК: C12N 1/21, C12N 15/33, C12N 15/70 ...

Метки: frblv, бактерий, бактериофага, белок, вируса, днк, еsснеriснiа, кодирующая, конструирования, крупного, лейкоза, оболочки, плазмидная, прод, рекомбинантная, рогатого, скота, слитый, штамм

...50 мМ трис-НС, рН 7,5; 10 мММдС 2, 10 мМ дитиотрейтол, 50 Ы АТР и 10ед, Т 4 ДНК-лигазы, в течение 12 ч при 4 С,Фрагмент инактивируют нагреванием при650 С в течение 15 мин, К реакционной смесидобавляют 100 мкл клеток Е,соИ ВВ 1, обработанных 100 мМ СаС 2 (конечная концентрация - 5 х 10 клеток/мл), длятрансформации клеток,Отбор клонов осуществляют путем экспресс - выделения ДНК и ее рестрикционного анализа, а также секвенирования.Плазмида с ожидаемой последовательностью получает наименование рГРВ Ч-Р 6,Конструирование рекомбинантнойплазмидной ДНК рЕРВ ЧзР 6,2 мкг плазмиды рРРВ Ч-Г 6, выделенной стандартным методом, расщепляют 3.ед, растриктазы Есо 781 и 3 ед, рестриктазыЗзр 1 в 25 мкл раствора А, содержащего100 мМ трис-НС, рН 7,5; 50 мМ...

Номер патента: 1744111

Опубликовано: 30.06.1992

Авторы: Епифанова, Ксензенко, Кулаков, Новикова, Носкова

МПК: C12N 15/33, C12N 15/70

Метки: rv7-ii, бактерий, выявления, днк, еsснеriснiа, плазмидная, продуцент, рекомбинантная, ротавирусов, содержащая, фрагмент, фрагмента, человека, штамм

...мк КиН; АТФ и 1/10 объема поли-А-полимеразы (0,5 мкг,Степень аденилирования определяют по известной методике, Определяют время реакции, необходимое для присоединения 15 - 20 остатков АМФ. Полученный препарат экстрагируют фенолом и осаждают 2,5 объемами спирта.К препарату полиаденилированной РН К в буфере ТЕ добавляют 5 мкг олиго-ОТ 2-в денатурируют 3 мин при 100 С и охлаждают во льду. Синтез кДНК проводят в буфере, содержащем 50 мМ трис-НС 1, рН 8,3, 50 мМ КС 1, 10 мМ МдС 2, 10 мМ ДТТ, 4 мМ пирофосфата натрия, по 0,5 мМ б АТР, б СТР, б 6 ТР, б ТТР, 10 мк Ки Р АТР в объеме реакционной смеси 100 мкл. Добавляют 25 ед,обратной транскриптазы из вируса миелобластоза птиц и инкубируют 2 ч при 42 С,Цепи РНК удаляют щелочным гидролизом (0,25 М...

Номер патента: 1751208

Опубликовано: 30.07.1992

Авторы: Бреде, Грен, Дрейлиня, Козловская, Озолс, Платцер, Пумпен, Пушко, Розенталь, Сиаккоу, Соминская, Ульрих

МПК: C12N 15/33, C12N 15/70

Метки: pfrblv, бактерий, бактериофага, белка, белок, вируса, днк, еsснеriснiа, кодирующая, конструирования, крупного, лейкоза, обо, оболочки, плазмидная, продуцент, рекомбинантная, рогатого, скота, штамм

...при фильтрыинкубируютсмоноклональны 65 С. После очистки ДНК В 9 И 1 - ВагпН фраг- ми анти- др 51 антителами глАК 14 в развемента на агарозном геле ДНК растворяют в дении 1:500 на буфере ТВЯ, содержащем20 мкл воды, Заполнейие концов проводят 55 50 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 0,15 М МаС 1, 0,1%в 100 мкл раствора Б, содержащего 0,05 М тритон Х 100, 1% БСА, в течение 15 ч притрис-НС 1, рН 7,5, 0,01 М 9 С 12, 0,01 М дитиот С, После трехкратной отмывки буферомрейтол,0,025 М МаС 1, 100 мкМ сАТР, ОСТР, ТВЯ фильтры инкубируют 2 ч при 200 С снТТ 1- и ОСТР и 10 ед, ДНК-полимеразы Е. коньюгатом пероксидазы с антителами просоИ (фрагмент Кленова, в течение 1 ч при тив иммуноглобулинов мыши в разведении1:500. Фильтры отмывают буфером ТВЯ (3 - но. Иньекции...

Номер патента: 1751209

Опубликовано: 30.07.1992

Авторы: Берзин, Борисова, Грен, Дрейлиня, Лосева, Лэтч, Меринг, Озолс, Осе, Петцольд, Порстман, Пумпен, Розенталь, Ульрих, Цибиногин

МПК: C12N 15/33, C12N 15/51, C12N 15/70 ...

