Способ получения промотора для конструирования вектора и способ конструирования вектора для экспрессии белков в клетках

(72) Тамаш Лукааал, Имре 61 (14,09,88 чових, Пал В Борош и Габ етианер, Таелла Балико маш Г, 0067540, С 12 й 1 00,Гены любог любой тип инфо в бактериальны бинации и чтго стным спец сохранение чужо мации, которую осуществлены и лекул носителя,При экспрессииссии, ок,в ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТВЕДОМСТВО СССР%31Ведьесети Термекек Дья 2, , Вастег, 1987, 169, рр, 272-277.3. Авторское свидетельство СССР В 1510361, кл. С 12 Н 15/00, 1987, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОМОТОРА И СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ВЕКТОРА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ (57) Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии. Сущность изобретения заключается в том, что предлоИзобретение относится к новым векторам экспрессии, несущим новый тип промотров, которые конструируются из Р 2-промотора оперона рибосомальной РНК (ггп В-оперона) ЕэсЬегСЫа со и нескольких регуляторных последовательностей иэ асоперона Е, со, Кроме того, настоящее изобретение относится к методу конструирования вышеупомянутых новых промоторов и новых векторов экспресии,1836424 АЗжен способ получения нового типа промоторов для эспрессии чужеродного гена, которые конструируются из промотора Р оперона рибосомальной РНК Е.со и нескольких регуляторных последовательностей, происходящих от ас-оперона Е, со. Сущность изобретения заключается также в том, что осуществляют делецию большей части оперона рибосомольной РНК Е, со, встроенного в соответствующий вектор, соединяют вместе оставшуюся часть ггп-оперона, содержащего промотор Р 2. с начальной частью ас-оперона вне областей "-35" и "-10" и ниже их, с тем, чтобы в точке соединения последовательностей создать новый сайт расщепления эндонуклеазы чэ, Затем осуществляют делецию внутреннего элемента последовательности ТОСА из вновь созданного 851-сайта расщепления ираивают экспрессируемый структурный ген между указанными вновь созданными регуляторными последовательностями, 2 с.п. ф-лы, 10 ил. происхождения, несущие мации, могут быть введены клетки путем ДНК-рекомт.е. методом хорошо иэвеалистам. Устойчивое й ДНК и экспрессия инфорона кодирует, могут быть и помощи подходящих мат,е, векторов экспре ена, кодирующего белплазмиды в оставшемся уникальном Нпб 111-сайте) путем ВА 131-переваривания и рециркуляризации, Полученная плазмида эксдрессировала ген САТ в виде белка слияния и этот белок являлся двухфункциональным ферментом ( а -комплементация Р -галакторидазы и перенос ацетила на.хлорамфе- . н икол), При подходящих условиях аккумуляция этого белка слияния может до стигать до 80;4 от общего количества клеточногго белка. Обе вышеописанные ллазмиды обесеиаю устойчивость к хло рамфениколу клеткам хозяина в степени, зависящей от уровня индукции, 153. Другим продуцированным чужеродным геном бактериального происхождения был ген, кодирующий ген метилазы модификации в ВасИ 1 оз зрЬаег 1 соз (ВзрР 1 метилаза модификации). Несмотря на то, что продукт 20 этого гена сильно влияет на метаболизм клетки Е. соИ как ДН К-связывающий и мети-лирующий фермент, аккумуляция этого бел-ка может достигать 2-470 от общего количества клеточного белка, если использовать вектор экспрессии настоящего изобретения.В экспериментах, описанных в примерах настоящего изобретения были исполь зованы следующие материалы и способьпХимические вещества и другие препарать 1Лабораторные химические вещества, восновном, были куплены у фирм: ВЕАМА 1, 35ЯОМА и МЕВСК,32-Р-АТР и а 32 Р-бАТР - препаратысо специфической активностью; 100-150ТВдмМ поставлялись из Института Изотопов Венгрии (ИКТА, Бутапешт). 40Рескриктирующие эндонуклеазы ВавН 1, Нра 1,8 а 11, Вчо И, ЕсоВ 1, Взр 1, Н 1 пб И 1,Рз 1, 891 И, ХЬа 1, Езр И были получены изНаучно-исследовательского.биологичеыского центра Академии наук Венгрии в соОтветствии с описанными способами(Методы Энзимологии, Еб. Огоззвапп Ч.Мо 1 баче. чо 65, рр. 89-180). Рестриктирующие эндонуклеазы С 1 а 1, Йо 1, Нпа 1 были 50получены из 81 о 1 аЬ, Меча Епдапб.Зкзонуклеаза ВА 1.31 и Фермент Кленова (ДН К-пол име раза 1 Е, соИ - Большой фрагмент) были получены иэ Биолаб. ЙеиЕпд 1 апб; Бактериальная щелочная фосфотаза (ВАР) из когй пдтоп: лакреатаз-Вй-аза илизозим - от фирмыИндуцированная лолинуклеотидлигазаТ 4 была получена в соответствии со способом Моггау е а 1 (Моггау, Й.Е., Васе, Я.А,апб Моггау, К МО 1 есо 1 аг с 1 оп 1 пд от РВА Идазе депе Ггов Ьассег 1 орйаде Т 43, чо 1, Во 1132(1979) 493 - 505).Штаммы и плазмидыЕзсйег 1 сЫа соИ НВ 101 (рго,ео, тЫ, 1 ас,з 1 гр, т, в, епбо 1, гес А: Воуег, НВооИапоб -Роззо 1 х, Р.А. совревептат 1 оп апауз 1 з о 1гезИсоп апб вобйсат 1 оп о РИА Е, соИ.МО 1, В 1 О 1, Я (1969), 459-472; МИО 00291),ЕзссессЮа сс 11 ЕО 8800 (зар Е, зср Г,Ьзб Я, вет, 1 ас ЕМ 15, гес А 56. Моггау, И,Е;Вгавваг, Ю.,З и.Моггау, К, 1 апЬоб рЬадез1 Ьа 1 з 1 вр 1 ту гесочегу о 1 1 п ч 1 тгогесовЫпа 1 ез, Мо 1. Оеп, Оепей 150 (1977),. 53-61; МКО 00291).г 1 Т 18 (К 1 гзсЬЬаов, 5 В и Копгаб, Е.В.1 зо 1 абоп ОГ зрес 1 аИаеб 1 авЬба тгапзбос 1 пд, Ьастег 1 орйаде, саггу 1 пд ТЬе Ьета зоЬпт Ьепетог Езсег 1 сйа со 11 гЬолоес 1 е 1 с ас 1 бро 1 увегазе, 1. Васгег 1 О 1, 116, 1973, 517-526),рВР 322(ВОИча, Е., ВОЖдпек, ВЛ .,ОгеепР,ЗВейасЬ М Неупе 1 ег, Н,1., Воеге, Н.М.,Сгоза, Я апб Гайов. Я: сопзтгоег 1 оп апб сЬагасегзабоп ОГ пеа соппд чеЫс 1 ез Оепе 2,(197), 95 - 113; МИО 00298).р Во 3 (Оетр, В., СЬапд апб апаИзз ОГЯ.И, апб, Во)агб. Н: Соппд апб апаИз 1 з озтгопд рговотогз 1 п вабе розз 1 Ые Ьу йедоапзтгеав р 1 асевем от ЙЙА егв 1 пабопз 1 дпа Ргос. Ка 11. Асад, Я 1 с, ОЯА 78, (1981)4936-401).