Способ получения гибридного активатора плазминогена, содержащего область, ответственную за средство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного по

О ПО Од отки чемодифи- р -ной еосноватрия и +ф на плаоксида реду от- (Д его. рас- , 5 мМ и 0,1 М пластие натурацелью кстракт ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯРИ ГКНТ СССР ИСАНИЕ И(71) Сагами Кемикал Рисерч Сент, СентралГласс Компани, Лимитед, Ходогая КемикалКо., ЛТД, Ниппон Сода Компани, Лимитед;Ниссан Кемикал Индастриз, Лимитед, ТоиоСода Мануфакчуринг Ко., ЛТД (Л Р)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГИБРИДНОГОАКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА, СОДЕРЖАЩЕГО ОБЛАСТЬ, ОТВЕТСТВЕННУЮ ЗАСРОДСТВО С ФИБРИНОМ АКТИВАТОРАПЛАЗМИНОГЕНА ТКАНИ, И ОБЛАСТЬ, ОТВЕТСТВЕННУЮ ЗА ФЕРМЕНТНУЮ АК-. Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения различных видов нарушений или заболеваний сердечно-сосудистой системы.Целью изобретения является получение гибридного активатора плазминогена, со-. держащего область, ответственную за сродство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида.П р и м е р 1 (сравнительный). Изоляция поли (А)+РН К. ТИВНОСТЬ 3 НОГ ЛИПЕПТИДА(57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для профилактики и лечения нарушений или заболеваний сердечно-сосудистой системы, Целью изобретения является получение гибридного активатора плаэминогена, содержащего область, ответственную за сродство с фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида, Способ заключается в том, что путем трансформации клеток бактерий ЕасИегсЫа сс 11 рекомбинантными плазмидными ДНК рНАОЗ, или рНА 13, или рНА 23, или рНА 241., или рНА 114, или рНА 14 или рНАОО, или рНА 20, или рНА 211, или рНАОТ 1, культивирования трансформированных клеток в питательной среде при 25-45 С, сбора клеток и их разрушения выделяют продукт,1 Клетки клеточной линии рака гл ловека Оет гот 562 культивируют в цированной среды Еа 9 е с 10 сывороткой плода теленка, О,1 мМ н ных аминокислот, 1 мМ пирувата н 0,1 альбумина молочной кислоты стиковой чашке в присутствии ди углерода при концентрации 5. С деляют и по 2 мл денатурирующ твора (6 М тиоцианата гуанидина цитрата натрия, 0,5 саркозина 2-меркаптозтанола) прибавляют в ковую чашку диаметром 9 см для д ции клеточного материала с получения экстракта. Полученный з(рН 8,0), перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч с тем, чтобы инактивировать остаточные активные группы, После удаления надосадочной жидкости остаточный материал промывают попеременно пять раэ 20 мл каждого 0,2 М раствора глицина (р Н 8,0) и ацетатного буфера, содержащего 0,1 М ацетат натрия (рН 5,0) и 0 5 М ИаС 1, на стеклянном фильтре с тем, чтобы окончательно получить около 7 мл носителя, связанного с фибриногеном, Этот носитель вносят в колонку диаметром 16 х 70 мм.300 ед. бычьего тромбина растворяют в 3 мл дистиллированной воды, и раствор постепенно пропускают через колонку, е течение 2 ч для того, чтобы превратить фибриноген, связанный с носителем, в фибрин. Колонку затем уравновешивают 100 мкл бу. фера, содержащего 0,02 М трис-НС 1, рН 7,5, 0,15 м ИаС и 0,050 тритон Х. П р и м е р 28, Экстракт, полученный впримере 25 б, в количестве, соответствующем 5 мкг продукта экспрессии, регулируют до 100 мкл конечного жидкого объема, содержащего 0,02 м трис-НС 1, рН 7,5, 0,15 М чаС и 0,050 ь тритон Х, раствор пропускают через колонКу, Колонку промывают 40 мл буфера, содержащего 0,02 М трис-НС 1, рН 7,4, 0,15 М ИаС 1 и 0,05;4 тритон Х, элюируют элюирующим буфером, содержащим 2 М КОСМ, 0,2 М трис-НС 1, рН 7,4 и 0,0570 тритон Х - 100 с содержанием коллектора фракций. Каждую фракцию измеряют на активность активатора плазминогена при помощи фибринолитической активности на плазминогенсодержащей фибриновой чашке.фибринолитическую активность измеряют следующим образом. 0,1 г фибриногена типа 1 растворяют в 5 мл 0,06 М фосфатного буферного раствора и смешивают с 0,025 г агарозы, растворенной в 5 мл того же буфера, К смеси прибавляют бычий тромбин до конечной концентрации 1 мМ, и после перемешивания смесь выливают на чашку Петри диаметром 8,5 см, 10,мкл каждого образца наносят пятнами на фибриновую чашку, которую затем инкубируют при 37 С в течение 14 ч, Измеряют диаметрыразвившихся лизисных кругов. Из иэмерения коммерческой УК получают градуировочную кривую активности в зависимости от диаметра лизисного круга, на основании которой получают активность испытуемого образца.Из этих данных видно, что, если коммерческая УК не адсорбируется на фибрин-сефарозе, то гибридный полипептид, проявляющий активность активатора плазминогена, который содержит полную или часть крингл-области, ответственной за сродство к фибрину тканевого активатора плаэминогена человека, а также рекомбинантный тканевый активатор плазминогена, продуцируемый в Е,со 11 и коммерческий тканевый активатор плазминогена связываются фибрин-сефарозой,П р и м е р 29, Определение Ка с использованием синтетического субстрата Я - 2288.Я - 2288 растворяют в реакционном буфере, содержащем 0,1 М трис-НС, рН 8,07, 0,01 тритон Хи 0,5 М МаС 1, и получают растворы, содержащие 0,1, 0,25, 0,5, 0,75 и 1 мМ Я - 2288. Экстракты НАОЗ и НА 20, полученные в примере 25 б, и раствор коммерческой УК(по 10 мкл) растворяют реакционным буфером до конечного объема 400 мкл. К этим образцам прибавляют 2 мкл раствора 1 мг/мл плазмина и инкубируют при 37 С в течение 1 ч, переносят в ледяную воду, прибавляя к ним 2 мкл раствора 5 мг/мл ингибитора соевого трипсина, чтобы завершить реакцию с плазмином. Пять реакционных смесей получают для каждого испытуемого образца, ик каждой реакционной смеси прибавляют раствор Я - 2288 с различными концентрациями и инкубируют при 37 С в течение 1 ч, переносят в ванну с ледяной водой, прибавляя туда 50 мл 100-ного раствора уксусной кислоты, В качестве контроля используют 400 мкл реакционного буфера вместо 400 мкл испытуемого образца.Для каждой реакционной смеси измеряют поглощение при 405 нм с вычетом поглощения контрольного образца (величина А). Скорость реакции составляет Ч = А/60,Результаты показывают, что гибридный полипептид НАОЗ, состоящий из полипептидной области от 161-го Мес до 219-го 61 у, соответствующей приблизительно половине крингл-области тканевого активатора плазминогена человека, и полипептидной области от 150-го 61 п до 411-гоео человеческой проурокинаэы, где 157-РЬе замещен Азр, и данный гибридный полипептид НА 20, состоящий из полипептидной области от первого до 219-го Иу, включающей полную крингл-область тканевого активатора плазминогена человека и полипептидной обла-. сти от 150-го Оп до 411-го .