Метки: 24-5, бактерий, белка, белок, вируса, гепатита, днк, еsснеriснiа, иммунодефицита, кодирующая, кор-ант, кор-антигена, оболочки, плазмидная, продуцент, рекомбинантная, слитого, слитый, человека, штамм

...клеток к реакци-онной смеси добавляют 100 мкл клеток Е.соП ЯВ 1, обработанных 0,1 М СаС 12 (конечная концентрация - 5 х 10 клеток/мл).9Отбор клоновосуществляют путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК,выделенной экспресс-методом. Плаэмида сожидаембй рестрикционной картой получает наименование рНИ 24-5,2. Штамм-продуцент Е. соИ К 802 (рН24 - 5),Штамм-продуцейт получают трансформацией клеток Е. со 11 К 802 рекомбинантнойплазмидной рНИ 24-5, Клетки выращиваютдо оптической плотности ОП 65 о 4-5 в солевой среде М 9 с добавкой, г/л: каэаминовыекислоты 10; глюкоза 2; ампициллин. 0,02,Клетки собирают центрифугированием и лизируют в четырехкратном обьеме буфера,содержащего 0,05 М трис-НС 1, рН 8,0; 0,15М ИаС 1, 0,1% тритон Х 100,...

Номер патента: 1825376

Опубликовано: 30.06.1993

Авторы: Акико, Мориюки, Сейга, Сусуму, Тамио

МПК: C12N 15/18, C12N 15/70

Метки: гормон, днк, днк,кодирующей, днк-фрагмент, кодирующий, конст-ния, лосося, плазмид, плазмидной, промежуточной, рекомбинантной, роста, содержащей

...экстрагируют смесью фенола с хлороформом и осаждают этанолом с получением 0,5 пмоля кДНК-вектора-затравки ДНК, связанной с (дЦ) цепями. Затем 0,08 пмоля ДНК и 0,16 пмоля упомянутой связующей ДНК добавляют к 40 мл раствора, содержащего 10 мМ трис-НС (рН 7,5), 0,1 М йаС и 1 мМ ЭДТА, и инкубируют при 65 С, 42 С и 0 С в течение соответственно 10, 25 и 30 мин. Реакционный раствор доводят до 400 мл (полный объем) раствора. содержащего 20 мМ трис-НС 1 (рН 7,5) 4 мМ МцС 12, 10 мМ (НН 4)2504, 0,1 М КС 1 и 0,1 мМ Р.НАД, К реакционному раствору добавляют 10 единиц ДНК-лигазы Езсег 1 сЬ 1 а со 11 и инкубируют в течение 1 сут при 11 С. Реакционный раствор доводят до раствора, содержащего 40 мкМ дНТФ и 0,15 мкМ /3-НАД. Затем добавляют пять единиц...

Номер патента: 1836424

Опубликовано: 23.08.1993

Авторы: Габриелла, Имре, Пал, Тамаш

МПК: C12N 15/70, C12N 15/72

Метки: белков, вектора, клетках, конструирования, промотора, экспрессии

...может оказывать неблагоприятное воздействие на метаболизмклетки-хозяина,9. Предпочтительными вектооами экспрессии настоящего изобретения являютсяописанные ниже векторы, которые отличаются тем, что они имеют: размер 2800 - 4500основных пар; ген устойчивости к ампициллину; оптимизированное расстояние междусигналами транскрипции и трансляции; известную полную ДНК-последовательность;Со Е репликативного типа; число копий20-30 на клетку(хотя были построены такжеварианты с высоким числом копий, в соответствии с патентной заявкой Венгрии,опубликованной под номером Т 35280); не 1836424сколько различных сайтов распознавания рестриктирующих эндонуклеаз для встраивания в зкспрессируемый чужеродный ген, причем чужеродный ген может быть встроен при...

Номер патента: 1838412

Опубликовано: 30.08.1993

Авторы: Бригитте, Рональд, Хансен

МПК: C12N 15/18, C12N 15/70

Метки: биосинтеза, бычий, бычьего, гормон, гормона, днк, кодирующей, плазмидной, производного, рекомбинантной, роста

...трансформантыэкспрессируют вышеупомянутое производное МЕТ бГР с высокими уровнями, Поскольку плазмида рАТ содержит15 термоиндуцируемый репликон неконтролируемого роста, максимальная экспрессияжелаемого продукта производного бГР происходит при культивировании при температурах около 37 С,20 П р и м е р 9. Конструирование плазми 25 ДНК; ССС ЛАС ССТ СТССТ 3ССС ТТС ССЛ С 515 30 35 40 ки, и затем культивируют для последующего продуцирования и выделения плазмиды45 рАЯР 1. Как показано ЯОЯ-гель-электрофо 50 55 В, Лигирование и трансформация,Примерно 20 пикомолей линкернойДНК примера 7,Б, 1 мкг перевара рММ 608примера 7,А, 0,5 мкг ВаоН 1-ЕсоВ 1 фрагмента примерно 10,2 3 сЬ плазмиды рСЕ 101(полученного в соответствии с методикойпримера 2;Б, с...