рНС 314 (Вогос, 1, Рбзта 1, Оу, апбчепецапег Р: Авей об Фог сопзтгосбоп ЫдЬсору-повЬе р 1 азв 1 б честогз 1984, Патентная заявка Венгрии М 3212/83; МИО 00980Е,соИ К 12) 1 М 107 (Зап 1 зЬ-РеггоЬ, С, ет а 1.1 вргочеб М 13 рбаде с 1 оп 1 пд ческогз апб Ьоз 1з 1 га 1 пз: пос 1 еот 1 бе зедоепсез о 1 Йе М 13 вр18 апб р 1.С 19 честогз; Оепе 33, (1985), 103119),Штаммы Е. со 1 выращивали в обогащенных жидких средах, содержащих 10 гБакто-триптона, 5 г бакто-дрожжевого экстракта и 5 г НаС на литр. Твердую средуполучали путем добавления 15 г бакто-агара. на литр к описанной выше жидкой среде, Индикаторные чашки для определения экспрессии а -пептида содержит:казаминокислоты 20 гИагНРО бгКН 2 Р 04 ЗгйаС 0,5 гИ Н 4 С 1 гБакто-агар 15 гх-да 1 (в растворе диметилформамида) 20 мгМдС 12 2 мМСаС 12 0,1 мМН 2 ОШтаммы. несущие плазмиды, содержащие ген, кодирующий 3-лактамазу, выращивали в средах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина, 5Выделение плазмидной ДНК осуществляли путем культивирования штамма бактерии, несущего плазмиду. в среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, и путем добавления 170 мкг/мл хлорамфенико ла к среде при 006 оо ни = 0,7-0,8 к плазм идной ДН К. В ыделение плазмиды осуществляли по способу Седе 1 апб Не 1 пзИ (С 1 еае 11, О,В апб Не 1 пзИ, О,В. Бцрегсо 11 ед с 1 гсц 1 аг ОЙА-ргоеи соврех 1 п15 ЕзсйегсЫа соП рцгИсалоп апб 1 пбцсеб сопчегзоп то ап ореп с 1 гсц 1 агг ОНА 1 гов Ргос. Май, Асад. Бс. ОБА 62 (1969), 1159- 1166), Полученный чистый лизат затем очи щали при помощи хроматографии на Сефакриле 51000 (РЬагваса) и путем ультрацентрифугирования в градиенте хлорид цезия/этидиумбромид), Выделение плазмиды аналитического препарата (от 1,0-1,5 мл 25 бактериальной культуры) осуществляли способом Бирнбойма и Доли калийацетатный метод, модифицированным 1 зЬ-Ногоч 1 тг (Мап 1 атз. 1 ЕгтзсЬ, Е.Е. апб ЯавЬгооЕ, .1. Моесц 1 зК соп 1 пд Со 1 д Ярг 1 пд йагЬог 1 аЬ., 30 Нью-Йорк, 1982).Расщепление ДН К-образцов рестриктирующими эндонуклеазами осуществляли в соответствии с условиями, установленными Мецч Епд 1 апд В 1 о 1 аЬ.Липкие концы затупляли следующим образом: ДНК осаждали этанолом после расщепления, и снова растворяли до 10-20 мл в буфере, содержащем: 50 мМ Трис-НС 40 (рН = 7,4), 7 мМ МдС 12, 1 мМ дитиотреитола, 0,1 мМ оАТР, 0,1 мМ бОТР, 0,1 мМ дОТР и 0,1 мМ ТРР (концентрация ДНК составляла 200-250 мг/мл). Указанную реакционную смесь инкубировали в течение 15 мин при 45 37 С после добавления 1 - 2 единиц фрагмента Кленова ДН К-полимеразы 1.Липкие концы лигировали в реакционной смеси (30 - 40 мл) содержащей 0,5-1,0 мг ДНК, ббмМ Трис-НС 1(рН =7,6).5 мМ МдС 12, 50 5 мМ дитиотрейтола, 1 мМ АТР и 1 ед. индуцированной полинуклеотидлигазы Т 4. Смесь лигирования инкубировали в течение 2 - 3 часов при 14 С (Маг 1 ат 1 з, Т., Ег 1 тзсЬ, Е.Е и ЯавЬгооКО: Мо 1 есц 1 аг соп 1 пд, Со 1 б Ярг 1 пд НагЬогаЬ., Нью-Йорк, 1982). Затупленные фрагменты ДНК лигировали в смеси, содержащей 30-40 мг/мл ДНК, 25 мМ Трис-НС (рН = 7,4), 5 мМ МдСЬ, 5 мМ дитиотрейтол, 0,25 мМ спермидина, 1 мМ АТР, 10 мг/мл ВЯА (Сигма, Тип ч), После добавления 4 - б ед, индуцированной полинуклеотидлигазы Т 4. реакционную смесь инкубировали при 14 С в течение 8 - 12 часов,Электрофорез на агарозном геле (Сигма, Тип 1) образцов ДНК проводили в горизонтальной ванне для злектрофореза в соответствии с методом Не 10 пд ет а 1, 1974, используя 0,8-2,0 агарозного геля, Электрофорез в полиакриламидном геле ДНК-образцов осуществляли в вертикальной установке, используя 4 и 8 густого геля, толщиной 1 мм, в соответствии с методом Мап 1 ат 1 з ет а 1. (Напабаз, 1 Тепеу, А, апд чап бе Яапбе, Н: СЬаи 1 епдтЬ бетегв 1 пат 1 оп от зва 11 боцЬ 1 е апб з 1 пдезтгапбеб ОНА во 1 есцез Ьу ро 1 уасгу 1 ав 1 бе де е 1 естгорЬогез 1 з, В 1 осйев 1 мгу 14, (1975), 3787-3794),Выделение ДНК-фрагментов из агарозного полиакриламидного геля осуществляли с использованием диэтиламино этилцеллюлозы ЕАЕ в соответствии со способом ЮпЬегд, С, и НаввагзЦо 1 б, М., (1 зо 1 ат 1 оп, о 1 ОНА агав адагозедез Арр 1 сатоп то гезтг 1 ст 1 оп зте варр 1 пд о 1 абепоч 1 гцз суре 16 ОНА, йцс 1, Асд Вез, Я, (1980) 253).Переваривание фрагментов ДНК ВА 1.31-экзонуклеазой осуществляли в реакционной смеси, содержащей 100 мкг/мл ДНК, 600 мМ ИаС 1, 12 мМ СаС 12, 20 мМ Трис-НС (рН =8,0),1,0 мМ ЭДТКмМ ЭДТК, при 30 С,В зависимости от требуемой степени укорочения, в смесь содержащую 1,0 мкг ДНК добавляли 0,4 - 1,2 ед. фермента. В каждом случае реакцию проводили для каждого ДНК-фрагмента с данным препаратом фермента для практического определения степени укорачивания, при помощи электрофореза образцов после различных периодов инкубирования. Ферментную реакцию прекращали путем экстрагирования реакционной смеси фенолом и после очистки этанолом ДНК-концы эатупляли при помощи Кленов-полимеразы при условиях, подходящих для мечения 3-концов (Мап 1 атз, ТЕг 1 тзсЬ, Е,Е. апб ЯапбЬгоо 1 с .1,: Мо 1 есц 1 аг с 1 оп 1 пд, Со 1 б Зрг 1 пд НагЬогаЬ., Нью-Йорк, 1982).Компетентные клетки Е. со 1 получали из штаммов Н 8101, С 600, 1 М 107 и ЕО 8800, в соответствии с СаО 2-методом Манделя и Хцга (Мап 1 ат 1 з, Т., Ег 1 тзсИ, Е,Е, и ЯавЬгооК .1 Мо 1 есц 1 а соп 1 пд, Со 1 б Ярг 1 пд НагЬог 1 аЬ., Нью-Йорк, 1981),Дефосфорилизация 5-концов ДНК- фрагментов, мечение концов полинуклеотидиназой с использованием . Р-АТР, и анализ нуклеотидной последовательностиосуществляли методом Махаа, А и ОЬегс, чч, (Яе 9 цепсп 9 епб - 1 аЬ.еИед ОИА в 1 й ЬазезресОс Саваса 1 с 1 еача 9 ез, МеФ. Епгугпо 65, (1 980) 499-560,Другие способы, используемые в конструировании векторов настоящего изобретения, описаны в протоколе лабораторного руководства Мап 1 атз, Т., Гг 11 зсЬ, Е.