ец человеческой проурокиназы, имеют такие же значения Ка, что и коммерческая УК.Это значит, что область, ответственная за ферментативную активность гибридного полипептида, имеет такую же характеристику, чу и соответствующая часть нативной35 40 45 50 55 УК, независимо от длины области, ответственной за сродство к фибрину, происходящее оттканевого активатора плазминогена, и независимо от присутствия или отсутствия точковой мутации в области серин-протеазы, т,е. у 157-й аминокислоты,П р и м е р 30, Конструирование плазмиды рНА 21.,10 мкг плазмиды рНА 20, построенной в примере 22, гидролизуют 100 ед. В 9и 96 ед. Рз 1, подвергают электрофорезу в 0,7- ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК размером 3400 п.о, Этот фрагмент ДНК обозначают как ДНК-фрагмент(Е).Кроме того, 4 мкг этой же плазмиды рНА 20 переваривают 100 ед, Вои 120 ед. Яса, подвергают электрофорезу в 0,7- ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК размером 630 п.о, Этот фрагмент ДНК обозначают как ДН К-фрагмент (Г),5 мкг плазмиды рМ ОТ 9. ре 1, полученной в примере 18, переваривают 30 ед. Рзт, подвергают электрофорезу в 0,7 -ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК размером 1200 п,о. Этот фрагмент ДНК частично переваривают 40 ед,. и выделяют Фрагмент ДНК около 1100 п,о, Этот фрагмент ДН К обозначают как ДН К-фрэгмент (С).Синтезируют следующие два олигонуклеотида: 5 АСТ 6 Т 6 АТ 6 Т 6 СССТССТ 6 САСА 66 ААЗ, 3 Т 6 АСАСТАСАС 666 АССАС 6 Т 6 ТСС 5,1 мкг каждого из этих олигонуклеотидов смешивают в 30 мкл раствора, содержащего 50 мкМ трис-НС, рН 7,6, 10 мМ МЯС 2 и 10 мМВ-меркэптоэтанола, нагревают при 70 С в течение 5,мин и затем охлаждают на льду, добавляют 20 ед, Т 4 полинуклеотидной киназы и инкубируют при 37 С в течение 1 ч, Реакционную смесь прогревают при 70 С в течение 2 мин и выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин После осаждения этанолом осадок смешивают с ДНК-фрагментом (=) и 5 ед. Т 4 ДНК- лигазы, инкубируют, экстрагируют фенолом и осаждают этэнолом, Осадок переваривают 10 ед. РЯр и 20 ед, В 9 , подвергают алектрофорезу в 1,0 О -ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК около 650 п,о, Этот фрагмент ДНК обозначают как ДНК- фрагмент (Н),Фрагменты ДНК(Е), (6) и (Н) смешивают и лигируют. Реакционной смесью трансформируют М 103 Е.со, Трансформэнты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащей плазмиду рНА 21 . Плазмиду рНА 21.,выделяют,5 10 15 20 25 30 П р и М е р 31. Конструирование плазмиды рНА 24 .5 мкг плазмиды рМОТ 4 ре 4 (пример 17) переваривают 50 ед. Рзт, подвергают электрофорезу в 0,7-ном агарозном геле и выделяют фрагмент ДНК размером 1200 п,о., который затем частично переваривают 40 ед. РЯр, выделяют фрагмент ДНК около 1100 п.о. и обозначают как ДНК-фрагментДНК-фрагменты (Е) и (6) получают в соответствии с методикой, описанной в примере 29. Эти ДНК-фрагменты (Е), (6) исмешивают и лигируют. Лигазную смесь используют для трансформации М 103 Е.соИ, Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащей плазмиду рНА 24, Плазмиду рНА 24 выделяют.П р и м е р 32. Конструирование плазмиды рНА 11,5 мкг плэзмиды рНА 21 (пример 29) переваривают 50 ед. Яса и 50 ед. Рзт подвергают электрофорезу в 1,0-ном агарозном геле, выделяют фрагмент ДНК около 1100 п.о. и обозначают его как ДНК-фрагмент .10 мкг плазмиды рНА 21 переваривают 100 ед. Осе, подвергают электрофорезу в 4,0-ном агарозном геле, выделяют фрагмент ДНК около 330 п,о. и обозначают его как ДНК-фрагмент (К),Синтезируют два олигонуклеотида; 5 АТ 6 АА 6 А 66 Т 6 АС 6 ТСАТ 6 ТС 3,3 ТАСТТСТССАСТ 6 СА 6 ТАСА 6 АСТ 5.2 мкг каждого из олигонуклеотидов смешивают, фосфорилируют 5-концы и отжигают. После осаждения этанолом отожженных олигонуклеотидов осадок смешивают с ДНК-фрагментом (К), и сшивают. После осаждения этанолом осадок переваривают 100 ед,Яса и 100 ед, Аат,. выделяют фрагмент ДН К около 250 п,о. Этот фрагмент ДН К обозначают как ДНК-фрагмент ( ).5 мкг плазмиды рМОТ 9 рт (пример 16) переваривают 59 ед. Аат и 50 ед; Рзт, подвергают электрофорезу в 0,7 о-ном агарозном геле, выделяют фрагмент ДНК около 3000 п,о, и обозначают его как ДНК-фрагмент (М), ДНК-фрагменты , ( ) и (М) смешивают и сшивают, . Реакционной смесью трансформируют М 103 Е,со, Трансфор- . манты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащей плазмиду рНА 11 . Плэзмиду рНА 11 выделяют в соответствии с традиционной методикой.П р и м е р 33. Конструирование плазмиды рНА 141.,5 мкг плазмиды рНА 24. (пример 31) переваривают 50 ед. Яса и 50 ед. Рзт, подвергают электрофорезу в 1,06-ном агарозномгеле и фрагмент ДНК около 1100 п.о. выделяют. Этот фрагмент ДНКобозначают какДНК-фрагмент (Й),ДНК-фрагментыи (М) получают всоответствии с методикой примера 32.Эти фргменты ДНК ( ), (М) и (й) смешивают и сшивают Т 4 ДНК-лигазой. Лигазной смесью трансформируют М 103 Е,со.Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на содержаниеплазмиды рНА 14 Плазмиду рНА 14 выделяют.П р и м е р 34. Конструирование плазмиды рНА 01,5 мкг плазмиды РНА 21 (пример 30) переваривают 50 ед. Есойи 50 ед. Рзт ,подвергают электрофорезу в 0,7-ном агарозном геле, и фрагмент ДН К около 330 п,о,выделяют. Этот фрагмент ДНК обозначаюткак ДНК-фрагмент (0).5 мкг плазмиды рНА 21 переваривают50 ед, Яса и 50 ед. РзО, подвергают электрофорезу в 0,70-ном агарозном геле, фрагмент ДНК околб 100 п,о. выделяют иобозначают его как ДНК-фрагмент (Р).10 мкг этой же плазмиды рНА 21. переваривают 50 ед, Есой и 50 ед. Яса, подвергают электрофореэу в 2,06-ном агарозномгеле, и фрагмент ДНК около 150 п.о. выделяют и обозначают как ДНК-фрагмент (С),Фрагменты ДНК (0), (Р) и (О) смешивают, сшивают Т 4 ДНК-лигазой смесью,трансформируют М 103 Е,со, Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на содержание плазмидырНА 01. Плазмиду рНА 01 выделяют.