Номер патента: 1633817

Опубликовано: 15.03.1994

Авторы: Горская, Курепина, Липасова, Поспелова, Рахимова, Соколова, Хмель, Чеснокова

МПК: C12N 15/30, C12N 15/70

Метки: coli, escherichia, активностью, антибактериальной, бактерий, микроцина, обладающий, определяющая, плазмида, синтез, штамм

1. Плазмида p74, определяющая синтез микроцина, мол. м. 54,7 Мд, содержащая:ДНК плазмиды p1 штамма Enterobacter sp. ;траспозон Tn 5;при расшеплении рестриктазой Bg1 11 образуются 12 фрагментов с размерами 21; 12; 7,8; 7,0; 6,8; 5,8; 5,3; 3,8; 2,6; 2,5; 2,2; 2,1; т. п. н. ;- при расщеплении EcoRI-7 фрагментов с размерами 25, 23, 14, 9,6; 6,0; 2,3; 0,8 т. п. н. - при расщеплении CIaI - II фрагментов с размерами 14,5; 13; 9,6; 9,0; 8,2; 6,8; 6,0; 5,8; 4,8; 3,4; 3,2 т. п. н. ;- при расщеплении HindIII - 9 фрагментов с размерами: 25; 15; 14; 13; 6,2; 3,4; 2,7; 2,4 т. п. н. ;- при расщеплении PwII - 11 фрагментов с размерами 23; 13; 9; 6,5; 5; 4,8; 4,2; 4; 3,8; 3,4; 3,2; 2,6 т. п. н. ;- при расщеплении...

Номер патента: 1405313

Опубликовано: 15.03.1994

Авторы: Баев, Ксензенко, Солонин, Трояновский

МПК: C12N 15/70

Метки: escherichia, вектор, конструирования, обеспечивающий, регулируемую, экспрессию

1. Вектор p1L 207, обеспечивающий регулируемую экспрессию чужеродных генов в Escherichia coli, содержащий:Bam HI - Bgl 11 - фрагмент ДНК фага размером 1,2 т. п. н. с промотором PL и геном N;2 Bgl II - фрагмента ДНК фага размером 2,4 т. п. н. и 0,65 т. п. н с генами rex A, rex B, cr 857, cro am 6 и промотором PR;Bam HI - Sal G1 фрагмент плазмиды РВР 322 размером 4,1 т. п. н. ;уникальные сайты рестрикции Bam HI, Eco Rl, Eco RV; C1a I, Hpa I, Sal G I, Pvu II, Nru I, Sph I - места возможного клонирования чужеродных генов, сайты рестрикции Bam HI и Sph I...

Номер патента: 1438239

Опубликовано: 15.07.1994

Авторы: Захарова, Солонин, Таняшин, Чернов

МПК: C12N 15/70

Метки: echerichia, бактериофагами, защиты, культур, лизиса, обеспечивающая, плазмида, рекомбинантная, устойчивость, фаголизису

1. Способ защиты культур Escherichia coli от лизиса бактериофагами, включающий трансформацию клеток E.coli рекомбинантными плазмидами и культивирование клеток, отличающийся тем, что, с целью повышения устойчивости культур E. coli к различным колифагам, клетки E.coli трансформируют рекомбинантными плазмидами, содержащими Bgl II-фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда с интактными генами rex AB, ts 857, мутацией в гене cI и мутацией в структурной части гена cro и отбирают для последующего культивирования целевые клоны по способности к росту на селективных средах.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что клетки E.coli трансформируют рекомбинантными плазмидами, содержащими фрагмент ДНК области иммунитета фага лямбда с интактными генами...

Номер патента: 1264578

Опубликовано: 30.12.1994

Авторы: Долганов, Кафиани, Свердлов

МПК: C12N 15/70

Метки: pgdp3, вектор, генов, клетках, чужеродных, экспрессии

ВЕКТОР PGDP3 ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ЧУЖЕРОДНЫХ ГЕНОВ В КЛЕТКАХEscherichia coli характеризуется следующими признаками: имеет длину около 4,6 тыс. п.о.; состоит из линейной формы векторной плазмиды pBRH4, фрагмента RFI ДНК фага размером 230 п.о., содержащего регуляторную область гена D и присоединенного к EcoRI-сайту плазмиды pBRH4;содержит в качестве генетических маркеров гены Apr и Tcr; сайты расщепления эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях от EcoRI-сайта: EcoRV 160 п.о. вправо, BamHI 350 п.о. вправо, Sal I 626 п.о. вправо, Bal I 1419 п.о. вправо, Pvu II 2041 п.о. вправо, Pst I 3584 п.о. вправо, сайты узнавания другими эндонуклеазами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях от...