Р и загпЬгооЕ ц, Мо 1 есцаг соп 1 дд, Соб Зрг 1 п 9 НагЬогаЬ., Нью-Йорк, 1982).Описание к рисункамРис, 1. Структура плазмида рВВ 9 Часть плаэмиды рВР 322 изображена двойной линией, а чаксть гО 18 обозначена жирной линией. Наиболее важные гены и регуляторные области. обозначены кружочками. Сайты расщепления для рестриктирующей эндонуклеазы показаны стрелками.аар" ген для ф-галактамазы, сообщающий устойчивость к ампициллину;1 етген, кодирующий устойчивость ктетрациклину(так как ДНК-фрагмент вставляли в ВапН 1-сайт, то ген устойчивости к тетрациклину был инактивирован);А часть, происходящая от лямбда в фрагменте, полученном из трансдукции фагового гИ18;55; 163; 233: гены для раэличиых зрелых ДНК-молекул оперона ггп ВР 1; Р 2: промоторы оперона ггп В Т 1; Т 2: терминаторы опероиа ггп В Р: Рз 11; Е; ЕсоВ 1; Н: Н 1 пд И; В; ВааИ 1;3: За 1; Нр: Н ра 1; Рч: Рчц И; Р: Рзр ИРис, 2. Структура плазмиды рВВ 9 Ь 9 Заштрихованная часть означает чЭвть делетированную из плазмиды рВВ 9 пуавр переваривания ВА 1.31-эндонуклеазой. Аббревиатуры описаны в описании к Рис. 1.Рис, 3. Нуклеотидная последовьщльность в окрестности точек присоедаабния частей различного происхождения в Фазмиде рЕВ-Ч 1/23.Рис, 4; Структура плазмиды рВВ 9"Ф 29 Обозначения и аббревиатуры даны в описании к Рис, 1 и Рис. 2. Заштрихованные площади означают части, делетироваиные из плазмиды рВВ 9.Рис, 5. Структура плазмиды р 408-5.Обозначения даны выше.Рис. 6. Совместное построение частей оперона ггп В и ас для получения плазмид рЕВ-типа.На рисунке подробно изображено построение плазмид типа рЕВ из плазмиды р 419-10 и фрагмента "В" (ЕсоВ 1-Нпб Иплаэмиды р 1 Вц 3.Аббревиатуры: Ар; ген устойчивости к амй,5 .пициллину;Во: происхождение репликации; Т 1 и Т 2; терминаторы оперона ггп В;Р 2: один из промоторов оперона ггп В; 163и 53: оставшиеся части оперона ггп В. "Во 10, рота" обозначают делеции. Верхняя панельсправа означает семейство плазмид рЕВ,члены которого отличаются друг от другалишь длиной ВА 31-делеции. (Несколько"ворот" вокруг символа Ь означает делеция15различной длины). Рис. 7. Нуклеотидная последовательность.промоторов плаэмид рЕР Ч 1/23 и рЕВ ч /23 (-Из)Части присоединения, происходящиеот ггп В и ас-оперона, ссэтветственно, (а) в плаэмиде рЕВ Ч 1/23 и (Ь) в плаэмидеРЕВО/23-ИзЦ25, .Обозначения: ,.АТ-богатая область пропромотора, расположенная выше ггп В Р 2область "-35" промотора 6/23, которая является областью, происходящей от ггп 30 Вобласть "-10" оромотора 6/23, котораяявляется областью, происходящей от ггп Вхх сайт инициации транскрипции1, сайт связывания рибосомы, происхо 35 дящий отас,Часть последовательности, написаннаяпрямым шриф 1 ом, является частью, происходящей от оперона ггп В, а другая часть,написанная курсивом, происходит от 1 ас.40, Ген оперона 1 ас-оперона и первые несколько аминокислот й -пептида обозначенычертой под последовательностью.Рис. 8. Нуклеотидная последователь 45 ность Н 1 пб И 1 - Нпб И 1 полилинкера, проис.ходящего от л чх-миниплазмиды в, направлении, полученном для плазмид типа; Р 1.Н 4,Рис, 9 и 10, Схематическое представле 50, ние семейства новых векторов экспрессии,На окружности, представляющей плазмидную молекулу обозначены: ген устойчи-.вости к ампициллину(Ар ), точка инициациирепликации (ОВ 1), промотор Ь/23 -йз 1) (р),55 сайт связывания рибосомы (ЯО) и две тер минаторные области (Т 1, Т 2). Часть, обозна,ченная волнистой линией, означает отличияотдельных членов семейства плаэмид. Вподробном изображении отдельных частей55, молекулы встречаются следующие аббревиатуры: а: последовательности, кодирую2 б 183 б 424 25 иэобр леотид)СААТ ия 1. Способ пол струирования в щий лигирова клонирование и ленной нуклеот стью, отл и ч э ю фрагментов ДН ДНК, кодирующи учения пр ектора, и ние фра отбор про идной и щийся т К исполь й Рг пром омотора для конредусматриваю- гментов ДНК, мотора с опреде оследовательноем,что в качестве зуют фрагмент отор ггп-оперона ий собой иной от 0 Ч 1/23, или 1 Н 5, или ВЧ /23/щие различные части Р-галактоэидазы; САТ: последовательность, кодирующая хлорамфеникол-ацетил-трансфераэу, Показаны такие сайты расщепления для 5 рестриктирующих эндонуклеаз, подходящие для клонирования (Рчо 1, Н 1 пб 111, Са 1, ЕсоВ 1, ВавН 1, Рз 11, Во 11, ХЬа 1, Нра 1). ЕсоВЧ/Рчо 1 означает два сайта рестрикции, которые были построены вместе и не 10 могут быть снова разрезаны ни одним иэ ферментов. Депонированные штаммы рибосомальной РНК ЕзсЬегсЫа со 1, полученный путем делеции большей части ггпоперона рибосомальной ДНК, и фрагмент ДНК плазмиды р 1 Во 3, кодирующей последовательность ггп-оперона вне областей -35 и -10, при этом в точке соединения фрагментов создают сайт узнавания рестриктазой Из 1, по которому удаляют Т 6 СА-последовательность, и отбирают промотор со следующей нуклеотидной последовательностьюА 6 А 6 ААААТАААТ 6 СТТ 6 А СТСТ 6 ТА 6 С 666 АА 66 СС 6 ТАТТАобласть -35 часть происходящая от ггп В область -10 (минус один Т-нуклеотид) Т 66 ААТТ 6 Т 6 АОС 66 САТААСААТТТС АСАСА 66 АААСА 6 СТАТ 6 АССчасть происходящая от ас2. Способ конструирования вектора для экспрессии белков в клетках ЕзсЬегсЫа со, предусматривающий соединение фрагментов ДНК, кодирующих области регуляции и репликации, промотор, область связывания с рибосомами, селективный маркер и структурный ген, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что используют фрагмент ДНК, кодирующий промотор с нуклеотидной последовательностьюАОА 6 ААААТАААТ 6 СТТ 6 АСТСТ 6 ТА 6 С 666 АА 66 СС 6 ТАТТАобласть -35 часть, происходящая от ггп область -10 (минус один Т-нТ 66 АДТТ 6 тбд 6 АС 66 САТДАСА 66 АААСА 6 СТАТСА 6 Счасть, происходящая отаси фрагмент ДНК, представляюпоследовательность гена 1 асдлдо 100 О/, и получают вектор рЕЯрЕВЧ/23 Р 1 Н 4, или РЕВО/23Рееб/23,или р аНа/23, или рАТС/, или рЕВЧ /23/+АТС/, 1836424ю 4; И Рф МР чор М що -ц е 1ФефЬ а Ос ц4.