П р и м е р 35. Конструирование плаэмиды рНА 04Плаэмиду рНА 04. конструируют в соответствии с методикой примера 34, эа исключением того, что плазмиду рНА 24,построенную в примере 31, используютвместо плазмиды рНА 21,П р и ме р 36. Экспрессия и экстракциягибридного полипептида НРА 24 проявляющего активность активатора плазминогена,Плазмидой рНА 24 (пример 31) транс-формируют КУ 1436 Е,со, трансформантыкультивируют в 5 мл среды . с 50 мкг/млампициллина в пробирке при 30 С втечениеночи с перемешиванием 2 мл культурального бульона, инокулируют до 1 л средыс 50 мкг мл ампициллина в 5-литровой конической колбе, и культивируют при 30 С навоздушной качалке при 260 об/мин, переносят в инкубатор при 37 С. и культивируютсировать ген Н РА 24. гибридного активатор плазминогена - подобного полипептида.Культуральный бульон переносят, цент рифугируют, Клетки суспендируют в 1,0 мл 10 20 45 единица (МЕ) = (004 об/0,395)х 6,5, и ферментативной активности образца получаетсяприблизительно 120.П р и м е р 38. Экспрессия и экстракциядругих гибридных полипептидов, проявляю 50с в примерах 36 и 37. 25 30 35 40 5 ч при встряхивании с тем, чтобы экспресбуфера, содержащего 0,1 М МаС и 50 мМ трис-НС, рН 8,0, обрабатывают ультразвуком и центрифугируют. Осадок подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.Часть нерастворимой фракции суспендируют в 160 мкл раствора, содержащего 6 М гуанидингидрохлорид и 25 мМ трис-НС, рН 8,0, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, доводят до конечной концентрации 50 мМ трис-НС, рН 8,0 1 М гуанидингидрохлорида, 2мМ глютатиона восстановленного типа, 0,2 мМ глютатиона окисленного типа, 1 мМ ЭДТА и 0,10 Твин, инкубируют в течение 15 ч при комнатной температуре для получения,неочищенного экстракта,П р и м е р 37. Определение активности неочищенного экстракта НРА 24 с использованием синтетического субстрата Я - 2444.10 мкл сырого экстракта НРА 24. прибавляют к буферному раствору, содержащему 0,1 М трис-Н С рН 8,0 и 0,01 тритон Х-.100 до объема 99 мкл, К смеси прибавляют 1 мкл (1 мкг/мл) раствора плаэмина, инкубируют при 37 С в течение 15 мин, прибавляют 1 мкл раствора ингибитора соевого трипсина, тщательно перемешивают, прибавляют 0,7 мл буферного раствора, содержащего 2 мМ синтетического субстрата 3 - 2444 и 0,1 м трис-Н С 1, рН 8,0 .и 0,01 6 тритон Х - 100, и инкубируют при 37 С в течение 30 мин, после чего прибавляют 100 мкл ледяной уксусной кислоты,Измеряют поглощение реакционной смеси при 405 нм. Ферментативную активность в реакционной смеси вычисляют в соответствии с формулой: 1 международная щих активность активатора плазминогена.Методику, описанную в примерах 36 и 37, повторяют для плазмид рНА 21., рНА 11, рНА 14, рНА 01 и рНА 04., и получают результаты, аналогичные описанным Формула изобретения Способ получения гибридного активатора плазминогена, содержащего область, ответственную за сродство с. Редактор Н. Рогулич Заказ 1592 Тираж Подписное ЗНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рэушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 фибрином активатора плазминогена ткани, и область, ответственную за ферментную активность проурокиназного полипептида, заключающийся в трансформации клеток бактерий ЕзспегсЫа соИ рекомбинантными плазмидными ДНК рНА 20 и рНА 13, или рНА 23, или рНАОО, или рНАОЗ, или рНА 21., или рНА 241., или рНА 111., или рНА 14., или рНА 01., культивировании трансформированных клеток в питательной среде при 25-45 С, сборе культивиру емых клеток, их дезинтеграции, отделенииосадка, суспендировании, центрифугировании и выделении целевого продукта.5 3ОСССССОСАСАООААССОЭти последовательности комплементарны относительно частичных последовательностей к ДНК, кодирующей активатор 35 плаэминогена меланомы, (Зонд 1: количество нуклеотидов 154 - 173; зонд 1: количество нуклеотидов 1099-1116).Фрагменты мечены 32 Р - у - АТФ у 5-конца. Меченные зонды гибридизируют 40 на фильтре в гибридизационном буферном растворе, состоящем из 900 мМ йаС 1, 90 мМ цитрата натрия, ОепЬап при 45 С втечение 20 ч с трансформантами Е, со 1, которые выращены на нитроцеллюлозном фильтре, 45 денатурированы щелочью, Нитроцеллюпозный фильтр промывают в растворе 300 мМ ИаС и 30 мМ цитрата натрия, накрывают рентгеновской пленкой для получения ауторадиограммы, и определяют клоны, 50 положительные к гибридизации. При использовании смеси, состоящей из зондов 1 и 1, из 5000 клонов выделяют 10 клонов, положительных к гибридизации, Среди укаэанных клонов, положительных к гибри дизации, обоими зондами гибридизированы один клон фага х 1776 Е.соИ(рО/РАЗ). Из указанного клона получают плазмиду рОРАЗ, х 1776 Е, со (рО/РАЗ), содержащий плазмиду рОРАЗ сдан на хранение в РЯ 8 вносят в раствор 5,7 М СэС и центрифугируют, С 60 чашек выделяют 12 мг РНК. Затемполи (А) РНК очищают с помощью хроматографии на олиго-Т-целлюлозе и получаютпримерно 600 мкг РНК.П р и м е р 2 (сравнительный). Получениебиблиотеки к ДНК,2 мкг векторного праймера и 3 мкг поли(А) РНК смешивают и инкубируют 12 ед.обратной транскриптаэы. Затем встраивают олиго бС, гидролизуют рестриктазойНпб 11, отжигают и циклизуют. Реакционная смесь, полученная таким способом, хранится как библиотека кДНК при -20 С, Изреакционной смеси получают около 100000трансформантов, используя фаг х 1776 Е.со 1 в качестве компетентных клеток,П р и м е р 3 (сравнитепьный). Скриннинг.Для изоляции клонов, которые содержат плазмиду, несущую ген, кодирующийактиватор плазминогена-подобный белокДНК указанных трансформантов гибридизуют. В качестве зонда используют фрагменты синтетической ДНК следующейнукпеотидной последовательности:Зонд5 3ААТСООО САСОАТТТССТО,Зонд 1 5 10 15 20 25 30 ноября 1984 г. под депозитарным номеромРЕЯМ - Р - 7391.Последовательность кДНК состоит из2459 пар оснований, кроме поли (А) -последовательности, находящейся у 3-конца.Среди указанных пар оснований, 1548 пароснований кодируют 516 аминокислот. Этаобласть кодирования содержит дополнительно последовательность, кодирующуюактиватор созревшего плазминогена (числонуклеотидов 261 - 1703). Имеется 5-некодирующая область (нуклеотидное число 1155), находящаяся перед кодирующейобластью, и 3-некодирующая область (нуклеотидное число 1704 - 2459), находящаясяза кодирующей областью.П р и м е р 4(сравнительный). ПолучениемРНК,20 г клеток почечной ткани, замороженных при -80 С, раэмельчают в атмосфережидкого азота, суспендируют в 80 мл, 5 Мтиоцината гуанидина, 0,5,4 М-лауроилсаркозина натрия, 25 мМ тартрата натрия,0,1 М меркаптоэтанола и 0,1 ь антивспенивателя (раствор А). Сусгензию гомогенизируют и нуклеиновую кислоту отделяютиньекционной иглой типа 20 О. 24 мл раствора распределяют на 12 мп 5,7 М СэС 1,и после центрифугирования выделяют неочищенную РНК.Всю РНК растворяют в 2;4-ном растворе ацетата калия, прибавляют два обьемазтанола, выдерживают в течение ночи при-20 С и центрифугируют.Поли (А) РНК выделяют и очищают хроматографией на колонке с олиго (д 1)-целлюлозой. 10 г тканевых клеток почки даютоколо 3 мг всей РНК, от 2 до 3;6 которойпредставляет собой поли (А) Р Н К.П р и м е р 5 (сравнивательный), Конструирование библиотеки кДН К(1).Синтез кДНК проводят с использованием 40 мкг поли (А) РНК, полученной в сравнительном примере 4.При использовании.в качестве праймера 40 мкг олиго (дТ) 12-18 для синтезапервой цепи проводят реакцию с 40 ед. обратной транскриптазы в течение 2 ч при42 С. Матричную РНК удаляют с помощьющелочи и проводят синтез второй цепи со100 ед, фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 Е,со 11.После удаления шпилечной петли с помощью О нуклеаэы цепь (ДП)1 о-го присоединяют к 3-концу двухцепочечной кДНК спомощью терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы и получают около 400 мгдЦ-концевой кДН К.Эту ДНК сшивают с 800 мг ДНК векторарВВ 322 по сайту Рзт 1, трансформируют в20 Е,со 1 Х 776, Таким образом получают библиотеку кДНК(1), состоящую из примерно2 х 10 тетрациклинустойчивых и ампицил 5линчувствительных трансформантов,П р и м е р 6(сравнительный). Получение 5синтетических олигомеров ДНК для скрининга библиотеки кДНК.Синтезируют фосфотриэфирным методом следующие 16 различных олигомеровДНК, состоящих из 14 нуклеотидов, комплементарных иРНК, которая соответствуетаминокислотной последовательности человеческой урокиназы (УК)ААССААООТТОАТТ,ААССААООТТООТТ, . 15ААССАОООТТОАТТ,ААССАСООТТОАТТ;ААССАСООТТООТТ,ААССАТООАТТОАТТ,ААССАТООТТООТТ,ААССААООСТОАТТ,ААССААООСТООТТ,ААССАОООСТОАТТ,ААССАОООСТООТТ,ААССАОООСТОАТТ, 25ААССАСООСТООТТ,ААССАТООСТОАТТ;ААССАТООСТОАТТ,ААССАООСТТООТТ,Эти 16 олигомеров далее обозначают. 30как УК зонд 1.Для использования в качестве проверочных зондов таким же образом синтезируют следующие 8 различных олигомеровДНК, состоящих из 14 нуклеотидов, комплементарных к иРНК, которая соответствуетМеР, Тгу, Азп, Азр, Рго5 ООАТСАТТАТАСАТ 3ООАТСОТТАТАСАТ,ООАТСОТТОТАСАТ, 40ООАТСАТ ГОТАСАТ,ОООТСАТТАТАСАТ,ОООТСОТТАТАСАТ,ОООТСОТТОТАСАТ,ОООТСАТТОТАСАТ, 45Эти 8 олигомеров обозначают как УКзонд И.Для получения зондов, применяемыхдля гибридизации колоний, в УК зонды и 1в 5-конец введена радиоактивная метка, 50П р и м е р 7 (сравнительный). Скринингбиблиотеки кДН К(1).1, Скрининг.Автоклавированный нитроцеллюлозный фильтр помещают наВ-агаровую среду, содержащую 15 мкг/мл тетрациклина,среду инокулируют трансформантами, приготовленными в сравнительном примере 5так, чтобы обеспечить рост примерно 2000колоний трансформантов, После 8 ч инкубации при 37 С колонии реплицируют на два нитроцеллюлозных фильтра, которые инкубируют еще 3 ч при 37 С. Исходный нитроцеллюлоэный фильтр используют как эталонный, а два вторичных фильтра переносят на .В-агаровую среду, содержащую 15 мкг/мл тетрациклина и 100 мг/мл хлорамфеникола, инкубируют в течение ночи при 37 С, затем помещают над 0,5 М йаОН и 1,5 м йаС на 3 мин, чтобы вызвать лизис колоний и денатурацию ДНК, и после нейтрализации над 0,5 М трис-НС 1, рН 7,6 и 1,5 М йаС высушивают на воздухе в течение 2 ч при 80 С.После промывания фильтров в 4 хЯЯС в течение 30 мин при 60 С проводят прегибридизацию в 4 хЯЯС, 10 х ОепйагФ и 50 мкг/мл денатурированной ДНК Е,со 1, в течение 1 ч при 60 С, После добавления 0,1 мМ АТФ и УК зонда 1 с радиоактивной меткой проводят гибридизацию в течение 16 ч при 37 С, промывают 6 - 8 раз в 4 хЯЯС при 39 С фильтры, сушат на воздухе и подвергают скринингу на трансформанты, гибридизирующиеся с УК зондом 1, получают 21 клон-кандидат иэ 8 х 10 колоний. Плазмиды этих клонов далее обозначают как плазмиды рКУО 1 - РКУО 21.Полученные 21 клон-кандидат обрабатывают аналс 1.ично описанному и получают клоны, гибридизирующиеся с УК зондом 11. Плазмиды в этих клонах далее обозначаются как плазмиды рКУО и 21.2. Характеристики ДНК плазмиды рКУО 21,После расщепления ДНК плазмиды рКУО 21 различными эндонуклеазами рестрикации и субклонирования их в М 13 ар 8 проводят определение нуклеотидной последовательности. При сопоставлении этой последовательности с хорошо известной аминокислотной последовательностью УК подтверждают, что, хотя кДНК содержит полную область кодирования низкомолекулярной УК, но отсутствует около 100 п.о. ДНК в 5-конце области кодирования высокомолекулярной УК.П р и м е р 8 (сравнительный). Конструирование библиотеки кДНК,На основе нуклеотидной последовательности, определенной в п,2 примера 7, синтезируют фосфотриэфирным методом следующий олигомер ДНК;5 СТСААСАССАТСАСА 3,состоящий из 15 нуклеотидов, комплементарных послед 8 овательности иРНК, которая соответствует Зег, Азр, А 1 а, 1.ео, 61 цИспользуя 100 мкг поли(А) РНК в качестве матрицы, синтезируют первую цепь. кДНК с помощью 100 ед, обратной транскриптазы вместе с 1 мкг 5- р-меченым32праймером с последующим синтезом второй цепи с помощью фрагмента КленоваДНК-полимеразы с 1 Е.со. ОднонитевуюДНК расщепляют Я 1 нуклеазой и дЦ-цепьдобавляют к 3-концу, используя терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу. После совместной ренатурации этойдЦ-хвостовой вставки и дГ-хвостового вектора рВВтрансформируют Е.соИ х 1776,получая библиотеку кДНК(11), состоящуюпримерно из 5 х 10 трансформантов.4П р и м е р 9 (сравнительный), Скринингбиблиотеки кДНК(И),Трансформанты, полученные в примере. 8, подвергают гибридизации по методике,описанной в п.1 примера 7, В данном случаев качестве зонда используют фрагмент расщепления 150 п.о. Рзт 1-Вд 1115, из рКУО 21с радиоактивной меткой, введенной методом трансляции, Гибридизацию проводятпри 60 С.Фильтр. сушат на воздухе после промывания два или три раза 2 хЯЯС при 60 С иклоны, гибридизирующиеся с указаннымзондом, обнаруживают с помощью авторадиографии, Получают восемь положительных клонов. Плазмиды в этих клонах далееобозначают как плазмиды рРЕ 1 - рРЕ 8. Прирасщеплении ДНК этих плазмид рестриктазой Рва подтверждают, что плазмида рРЕЗсодержит вставку кДНК длиной приблизительно в 420 п.