оо:оасЮ44 0,Б, У 4О 4Ю )а. ФВ дй О ГЧ 4 ф- (Одо,д осхЪ о .а Рхдр й 4 4 Р х .ф оц О Ф, о о й Э 1 ф о э ФД, СВ О оц - оо ж х О в Кц шоФ учо .,ч63тифЯсл мо.д С -а.оосид МС:айефЕч сДЦ ЯОф- =2 (бСз ЕО Еч рсб осо хс ос ОфСфф 1836424 4444рагмен И р естно иГ. 6 рибации о 1.1 да 11 оа а Ве ргезеосе о 1 Ес рование в прис тот и рог 1 сосед гог Ье Мегрог 1 .о ф-да 1 с 1 огЫже (сс%0 89/024 бб РСТ/НЬЯЯ/0006Мцс 1 еоббе бес 1 цепсе от йе Нпб П 1 Нпс 1 111 ро 1 у 1 гйегог 1 ЧЪ огои и Ве огейабоп аб ргеавп 4 Й:Зонтс 1Р 1.Н СНунлеотИднаЯ ПоСледОвательноСть Н. н с 111 - Н 1 И 0111 - полилинкера,происходящего от Ч Х - миниплазмиды в направлении, полученномдля плазмиды РВН 4 Н 1 пд 111 Есоя 1 ВагаН 1С 1 а 1мссттлтссдтслтддсстстсьлдслтсдсддттс "сссхсссслтс 10 20 зо 40 СССССЛАССТТСТТСССАТТССТССЛСССССЛСААСТССтддССТдДдТССдДдЛ 60 70 80 90 1 О 0 ВЧ 1 П . 1 ЫсП 11ХЬа 1ддтстстдадддсттРб/23 "М 1регсаг - 1 аС-ОПЕратор05 е Ь 01 пя 5 е са 2 Т связ,нс рибосомо-Вы гелос ЙНег й Не псБд 1- сца 1 пегпЬегя а Ье чес 1 агапц 1 у аВ аПсгеВ,ТЭта область отличается отдельными членами семейства векторов. Ей Ч 1 Ш аП Ноб РчаП Нодопддсо Рд ВфД ХЬа Наби -ъддю 4 рЕй М/23 р 1.Нд Хаа В 9 П РЙ 1 Вол Ессй Оа 1 Над.1 П т Тг д- дрЕй М 23 р 1.Н чиП Нра 1 С 1 аоя Воо Ы ХЪа НЫдъю-д е И 23 дГ/РсаП ЕСся Вао и Фх Оа Нро 1 Есохна нып т тг Ф а 1 пИ 23 РдаП НобФ тг рЕЙ Ч 1 П 3 -АТИ Ваан т,С 1 а 1 ЕсоЯ Вот Рз Ф ЕЙ%231+АТц Составитель Т.Лукачевыхедактор Техред М,Моргентал Корректор Н.Корол Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 10 аказ 3008 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, дК, Раушская наб., 4/5бактериальных клетках ферменты бактерии сначала синтезируют копию мРНК на матрице ДН К в процессе транскрипции,.а затем полипептидную цепь с использованием информации, закодированной в НРК-информации во время процесса трансляции. Инициация транскрипции происходит в области ДНК, называемой промотором. РНК- полимераза узнает эту область и связывается с ней перед началом транскрипции, Методы ДНК-рекомбинации 1 п ч 1 го являются практически экономичными для получения белков, олько если эти белки продуцируются в относительно больших количествах, то есть и транскрипция и трансляция являются эффективными. Поэтому очень важно, чтобы промоторы были "сильными" (кроме других необходимых признаков), то есть, они должны обеспечивать высокий уровень транскрипции.Путем использования многих аидов промоторов, например, lас, игр, Ыа,1 р лямбда Р 2-промоторы можно конструировать различные векторы экспрессии, На практике чаще всего используется 1 ас-оперон вследствие его хорошей регуляторной функции, хотя он является относительно слабым промотором. Так называемые гибридные промоторы различного происхождения описаны, например, в Европейской патентной заявке М 82302532 (номер публикации - 0067540). Эти промоторы отличаются тем, что их так называемые -35 и -10 области(которые являются самыми важными областями промотора) являются различного происхождения, то есть, две части промотора различного происхождения соединены вместе в области, находящейся между -35 и -10-областями. Согласно вышеупомянутой патентной заявке, векторы экспрессии, сконструированные с использованием таких гибридных промоторов, являются ценными дпя промышленных целей, так как их функция является хорошо регулируемой и в то же время обеспечивает возможность эффективной транскрипцииЦелью настоящего изобретения является построение векторов экспрессии, несущих более сильные и ромоторы (для получения высокого выхода белка), которые являются в то же время хорошо регулируемыми,В начале работы над настоящим изобретением заявители использовали векторы экспрессии, описанные в работе: 1 цМаезочсЬ ет а 1, "Новые регуляторные свойства промоторов гена рРНК Еэсйег 1 сЫа со 1" (Кеа гедо 1 атогу 1 еа 1 цгез от 1 Ье ргототегз оУ ап Езсйег 1 сЫа со 11 гййА депе)(,1. Вай. 169, 272-277). Лучшими из указанных векторов являются векторы, несущиепромоторы со следующими свойствами;- они сконструированы из части, происходящей от Рг-промотора рибосомальногооперона (ггп В) Е,со 1, и части, происходящей от регуляторных последовательностей0ас-оперона Е, со 1- две части, происходящие от ггп В и1 ас-оперонов соединяются вместе ниже области -10;- обе области -35 и -10 происходят от ггпВ-оперона, в то время, как С 6 - богатыйучасток, ниже -10-области в ггп В Рр заменяется аналогичными последовательностями, происходящими из 1 ас-оперона,которые не проявляют репрессорного дей 20 ствия, так, чтобы он не влиял на сильноефункционирование других частей промотора,Хотя эти промоторы конструировалисьпутем комбинации различных частей двухразличных промоторов, однако, их нельзяклассифицировать как гибридные промоторы, так как наиболее важные для фкункционирования области, то есть, области -35 и-10 происходят от одного и того же промо 30 тора, ггп В Р 2. Заявителями было обнаружено, что.ати промоторы обеспечивают оченьхорошую экспрессию. При дальшейших исследованиях было обнаружено, что удаление четырех пар оснований: ТОСА ниже35 области -10 в векторах, несущих описанныевыше промоторы, вдвое повышают интенсивность транскрипции.