о,Фрагменты, полученные расщеплениемДНК плазмиды рРЕЗ эндонуклеазной рестрикции Рва, субклонируют в М 13 рв 8 ипроводят определение последовательности оснований. Результаты подтверждают,что кДН К содержит не только кодирующуюобласть достаточной длины на 5-концевой стороне гена проуроклиназы, но также 5-нетранслируемую область длиной66 п.о, вверх от кодона инициации трансляции АТО,П р и м е р 10 (сравнительный), Конструирование гена проурокиназы,5 мкг ДНК плазмиды рКУО 21, содержащей полную область кодирования урокиназы, расщепляют эндонуклеазамирестрикции В 9111 и Нпб 111 (по 10 ед,) ивыделяют фрагменты ДНК около 5,7 т.п.о.При расщеплении ДНК указанной плазмиды рКУО 21 рестриктазами 89 И и.йсо(10 ед получают фрагмент ДНК в 66 п.о. 5мкг ДНК плазмиды рРЕРЗ, полученной впримере 6, расщепляют 10 ед. рестриктаэйсо 1 и Н 1 пс 111, получая фрагмент ДНК около 1,1 т,п.о. Эти три различные фрагмента ДНК повторно экстрагируют смесью фенол/хлороформ, осаждают 2 об, этанола дляочистки и извлечения ДНК, Эти фрагменты5 ДНК сливают вместе с помощью Т 4 ДНКлигазы и трансформируют в Е.со х 1776,Образующиеся трансформанты подвергают скринингу методом быстрой изоляции,используя процедуру щелочного лизиса, и10 получают клон, несущий плазмиду рКУО 22,которая содержит полный ген проурокиназы.П р и м е р 11 (сравнительный). Определение нуклеотидной последовательности15 сайта вставки плазмиды рКУО 22.Нуклеотидную последовательность сайта вставки плазмиды рКУО 22 определяютметодом Максама-Гилберта и методом обрыва дидезокси-цепи перед субклонирова 20 нием в М 13 гпр 8,Вставка состоит из 5-некодирующегообласти 66 п,о., главной последовательности АТО(Мет) - ООС (С 1 у), области кодирования проурокиназы АОС (Яег) - СТС ( ео),25 кодона окончания трансляции ТСА (ХХХ) и3-нетранслируемого кодона за стоп-кодоном,П р и м е р 12 (сравнительный), Синтезгена проурокиназы, модулированного в30 5-концевой области.Кодон ы 5-терминальной области нативной кДНК, кодирующей проурокиназу,замещают так, чтобы обеспечить эффективную экспрессию гена проурокиназы в Е,соП35 за ЯО последовательностью гена С 230, полученного изРсеобоаопаз рцтЫе, кодон начала трансляции АТО(Мет) встраиваютперед кодоном первой аминокислоты (Яег)так, что проурокиназа может прямо экс 40 прессироваться; и сайт Аат распознаванияэнзима рестрикции соединяется с кодирующей областью рядом с ЯО последовательностью вектора экспрессии. Для этогодвунитевой олигомер ДНК синтезируют45 фосфотриэфирным методом. Эта двухнитевая синтетическая ДНК имеет на одномконце сайт Аат 11 для введения его в вектор ина другом конце сайт Та 9 1 для присоединения его к гену проурокиназы.50 Фосфотриэфирным методом синтезируют следующие однонитевые олигомерыДНК, содержащие соответственно 29,15 и20 нуклеотидов:5 сдтадбсддсбдбстссдссд 66 ттссбт з55 3 Т 6 СА 6 ТАСТС 6 ТТ 6 С 5,3 ТС 6 А 66 ТССТССАА 66 СА 6 С 51 мкг каждого из синтетических олигомеров ДНК нагревают в течение 2 мин при95 ОС, фосфорилируют на 5-конце с помощью Т 4 полинуклеотидкиназы и очищаАатИ Зэт Вэт Тад 1 10 15 20 30 ЕЕ й М-Р35 40 45 50 55 ют. После сушки очищенный материал растворяют в 50 мкл 20 мМ трис-НС 1, рН 7,6 и 10 мМ МдС 12, ренатурируют путем нагревания в течение 2 мин при 95 С, охлаждают медленно до комнатной температуры и выдерживают раствор в течение ночи при 12 С, получая следующую двунитевую ДНК5 сАтаАасААсаАсстссАссАааттссат 3, з тасдатдстсаттастсадаатаатссддаасдас,5 мкг ДНК плазмиды рКУ.122 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Вд 1 И и Аат 1,фрагмент ДНК размером 5,7 т,п.о. Другие 5 мкгДНКтой же плазмиды рКУО 22 расщепляют эндонуклеазами рестрикции Рзт и Вд И и получают фрагмент ДНК около 400 п.о. Этот фрагмент снова расщепляют эндонуклеазой рестрикции Тад 1 и извлекают фрагмент ДНК размером 260 п.о,фрагменты ДНК извлекают, очищают экстракцией смесью фенол/хлороформ и осаждают 2 об.этанола,Эти два фрагмента ДНК и указанный двунитевый синтетический олигомер ДНК сшивают вместе с помощью Т 4 ДН К-лигазы и продукт сшивания используют для трансформации Е,соИ х 1776. Трансформанты подвергают скринингу методом быстрой изоляции по процедуре щелочного лизирования и получают клон Е,сод х 1776/рКМО 1, несущий плазмиду рКМ 1.11, которая содержит модицифицированный ген проурокиназы. Клон Е,со 1 х 1776-рКМ.11 депонирован в ЕЯ.1.11 января 1985 г., как П р и м е р 13 (сравнительный), Конструирование плазмиды рМнТ 41,Плазмиду экспрессии рМнТ 41, содержащую ген проурокиназы человека без точечной мутации, конструируют из указанной плазмиды рКМ 01 и вектора экспрессии рТСМ 1. Е,со 11 М 103/рТСМ 1, депонирован с ЕЯ.1,17 августа 1984 гкак ЕЕЯМ Р - 7779.5 мкг плазмиды рКМО 1 из примера 12 расщепляют 10 ед эндонуклеазы рестрикции Аат( и дайджест выделяют после обработки фосфатазой кишечника теленка (ФКТ). Другие 5 мкг плазмиды рТСМ расщепляют 10 ед, эндонуклеазы рестрикции Аат 1 и выделяют электрозлюированием фрагмент ДНК размером 500 п.о. Эти два фрагмента ДНК очищают повторной экстра.цией смесью фенол/хлороформ и осаждением этанолом. Оба фрагмента ДНК связывают Т 4 ДНК-лигаэой и трансформируют в Е.соИ М 103, Трансформанты подвергают скринингу и получают клон, несущий плазмиду рМоТ 11, в которой сас промотор.(оператор) и последовательность С 230 ЯО, имеют правильную ориентацию по отношению к генупроурокиназы.Далее 5 мкг плазмиды рКК 223-3 расщепляют 10 ед. эндонуклеазы рестрикцииН 1 пд И и дайджест обрабатывают фосфатазой кишечника теленка.1 мкг плазмиды рМн Т 1, расщепляют 4ед. эндонуклеазы рестрикции Ога 1. Фрагмент расщепления и 1 мкг 5-фосфорилированного Н 1 пд 111 линкера (дСААОСТТО)сшивают с помощью Т 4 ДНК-лигаэы. Раствор экстрагируют равным объемом смесифенол/хлороформ и ДНК осаждают добавлением 2 об. этанола, Осадок собирают при16000 об/мин и 4 С и сушат,Образующийся фрагмент расщеплениярМ и ТИ и фрагмент расщепления НпбИ 1указанной рКК 233-3 сшивают, используяТ 4 ДНК-лигазу и трансформируют в Е.соИМ 103. Трансформанты подвергают скринингу и получают клон Е со М 103/рМ Т 21.содержащий плазмиду рНнТ 21.5 мкг плазмиды рМнТ 21 расщепляют10 ед. эндонуклеаз рестрикции ЯрЫ и ТйИ 1 и после экстракции смесью фенол/хлороформ ДН К осаждают эта нолом.Извлеченную таким образом ДНК снабжаюттупым концом при использовании Т 4.полимеразы в присутствии 0.1 мМ дГТФ, дЦТФи ТТФ и рециклиэируют Т 4 ДНК-лигазой.ДНК трансформируют в Е,со 1 1 М 103 иобразуют. колонии наВ-агаровой среде,содержащей 50 мкг/мл ампициллина.Трансформанты подвергают скринингу иполучают клон Е. со 111 М 103/рМнТ 4.П р и м е р 14(сравнительный), Введениеспецифических мутаций замещения основания в кодон для аминокислоты 157 прииспользовании фага М 13.1. Получение однонитевой. матричнойДНК,1 мк каждой из пламиды рКУн 22 и двунитевой ДНК фага м 13 ар 8 расщепляют в20 мкл раствора, содержащего 10 мМ трисНС 1, рН 7,5 7 мМ МдС 12, 7 мМ 3-меркаптоэтанола и 50 мМ йаС 1, втечение 1 ч при 37 Спри использовании 5 ед. Рзт, Соответствующие фрагменты ДН К извлекают после об.работки фенолом и осаждения этанолом.Фрагменты ДНК сшивают в 20 мкл раствора, содержащего 66 мМ трис-НО, рН 7,5, 5мМ МдС 2, 5 мМ ДТТ и 1 мМ АТФ в течение16 ч при 12 С при использовании Т 4 ДНКлигазы и трансформируют в Е.соИ 1 М 103,Трансформанты помещают на чашки с мягким агаром, содержащим 0,02% Х - да 1 и1 мМ.1 РТ 6, инкубируют в течение ночи при37 С; ОднонитевуюДНК получают иэ белыхпятен, образованных рекомбинантом.При использовании некоторых из образующих однонитевых ДНК в качестве матрицы определяют последовательность оснований. Получены цепь кодирования и цепь антикодирования. 52. Введение специфической мутации замещения основания.При использовании Образующейся рекомбинантной ОДнонитевой ДНК фага М 13.10 (цепь антикодирования гена УК в качестве матрицы проводят введение сайт-направленной мутации с помощью олигонуклеотидного мутагена,155 66 ССС 6 СС 6 АтААСАттА 3 .Хотя этот олигонуклеотид из 18 оснований комплементарен к гену УК в одинонитевой матричной ДНК, два основания изменены, 20 при этом кодон ТТТ, который определя от фенилаланин, заменен нэ кодон САТ, определяющий аспарагиновую кислоту,При использовании указанного олигонуклеотида в качестве праймера синтезируют и ч 1 го двухнитевую ДНК. При этом 2 ммоль 5-фосфорилированного праймера добавляют к 0,5 ммоль матричной однонитевой ДНК и смесь инкубируют в 10 мкл 30 раствора, содержащего 7 мм трис-НС (рН 7,5) 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ КаС и 7 мМ М 9 С в течение 20 мин при 60 С с последующим инкубированием в течение 20 мин при 23 С. К реакционной смеси добавляют 35 по 0,5 мМ дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ до обьема 20 мкл и 2 ед. фрагмента Кленова ДНК-полимеразы. Смесь инкубируют в течение 20 мин при 23"С и после добавления 2 мкл 10 мМ АТФ и 1 ед, Т 4 ДНК-лигазы в 40 течение ночи при 12"С, Смесь непосредственно трансформируют в Е.со 1 М 103, Получают около 10000 фаговых пятен на микролитр указанной реакционной смеси,После переноса образующихся пятен из 45 мягкой агаровой среды нэ нитроцеллюлозный фильтр фильтр сушат в вакууме в течение 2 при 80 С, гибридизируют с олигонуклеотидным праймером в качестве зонда, меченным Р. Фильтр промывают в 6 хЯЯС 50 при 52 С и пятна мутантного фага, дающие положительные сигналы, выделяют с помощью авторадиографии, Из мутантного фага получают ДНК мутантного фага двунитевого типа (ргп 3). При использовании ДНК 55 мутантного фага в качестве матрицы определяют нуклеотидную последовательность мутантной ДНК и подтверждают появление мутации замещения одиночного основания. Кроме того, возможно заместить колон т. Г, определяющий фенилалани 3 й ц ",3 ( 1 ю" ло)кении, На 6 и - определяюц 1 ий кодс н САА изи использовании следуюц 1 его олигонуклеотида:5 66 СССС 6 С 6 ААААСАТА 3в качестве мутагена,П р и м е р 15(сравнительный), :,Онструирование плазмиды рМц Т 41 рп;3,После полного расщепления 10 мкг двухнитевой ДНК мутанта М 13(ргп 3) с помощью Ры выделяют фрагмент длиной около 1,2 т.п.о. 10 мкг плазмиды рМц 41 частично расщепляют Рз и выделяют фрагмент длиной около 4,6 т,п,о из которого удаляют фрагмент длиной около 1,2 т,п,о,КажДый из Двух указанных фрагментОв выделвот обработкой фенолом и осаждением этанолом, осадки смешивают. Смесь лигируют в течение ночи при2 С Т 4 ДНК- лигазой и трансформируют в Е,со 1 НВ 101, транс(рормаюы скринируот и голучают клон, содерч(ащий нлазмиду рМц Г 4. ргп 3 Е.со 1 х 1776/рМц Т 41 ргп 3, несущий гглазмиду рМц Т 41 ргп 3, депонирован 11 июля 1985 г, с, Р,(.1, как ГЕРМ-Ри помещен на международное дипонирование 22 января 1986 гкак РЕЯМ ВРв соответствии с гголожениями Будапештского договога.П р и м е р 16(сравнительный). Конструирование плазмиды рМц 141 ргп 1,Получают мутантный двунитевый фаг М 3 РГргп 1, содержащий фра мег ДНК в ко.тором кодон ААА для 135-го лизина мутирован к кодону САА для глютамина, по той же методике, что описана и примере 4, за исключением того, что использукп следу,ощий синтетический олигонуклеотид;5 БАТ 66 АСАААА 6 ССС 3Затем из фага М 13 ВГ ргп и плазмиды рМц Т 41 конструируют РМц 41. р п 1 по гой же методике, что описана в примере 15,П р и м е р 17 (сравнительный). Конструирование плазмиды рМи Т 41 ргп 4,Мутантный двунитевой фаг, содержащий фрагмент ДНК, в котором кодон ААА для 135-го лизина заменен на нодон глютаМИНа., ПОЛУЧаЮт ПО МетОДИКЕ, ОЛИСаННОИ в примере 14, за исключением того, что используют синтетический олигонуклеотид5 6 АТ 66 АСАААА 6 ССС 3Из полученного таким образом мутант- ного фага получаюпг однонитевый фаг по методике, описанной в примере 14. При использовании однонитевого фага в кэчест- ВЕ МатрИцЫ КОдОнГт дяя 157"ГП (ЬрНИЛЭЛЭ- нина, затем мутируют к колону 6 АТ для аспарэгиновой кислоты согласно описан нои методике за искл,(уением тою цт; и5 мкг таким образом полученной плаэмиды РМц Т 84 расщепляют 50 ед. Н 1 пб 1.После экстракции фенолом и осаждения 40этанолом осадок обрабатывают 1 ед. фрагмента Кленова в 20 мкл буфера, содержащего 50 мМ трис-НС 1, рН 7,2, 10 мМ М 9 С 2,01 мМ ДТТ и 80 мкМ сй ТРЯ при 22 С втечение 30 мин, После экстракции фенолом 45и осаждения этанолом осадок обрабатывают 5 ед. Т 4 ДНК-лигазы в 20 мкл буфера,содержащего 1 мкг. линкера рЯз Т 1 и 66 мМтрис-НС 1, рН 7,6, 6,6 мМ М 9 С 12, 10 мМДТТ и 1 мМ АТФ при 12 С в течение 2 ч, 50экстрагируют фенолом и осаждают этанолом. Осадок расщепляют 50 ед, РзО в т100 мкл раствора, содержащего 20 мМтрис-НС 1, рН 7 5, 10 мМ М 9 С 2 и 100 мМ ИаСпри 37 С втечение 2 ч. Реакционную смесь 55 сподвергают электрофорезу в 0,7-ном агароэном геле в извлекают фрагмент ДНК размером 4300 п,о,5 мкг плаэмиды рМц Т 41. ре расщепляют 50 ед. Рзт 1, Реакционную смесь затем д пользуют следующий синтетической олигонуклеотид,5 ООССССОСОАТААОАТТА 3 для получения мутантного двунитевого фага М 13 ВРре 4, содержащего фрагмент ДНК, в котором кодон ААА для 135-того лизина заменен на кодон САА для глютамина и кодон для 157-го фенилаланина мутирован на кодон для аспарагиновой кислоты..