Указанное открытие является неожиданным по нескольким причинам, С одной40 стороны, в специальной литературе нет никаких намеков на то, что вышеупомянутыечетыре пары оснований играют какую-либороль в определении сиды промотора, и сдругой стороны, удваивание интенсивности.45 транскрипции является весьма значительным результатом в случае промоторов, которые изначально являются очень сильными,На основании вышесказанного, постоящее изобретение относится к промоторам,50 которые конструируются из Р 2-промоторарибосомального оперона ггп В Е. со 1 и изнескольких регуляторных последовательностей от 1 ас-оперона Е. со, где укаэанныедве части различного происхождения соединяются вместе ниже области -10 промотора, а последовательность ТОСА удаляетсянепосредственно за областью -10,Кроме того, настоящее изобретение относится ко всем векторам экспрессии, со 1836424держащим вышеупомянутые промоторы; клеткам-хозяевам Е. со, трансформированным указанными векторами. и способам конструирования указанных промоторов и векторов экспрессии.Основные признаки векторов экспрессии настоящего изобретения и основные характеристики генной экспрессии, обуславливаемой укаэанными векторами, могут быть сформулированы следующим образом:1. Промотор нового типа (обозначенный: 6/23 -Из), который является основным отличительным признаком вышеупомянутых векторов экспрессии, осуществляют инициацию транскрипции с высокой и постоянной интенсивностью независимо от физиологического состояния клетки-хозяина,- что составляет свыше 90 от всего РНК-синтеза клетки-хозяина, и- в соответствии с этим, накапливание чужеродного генного продукта составляет вплоть до 30 - 80 от общего количества клеточного белка,2, Терминация транскрипции происходит на двойном терминаторном участке. происходящим из ггп В-оперона,3. Продуктом транскрипции является гибридная молекула мРНК, которая также содержит рРНК-сегмент, происходящий из ггп В-оперона (помимо чужеродной кодирующей области), при этом стабильность переданной информации - выше, а полупериод жизни указанной мРНК-молекулы - более продолжительный, чем средний полупериод жизни мРНК.4. Интенсивность транскрипции может регулироваться посредством встраивания ас-операторной области,5. С помощью нескольких членов указанного семейства новых векторов синтезируют чужеродный генный продукт в виде белка слияния. С одной стороны, это обеспечивает большую стабильность генного продукта и с другой стороны, позволяет обнаружить присутствие генного продукта и легко измерить уровень экспрессии гена с помощью партнера слияния (альфа-пептид бета-галактозидазы), Чужеродный ген может быть также встроен в указанные векторы ниже ас Е не в форме белка слияния. Этот тип конструкции функционирует подобно бактериальному оперону и чужеродный генный продукт синтезируется как отдельный белок. В этом типе конструкции чужеродный ген может также содержать сайт связывания рибосомы Е. соИ, У других членов этого семейства векторов чужеродныйген может встраиваться со своим началом,т.е, положением начала трансляции с оптимальным расположением в конструкции в5 сайте связывания рибосомы. В этом типеконструкции собственный АТ 6-кодон чужеродного гена обеспечивает правильнуюинициацию трансляции, Если встроенныйчужеродный ген не имеет укаэанного АТ 6- кодона в начале, его можно соединить ссинтетическим Са -линкером, имеющим всебе АТО-элемент последовательности. Чужеродные гены, имеющие собственные сайты связывания рибосом могут такжевстраиваться в указанные векторы с помощью других сайтов распознавания длярестриктирующих эндонуклеаз.6. При конструировании промоторов нового типа, функционирующих в векторах настоящего изобретения, удаляют расположеннуюниже регуляторную область рибосомальногопромотора. Таким образом, характеристическии контроль фут(ции рибосомального промотора, которая является весьмавосприимчивой к физиологическим условиям, устраняется и указанный промотор может функционировать в высокой степенинезависимо от физиологических условий.7. Транскрипция начинается у цитозинового основания в исходном рибосомальном опероне. Заменив это основание нааденин или гуанин, можно значительно увеличить активность транскрипции промотора,8. Регуляторные области ас-оперона соединяли вместе с указанными промоторами,Такое построение не влияет на максималь 40 ную интенсивность при индуцированных условиях, но при этом позволяет регулироватьфункцию промотора аналогично ас-оперону; а это препятствует слишком высокомупостоянному уровню транскрипции и транс 45 ляции, который может оказывать неблагоприятное воздействие на метаболизмклетки-хозяина,9. Предпочтительными вектооами экспрессии настоящего изобретения являютсяописанные ниже векторы, которые отличаются тем, что они имеют: размер 2800 - 4500основных пар; ген устойчивости к ампициллину; оптимизированное расстояние междусигналами транскрипции и трансляции; известную полную ДНК-последовательность;Со Е репликативного типа; число копий20-30 на клетку(хотя были построены такжеварианты с высоким числом копий, в соответствии с патентной заявкой Венгрии,опубликованной под номером Т 35280); не 1836424сколько различных сайтов распознавания рестриктирующих эндонуклеаз для встраивания в зкспрессируемый чужеродный ген, причем чужеродный ген может быть встроен при всех трех рамках считыванияНовые векторы экспрессии, описанные в приведенных ниже примерах, содержат следуощие сайты распознавания рестриктируагцих эндонуклеаэ: например, Рчц И, Нпд 111, С 1 а 1, Есой 1, Ват Н 1, В 911, ХЬа 1, Нра 1.Способ настоящего изобретения для конструирования указанных векторов экспрессии содеркит, в основном, следующие стадии (которые ниже описаны более подробно):1. Клонирование ггп В-оперона Е. соИ в векторе рВР 322.2, Стабильное субклонирование промоторов указанного опе рона в плазмидах, удаление основной части структурного гена; помещение областей начала транскрипции (промотор) и завершения транскрипции (терминатор) на близком расстоянии друг от друга,3. Присоединение начальной части 1 эсоперона к укороченному ггп В-оперону.4, Конструирование промотора 6/23 с соответствующими областями регулирования. В результате модификации такого промотора получают промотор 6/23 (-ИзЦ5. Введение различных сайтов рестрикции в соответствующую часть вектора, что дает возможность встраивания чужероднО- го гена. Разработка других конструкций векторов зкпрессии.П р и м е р 1, Конструирование нового семейства векторов экспрессии настоящего изобретения.1, Выделение полной ДНК из Е. соИ или трансдукция бактериофаговой ДНК Е. соИ, несущей оперон ггп В. которая может служить в качестве исходного материала при выделении рибосомального оперона ггп В из клетки Е. соИ. Оперон ггп В выделяли согласно методу К 1 зз, А ет а. (6 епе 4, (1978), 137 - 152), начиная с трансдукции ДНК фага гЫ д 16, или согласно способу Вогое Т. ет а 1., (Ыце-Ас 1 д Вез, 6, (1979), 1617-1830) с использованием получения хромосомной ДНК. В первой стадии конструирования вектора экспрессии настоящего изобретения строили плазмиду рВВ 9 (МК 6 00300), изображенную на Рис, 1. Эта плаэмида была построена путем разрезания плаэмиды вектора рВР 322 (МИС) (ЯаееИЛе, 1,С Со 1 д Ярг 1 п 9 НагЬог Яуар. Оцапо. В 1 о 1 43, (1978), 77-90) в единичном сайте рестрик 35 40 45 двухнитевых линейных ДНК-молекул. Полученный в результате образец ДНК, содержащий линейные ДНК-молекулы, происходящие от рВВ 9 и укороченные до различной протяженности при помощи ВА 31-энзонуклеазы, лигировали с помощью полинуклеотидной лигазы Т 4 в реакционной смеси. которая является оптимальной для тупо-конечного лигирования и циркуляризации, и клеткия Е. соИ Н В 101 трансформировали смесью лигирования. Единичные колонии трансформантов выделяли, и из них получали плазмидную ДНК. В выделенных плазмидных препаратах определялидлину делений посредством переваривания рестриктирующей эндонуклеазой и гельэлектрофореза. Затем отбирали плазмиды с различными делетированными ггп В-оперонами, в которых синтезированные более короткие РНК-молекулы все ще имеют 5- и 3-концы, характерные для зрелых рРНК-молекул, с тем, чтобы получить делетировэнные ггп В-опероны, еще продуцирующие рРН К-подобные молекулы, которые участвуют в нормальном катаболическом пути обмена для р Р,Н К-молекул, Эти плазмиды обозначили рВВ 9 Ь, а одной иэ них является рВВ 9 Л 9 (Рис, 2). На основании анализа ции Вап Н 1 и легирования с 7,5 кв Вав Н - Ваа Н 1-фрагмента ДНК г 1 то 18, Эта 7,5 кв-вставка в полученной рекомбинантной ,плазмиде содеркит полный ггп В-оперон, 5 несколько дополнительных последовательнйТей. происходящих от Е. соИ и элемент последовательности длиной приблизительно 400 п,о., происходящей от лямбда-фага.В регуляторной области ггп В-оперонэ име- "0 ются два промотора; Р 1 и Р 2, расположенные на 180 и 300 п,о., ниже 163 рРНК-гена, соответственно, (Сзогдаз Той Е. е 1 а 1, йце 1.АсЫ. Вез, 7, 1979, 1335 - 1342).152. Рекомбинантные плазмиды, содержащие ггп В-оперон или область его промотора, вследствие своих сильных рибосомальных промоторов, инициируют крайне высокий уровень транскрипции, что перегружает механизм транскрипции клетки-хозяина и приводит к нестабильности при хранении плазмиды. Для устранения этого недостатка 1 п чего делетировали все части рВР 9-плазмиды, которые не являются важными для дальнейших стадий конструирования. В этой стадии сначала расщепляли ДН К р В В 9 Н рэ 1-рестриктирующей эндонуклеазой и обрабатывали полученную линейную молекулу ВА 31 - энзонуклеаэой в 30 течение разных периодов времени. Фермент постепенно укорачивал оба концаБыла осуществлена также третья деле- час ция в целях удаления области, расположен- по ной выше области промотора ггп В-оперона. 1 ас Для этого плэзмиду р 889 Ь 28 переварива- хо ДН К-последовательности, делетированный ггп В-оперон указанной плазмиды содержит первые 269 п.о. зрелой 16 Я рРНК-молекулы и полный ген 5 Я рРНК в конце оперона. Нуклеотидная последовательность в окрестности двух конечных точек делеции, расположенных в первой части гена 16 Я рРНК и рядом с концом гена 23 3 рРНК, соответственно, представлена на Рис. 3.В следующей стадии создавали дополнительные делеции в плаэмиде с целью получения делетировэнного ггп В-оперона в как можно меньшей плазмиде, Плазмиду р 889 9 линеаризовали путем расщепления ее в единичном сайте За 1 1 рестиктирующей эндонуклеаэы, который происходит от рВР 322-вектора (В ггп В-опероне имеются два ЯаИ-сайта расщепления, но они были делетированы в предыдущей стадии), Затем полученную линейную ДНК-молекулу переваривали ВА 31 - энзонуклеазой для получения сокращения приблизительно длиной 1600 п.о.; расстояние между единичным Яа 1-сайтом и концом делетированного ггп В- оперона составляет около 800 п.о. в плазмиде рВВ 9 Ь 9. С целью удлинения полученной делеции в направлении, противоположном ггп В-оперону, и удаления более несущественных частей векторной ДНК, перед циркуляризацией переваривали также укороченные линейные ДНК-молекулы с помощью Рчи И-рестриктирующей энзонуклеазы, Этот фермент, разрезая ДНК, создает тупые концы, так,что оба конца линейных ДНК-молекул, один из которых образован Рчц И, и другой ВА 31-перевариванием, могут быть соединены вместе без дополнительной модификации. ДНК-лигирование, трансформация и выделение колоний путем физического картирования проводили так, как было описано выше, Для дальнейшей работы по конструированию была выбрана плаэмида р 889 Ь 28 (Рис, 4), в которой делеция, осуществленная путем Яа 1 1-ВА 31 - Рчо И-переваривания, составляла 2174 п,о. Одна конечная точная этой делеции располагается на 510 п.