Затем из полученного таким образом мутантного фага М 1 ЗВРре 4 и плаэмиды рМц Т 41. конструируют плазмиду рМц Т 41 ре 4 согласно методике, описанной в примере 15.Пример 18 (сравнительный). Конструирование плаэмиды рМц Т 91 ре 1.5 мкг плазмиды рМц Т 41 расщепляют 50 ед. Аса 1 и 100 ед, Азу 1 в 100 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 7 мМ МдС 12, 125 мМ йаС 1, 7 мМ ф-меркаптоэтанола при 37 С в течение 6 ч. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 0,7- ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 5500 п,о. Другие 10 мкг той же плазмиды рМц Т 41. расщепляют 50 ед. Аат 11 и 50 ед, Яеа 1. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 2,00 -ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДН К 55 п.о, Полученные таким образом два фрагмента ДНК сшивают 5 ед, Т 4 ДН К-лигазы. Реакционную смесь используют для трансформации Е,соИ. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плазмиду рМц Т 81, и из отобранных колоний выделяют плазмиду рМц Т 81 . 5 10 15 20 25 30 35 подвергают электрофорезу в 0,76-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 1200 п.о,Фрагменты ДНК смешивают и сшивают, используя 5 ед. Т 4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь трансформируют в Е,соИМ 103, Трансформанты, устойчивые к ампициллину, скринируют на колонии, содержащие плазмиду рМц Т 91 ре 1, и плазмиду рМцТ 9 ре 1 выделяют.П р и м е р 19. Конструирование плазмиды рО РАТ 2.50 мкг плазмиды рО РАЗ расщепляют75 ед. 8911 в 200 мкл буфера, содержащего10 мМ трис-НС 1, рН 7 5, 7 ММ МЫС 2, 100 мММаС и 7 мм 3-меркаптоэтанола при 37 С втечение 4 ч.После осаждения этанолом осадок инкубируют с 5 ед. фрагмента Кленова в 50 мклбуфера, содержащего 50 мМ трис-НС 1, рН7,2, 10 мМ М 9 С 2, 0,1 мМ ДТТ и 80 мкМ при22 С в течение 30 мин. Реакционную смесьподвергают электрофорезу на 0,7-номагарозном геле и извлекают фрагмент ДНКразмером 1800 п.о. Этот фрагмент ДНКобозначается как фрагмент ДНК (А),10 мкг плазмиды рУ ТОЗ расщепляют 20ед, За 1, осаждают этанолом, обрабатывают2 ед. фрагмента Кленова, После осажденияэтанолом осадок обрабатывают щелочнойфосфатазой, фенолом и этанолом. Осадокрастворяют в 20 мкл раствора, содержащего10 мМ трис-НС (рН 7,5) и 1 мМ ЭДТА. 5 мкгэтой ДНК и 5 мкг фрагмента ДНК(А) обрабатывают 10 ед. Т 4 ДНК-лигаэы. После осаждения этанолом осадокрасщепляют 15 едС 1 а 1. После осаждения этанолом осадокрасщепляют 15 ед. Вае Н 1. После осажденияДНК этанолом осадок обрабатывают 2 ед.фрагмента Кленова. Реакционную смесьподвергают. электрофорезу в 0,7-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК размером 2000 п.о, Этот фрагмент.ДНКобозначают как фрагмент ДНК (Б).2 мкг плазмиды рК 12 расщепляют 10ед, Яа 1. После осаждения этаноломосадок обрабатывают 20 ед. фрагментаКленова, осаждают этанолом, осадок обрабатывают щелочной фосфатазой. После обработки фенолом проводят осаждениеэтанолом. Осадок растворяют в 20 мкл расвора, содержащего 10 мМ трис-НС (рН 7,5)и 1 мМ ЭДТА, 1 мкг этой ДНК и 1 мкг фрагмента ДНК (Б) лигируют. Реакционнуюмесь используют для трансформации Е.соИ1 М 103, Трансформанты, устойчивые к ампициллину, скринируют из колоний, содержащих плаэмиду рОРАТ 2, и выделяют ДНК.П р и м е р 20. Конструирование плазмиы рНАОО.510 5 мкг плазмиды рР ЕЗ (такая же как РМО Т 41 ) расщепляют 10 ед. РЧО 1. После осаждения этанолом осадок расщепляют 10 ед. Есой 1. Реакционную смесь подвергают злектрофорезу в 1,2-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 2000 п.о., который обозначают как фрагмент ДНК (А).10 мкг плаэмиды расщепляют 15 ед. РЧО 1, а затем 15 ед, ВагпР. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 1,2- ном агарозном геле и извлекают фрагменты ДН К около 2300 п.о. и около 1346 п.о. ф рагмент ДНК около 2300 п,о, обозначают как фрагментДНК(Б). 2 мкг фрагмента ДНК 1346 п.о. расщепляют 5 ед. ВавН и подвергают электрофорезу в 1,2-ном агарозном геле, извлекают фрагмент ДНК около 75 Оп.о., и обозначают как фрагмент ДНК (В),10 мкг плазмиды рОРАТ 2, сконструированной в примере 19, расщепляют 15 ед. Есор, подвергают эпектрофорезу в 1,2 Я,- ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 472 п.о., 2 мкл фрагмента расщепляют 1 ед. Н 1 пс 1111, подвергают электрофорезу в 50 ПААГ и извлекают фрагмент ДНК около 180 п.о. 1 мкг этого фрагмента и 1 мкг фрагмента ДНК(В) лигируют и с помощью электрофореза в 1,2%-ном агарозном геле извлекают фрагмент ДНК около 931 п.о. 1 мкг этого фрагмента ДНК, 1 мкг фрагмента ДН К(А) и 1 мкг фрагмента ДХ К(Б) сшивают 2 ед. Т 4 ДН К-лигазы. Реакционную смесь трансформируют в Е,со 1 1 М 103, Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плазмиду рНАОО, плазмиду выделяют.П р и м е р 21, Конструирование плазмиды рНАОЗ,Плазмиду рНАОЗ конструируют по методике, описанной в примере 20, эа исключением того, что вместо плаэмиды рРЕЗ используют плазмиду рРЕЗ рв 3 (такая же как рМц Т 4 ре 3).П р и м е р 22. Конструирование плазмиды рНА 20.Ф5 мкг плазмиды рНАОО, гидролиэуют рестриктазой Раей, осаждают этанолом. Осадок расщепляют 10 ед, Яса с помощью электрофореза в 1,20-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 1100 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как Фрагмент ДНК (А).5 мкг плазмиды рНАОО расщепляют 7 ед, рз 11, осаждают этанолом. Осадок расщепляют 10 ед, ЕсоВ 1, осаждают этанолом, осадок подвергают электрофорезу в 0,70 Д- ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 3500 п,о, Этот Фрагмент ДНК обозначают как Фрагмент ДНК(Б),15 201 25 30 35 40 45 50 55 15 мкг плазмиды рОРАТ 2, сконструированной в примере 19, расщепляют 20 ед. Вц 11. После осаждения этанолом осадок расщепляют 25 ед 5 са 1, подвергают электрофорезу в 1,2-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДНК около 625 п,о. Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДН К(В).10 мкг плазмиды рОРАТ 2 расщепляют 15 ед В 9111, после осаждения этанолом осадок расщепляют 10 ед ЕсоВ 1. Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 5 ПААГ и извлекают фрагмент ДНК около 150 п.