о. ниже конца зрелой 5 5 РНК-последовательности, а другой конечной точкой является сэйт расщепления Рчц И вектора рВК 322, т,е. 2067 п,о, в соответствии с нумерацией рВВ 322, Нуклеотидная последовательность окрестностей двух конечных точек делеции представлена на Рис.3. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ли Есой 1- и Гзр 1-рестриктирующими эндонуклеазами, обе из которых имели один сайт распознавания, расположенной выше 16 Я РНК-гена ггп В-оперонэ и выделяли вектор и фрагмент, содержащий большую часть делетировэнного ггп В-оперона, Липкие концы выделенных Есой 1 - Гзр 11-фрагментов обрабатывали фрагментом Кленова ДНК- полимеразы 1 и замыкали их путем лигирования с помощью полинуклеотидлигазы Т 4. При соединении обработанных концов вместе, обе последовательности распознавания Всат- и Гзр 11-рестриктирующих эндонуклеаз реконструировали;ОААТТСОАСТТААСОТТтаким образом, полученная плазмида (р 408-5, МЯО - 00301) может быть линеаризована обоими ферментами (Рис. 5),В следующей стадии линеаризовали плазмиду р 408-5 путем расщепления ГзрИ- ферментом, сайт распознавания которого расположен на 100 п,о. выше Прибнов-бокса промотора Р и создавали серии делеций, распространяющихся до промотора Р 2, с помощью ограниченного ВА 31-переваривания (Рис. 5), После лигирования и трансформации определяли конечные точки делеций в выделенной плазмидной ДНК путем рестриктирующего картирования с помощью ВЯрЮ, Узр и НЬэ 1-рестриктирующих эндонуклеаз и при помощи секвенирования ДНК. В плазмиде р 419-10 делеция длиной 197 п.о. удаляла промотор Р и оканчивалась у 100 п.о. выше промоторэ Р 2, Эта делеция также удаляла иэ векторной ДНК последовательность длиной 100 п,о., находящуюся выше гена устойчивости к ампициллину, Нуклеотидная последовательность в окрестностях конечных точек делеции показана на Рис, 3.3, В следующей стадии указанный укороченный оперон ггп В соединяли с началом 1 ас-оперона. Он был выделен во Н 1 пб И- Есор-фрагменте из р 1 ВоЗ-плазмидной ДНК (Оеп 1, В., 1 апдег АСЬапд А.С,1., Совдеп, Я.й. апо Во)эгб, Н., С 1 оп 1 пд апб апа 1 уз 1 з о 1 зсгоцдрговоог 1 п гладе розз 1 Ые Ьу доюпзсгеэе расеглепс о 1 РМА тегп 1 пас 1 оп з 1 дпа 1 Ргос, Йаб, Асад. 5 с 1 1.1 ЯА 7 Д, (1981) 4936 - 40). Изолированный фрагмент содержит следующие части в направлении от ЕсоВ к Н 1 пб И 1: 160 п,о, ДНК неизвестного происхождения и функции, соединенные стью, происходящей из 1 ас-оперона и рэсложенной на 4 п.о. выше Прибнов-бокса -промотора, Эта последняя часть, происдящая от 1 ас-оперона. содержит часть 1 ас1836424 В одной из полученных плазмид (РЕЯ -Ч/23) последовательность 2 п.о, концов, происходящих от ггп В, расположенных ниже -10-области промотора Р 2 и регулятор ные области транскрипции и трансляции,происходящие от ас-оперона (ас-оператор, сайт связывания рибосомы, начальная точка трансляции) соединяли с промотором Р 2 с тем же расстоянием, как зто имело место 10 для ас-промотора в ас-опероне, Эта конструкция обеспечивает оптимальные условия для трансляции и для регулирования трансляции, так же как в ас-опероне. Эта плазмида не содержит элемент С-богатой последовательности длиной приблизительно 25 п.о расположенный ниже области -10 промотора Р 2, и который ингибирует активность промотора в различной степени в зависвимости от физиологических условий клетки. Роль этого элемента последовательности в регулировании активности промотора исследовалась в лаборатории ( оасзонсК Т ег а.l, Васг 169, (1987) 272-277).Сайт инициации транскрипции этогосконструированного промотора (обозначенного. 6/23) расположен в последовательности, происходящей от ас-оперона и, вероятно, является таким же, как и в ас-опе роне (66 ЛАТТ). Конструкция этого промотора, осуществленное с помощью плазмиды рЕ в и/23, обеспечивает экспрессию гена а -пептида на порядок выше, чем другие похожие конструкции, где различные части, 35 происходящие от ггп В и ас, соединенывместе в других сайтах. Уровень экспрессии гена а-пептида легко измерить спектрофотометрическими методами с помощью так называемой реакции а-комппементации 40 (Мег: Ехрегаепгз и гпоесцаг депегсзСо 1 Яргпц НагЬог, 1972). Еще одним преимуществом конструкции промотора 6/23 является уникальный сайт расщепления Из - рестриктирующей эндонуклеазы, образо ванный у сайта соединения двух частей различного происхождения, который позволяет упростить дальнейшие альтерации, Одной наиболее ценной из таких апьтераций является удаление четырех внутренних нуклео тидов сайта расщепления Из(А Т 6 СА Т);что может быть сделано, например, путем промотора -10 область, полный оператор, сайт инициации транскрипции, сайт связывания рибосомы, расположенный возле 5- конца мРНК, АТ 6-кодон начала транскрипции и область, кодирующую первые 70 аминокислот ф -галактозидазы. Этот И-концевой полипептид (обозначенный апептидом) не обладает Р-гэлактозидазной активностью, но он может воспроизводить часть этой активности при взаимодействии с определенным специфическим типом дефективных молекул Р -галактозидазы ( а -акцепторные мутанты), которые сами по себе являются неактивными,Плазмиду р 419 - 10 расщепляли Ягп -рестриктирующей эндонуклеазой между промотооом Р 2 и терминатором Р 1 и к тупым концам полученных линейных ДНК-молекул присоединяли синтетический Есой-линкер, Смесь лигирования: пинкер-плазмиды переваривли Есо -рестриктирующей эндонукЬеэзой и снова лигировали в условиях, оптимальных для циркулизации плазмиды. После трансформации выделяли плазмиду р 808-2, которая отличалась от плазмиды р 419-10 только отсутствием сайта расщепления Ягпрестриктирующей зндонуклеазой, который бып замещен на ЕсоЮ-сайт расщепления путем введения линкера (Рис, 6). Выделенный Нйб -Есог-фрагмент плазмиды р а Вц 3 лигировали с р 808-2- плазм идной ДН К, переваренной НВ- Есой и клетки