о. Этот фрагмент ДНК обозначают как фрагмент ДНК (Г).1 мкг фрагмента ДНК(А), 1 мкг фрагмента ДНК(Б), 1 мкг фрагмента ДНК(В) и 1 мкг фрагмента ДНК(Г) сшивают с помощью 4 ед. Т 4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь используют дпя трансформации Е.со 11 1 М 103, Трансформанты, устойчивые, к ампицилпину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плаэмиду рНА 20. Плазмиду выделяют.П р и м е р 23. Конструирование плазмиды рНА 23.Плазмиду рНА 23 конструируют по методике, описанной в примере 22, за исключением того, что используют плазмиду рНАОЗ, сконструированную в примере 21, вместо плазмиды рНАОО, использованной дпя конструирования плазмиды рНА 20.П р и м е р 24. Конструирование плазмиды рНА 13.25 мкг плазмиды рНА 23 расщепляют 30 ед. 89111, После осаждения этанолом осадок обрабатывают 4 ед, фрагмента Кленова, обрабатывают фенолом и осаждают этанолом, Осадок расщепляют 30 ед. Рзт с помощью электрофореза в 0,70 ь-ном агарозном геле и извлекают фрагмент ДН К около 3500 п,о., обозначенный как фрагмент ДНК(А), и фрагмент ДНК около 1700 п,о., обозначенный как фрагмент ДНК(Б)7 мкг фрагмента ДНК(Б) расщепляют 10 ед, ЙЗа; Реакционную смесь подвергают электрофорезу в 1,206-ном агароэном геле и извлекают фрагмент ДНК около 1100 п.о., обозначенный как фрагмент ДНК(В), и фрагмент ДН К около 626 п.о., обозначенныйкак фрагмент ДНК(Г).2 мкг фрагмента ДНК(Г) расщепляют 5 ед Обе в 20 мкл буфера, содержащего 100 мм трис-НС (рН 7,5), 5 мм М 9 С 12, 100 мМ йаС и 7 мМ ф-меркаптоэтанола при 37 С в течение 8 ч. После осаждения этанолом осадок обрабатывают 1 ед,фрагмента Кленова, обрабатывают фенолом и осаждают этанолом, С помощьа электрофореза в 5)- ном полиакриламидном геле извлекают фрагмент ДНК размером 241 п,о. 1 мкг этого.фрагмента ДНК., 0,5 мкг фрагмента ДНК(В) сшивают с помощью 3 ед, 4 ДНК-лигэзы, Реакционную смесь используют для трансформации Е.со 111 М 103, Трансформанты, устойчивые к ампициллину, подвергают скринингу на колонии, содержащие плазмиду рНА 13, Г 1 лазмиду выделяют,П р и м е р 25. Зкспрессия и экстракция продукта гена,а. Е.со 11 У 103/ рО РАТ 2, 1 М 103/ РНАОО, М 103/рНАОЗ, 1 М 103/рНА 20, 1 М 103/рНА 23 иМ 103/рНА 13, полученные в примерах 19- 23, и Е,соИ 1 М 103/рУ. Т 41, полученную в примере 15, культивируют в 100 мл 1.В-среды с добавкой 100 мкг/мл ампициллина при 37 С со. встряхиванием, Когда оптическая плотность при 600 нм культурэльной среды достигает 0,6 к среде добавляют изопропил-Р, О-тиогэлэктопирэнозид до конечнойконцентрации 1 мУ и культивирование продолжают еще 5 ч, Культуральный бульон затем переносят в ледяную бана.Охлажденный бульон центрифугируют, чтобы собрать клетки, которые затем суспендируют в 50 мл буфера, содержащего 50мМ трис-НС 1 (рН 7,5) и 100 мл 1 чэС, Клетки собирают центрифугировэнием, повторно суспендируют в 10 мл того же буфера, После этого клетки разрывают ультразвуком и центрифугируют при 15000 об/мин в течеи 40 Сб. Осадки суспендируют в 10 мл буфера, содержащего 7,5 М оэствор гуанидингидрохлоридэ и 50 мМ трис-НО, рН 7,5, и отстаивают при комнатной температуре втечение 90 мин, центрифугируют при 10000об/мин в течение 10 мин, и надосадочную жидкость разбавляют до 5 мл раствора, содержащего 1 У гуанидингидрохлоридэ, 0,05 М трис-НС 1 рН 7,5, 2 мУ глютатиона восстановленного типа, 0,2 мУ глютатиона окисленного типа, и инкубируют в течение ночи при комнатной температуре. Затем раствор диэлизуют против 100 об, раствора, содержащего 10 мМ трис-НС 1, рН 7,4 и 0,4 мМ КэС 1, при 4 С в течение 4 ч, а потом против 100 об, рэствора, содержащего 10 мМ трис-НС 1, рН 7,4 и 0,1 м КэС 1, в течение 2 ч с получением экстракта,П р и м е р 26. Каждый осадок, полученный от каждого трансформанта в примере 25 а, в ког,ичестве соответствующем 1 мл культурэльного бульона, пополняют 20 мкл раствора, содержащего 3 М раствор мочевины, 0,08 М раствор дитиотрейтола и 1% додецилсульфат натрия, Смесь прогревэют при 95 С в течение 5 мин, центрифугируют,надосадочный слой (8 мкл) наслаивают на градиентный гель додецилсульфат натрия - полиакриламид и осуществляют электрофо 30 35 40 45 50 оез. После электрофореза гель окрашивают 1; красителем Соооаз 1 е и отмывают, Образец продукта экспрессии изМ 103/рНАОЗ, Е.со 11, который продуцирует гибридный активатор плазминогена - .подобный полипептид НАОЗ 1, сравнивают с образцом продукта экспрессии из 1 М 103/рОРАТ 2 Е.со 11, который продуцирует нативный тканевый активатор плазминогена человека (АПТ), и с образцом продукта экспрессии из М 103(рРЕЗ/рМц Т 41) Е,соП, который продуцирует нативную(УК)человека,при помощи электрофореза,Каждый образец, полученный описанным путем, подвергают градиентному электрофорезу в полиакрилэмидном геле в присутствии додецилсульфатэ натрия и разделенные протеины переносят на нитроцеллюлозный фильтр, который затем подвергают иммуноанализу, Для этого нитроцеллюлозный фильтр пропитывают в растворе 3%-ной желатины в ТВЯ (20 мМ трис-НС 1, рН 7,5, и 500 мМ КаС 1), после чего фильтр пропитывают в течение 2 ч в растворе, содержащем антисыворотку антитканевого активатора плазминогена, полученную из кролика, иммунизированного тканевым активатором плазминогена. Фильтр промывают раствором ТВЯ и затем пропитывают в растворе, содержащем энтикроличье антитело 196, меченое пероксидазой хрена. После тщательной промывки фильтр пропитывают в растворе, содержащем 20 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 500 мМ НаС 1, 0,06; 4-хлор-нафтола и 0,015 Н 202 в течение 5 мин. Результаты показывают, что гибридный полипептид иммунореактивен как к актисыворотке против тканевого активатора плазминогена, так и к антисыворотке против урокиназы,П р и м е р 27. Получение колонки сефарозы, родственной фибрину,3 г фибриногена растворяют в 100 мл связывающего буфера, содержащего 0,1 М МэНСОз, рН 8,3 и 0,5 М ИаС 1, цснтрифугируют и надосадочную жидкость используют для последующем реакции,2 г СЙВг - активировэнной сефарозы 4 В (РЬагааса) насыщают 30 мл 1 мМ НС 1 с получением около 7 мл носителя, Носитель загружают на стеклянный фильтр СЗ и промывают 4 раза 25 мл 1 мМ НС 1, Кроме того носитель промывают 20 мл связывающего буфера. Промытый носитель суспендируют в 20 мл того же буфера. Суспензию прибавляют к раствору фибриногена и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч с перемешиванием, Затем надосадочную жидкость удаляют. Остаточный материал пополняют 50 мл 0,2 М раствора глицинэ