Е, со трансформировали смесью лигирования, Колонии трансформантов выращивали на твердой среде, содержащей окрашенный индикатор, и через 24-36 часов наблюдали голубые колонии, цвет которых указывал на низкий уровень а -пептидной экспрессии, Из этих колоний выделяли плазмидную ДНК и физическоекартирование показало, что эти колониисодержат плазмиду рВ 27-10 (МИ 6 00307),созданную посредством соответствующего присоединения указанных двух фрагментов(Рис. 6),4. В следующей стадии, создавали делеции между промотором Р 2 ггп В-оперона и начальной точкой трансляции, в целях повышения эффективности трансляции, Плазмиду р 827-10 линеаризовали путем обработки ДНК-полимеразой Т 4 после расщепления Из 1-эндонуклеазой. ДН К-полимераза Т 4 переваривает четыре избыточных нуклеотида Из -расщепленного липкого конца. При лигировании таким образом обработанной при помощи ДНК-лигазы Т 4 плазмидной молекулы получали конЧтрукЕсоИ-переваривания, последовательности разной длины (до 400 п,о.), удаляли путем переваривания ВА 31-экзонуклеазой и полученные укороченные ДНК-молекулы снова замыкали посредством ДНК-лигазы, Трансформанты, показывающие интенсивный синий цвет (интенсивный синтез апептида) на индикаторных чашках, были цию промотора, в которой -10-область провыделены.мотора Р 2 остается интактной, тогда как сайт инициации транскрипции смещается вниз на несколько пар оснований, Вследствие не совсем ясных причин, эта альтерация, кроме того. повышает эффективность 5 транскрипции, не изменяя при этом эффек-, тивности трансляции или регуляторных свойств, Эти конструкции плазмиды и промотора обозначали: рЕВ - И/23 (-Мз 1 и 6/23 (-йз 1, Соответственно. На Рис. 7 изображены последовательности промоторов 6/23 и б/23 -йз.5, Плазмиды рЕВ - И/23 (-Из 1 и рЕВ- И/23 по большей части отвечают требованиям экспрессии векторов. Однако, их значительным недостатком является ограниченная возможность встраивать чужеродные гены. Это можно сделать лищь при помощи двух уникальных сайтов расщепления рестриктирующих эндонуклеаз: Рчц 11 и20 Нпс 11, расположенных в кодирующей области а -пептида и непосредственно за этой областью, соответственно. С помощью дополнительных преобразований создавали семейство векторов, дающих возможность встраивать чужеродные гены с помощью обычно используемых рестриктирующих эндонуклеаз при всех трех рамках считывания. При конструировании этого семейства векторов, кроме того, руководствовались требованием сделать возможной экспрессию чужеродного гена как отдельного белка, так и белка слияния, который сплавлен со стабильным белком Е, со 1. Этот 35 последний вариант необходим, если полупериод жизни чужеродного экспрессируемого белка в бактериальной клетке очень короткий, например, человеческого проинсулина. В этих случаях й-концевая часть 40 белка слияния, которая происходит от Е. со 1, может защитить нестабильный чужеродный белок от разложения.Конструкция семейства векторов, отвечающих вышеуказанным требованиям, бы ла обозначена: рЕР-И/23 (будет описана ниже). После конструирования указанных плазмид типа рЕВ - Ч/23, плазмиды типа рЕВ - Ч/23 (-Мз строили в соответствии с вышеописанным способом. Во всех случаях 50 при исследованиях было установлено повышение уровня экспрессии гена.В качестве начальной стадии осуэществлялось клонирование 109 п.о. Н 1 п 1 111 - Н пс 111-полилинкера. происходящего ото ЧХ-ми ниплазмиды (Т, Мапас 1 з ес а 1, Мо 1 есо 1 аг Сопп 9 А 1 аЬогасогу спапоа 1; Соа Бргп 9 НагЬог, (1982), р. 353 в обоих направлениях к уникальному Нпг 111-сайту расщепления плазмиды рЕВ - Ч 1/23, Помимо двух сайтов расщепления Н 1 пс 111 этот полилинкер содержит Са 1, ЕсоВ 1, Васп Н 1, Рзс 1, В 9 1 и ХЬа 1-сайты расщепления для рестриктиру щих эндонуклеаз (см, Рис, 8), Полученные плазмиды, которые содержали полилинкер в направлении, показанном на Рис, 8 и в противоположном направлении, соответственно, обозначили; рЕВ-И/23 Р Н 4 и рЕВ- Ч /23 Р Н 5. В этой плазм идной конструкции и ее производных имеется. по меньшей мере, один сайт расщепления для рестриктирующей эндонуклеазы во всех трех рамках считывания, расположенный в области полилинкера, что дает возможность встроитьлюбой чужеродный ген, экспрессируемый вместе с а -пептидом в виде белка слияния, Специалистам известно, что различные чужеродные гены могут быть слиты с частями Р-галактозидазы различной длины для обеспечения максимальной защиты, Поэтому, были сконструированы еще два члена указанного семейства векторов, 733 п.о. Рчи 11-С 1 а 1-фрагмента ас Л-гена (ген, кодирующий Р -лагактозидазу в Е, со 1) клонировали в Рчц 11 - Са 1-сайтах плазмиды рЕВ-И/23 Р Н 4, Этот фрагмент кодировал дополнительные 244 аминокислот Р-галактозидазы, Полученную плазмиду обозначали; ргпе а/23.1621 п.о, Рчс 5 11 - ЕсоВЧ-фрагмента а- гена лигировали при тупых концах с 150 по Рчц 11-ЕсоВ 1-фрагмента гена, кодирующего хлорамфеникол-ацетил-трансферазу (САТ; происходит от плазмиды рВР 329, бепе 1, (1982) 79 - 89), соединяя вместе ЕсоВЧ и Рчц 11-тупые концы. Полученный Рчц 11 - ЕсоВ 1- фрагмент длиной 1771 п.о, (который является одной длинной открытой рамкой считывания) клонировали в Рчц 11 - ЕсоВ 1- сайтах плазмиды рЕВ-И/23 Р Н 4. Полученную плазмиду обозначили: р 1:альфа пс/23, При этом также были сконструированы многокопийиые версии плазмид рЕВ. - И/23 Р Н 4, рЕВ-И/23 Р Н 5 и р 1:альфа 1 пс/23 (см. патентную заявку Венгрии М Т/35280).При помощи указанных членов семейства векторов, любой чужеродный белок может быть экспрессирован как часть белка слияния, в котором первые 70 (рЕВ-Ч 1/23 Р Н 4, рЕВ Ч/23 Р Н 5, первые 280(рте а /23) или первые 390 (р -альфа 1 пс/23) аминокислот происходит от Е. со 1 (В -галактоэидаза, САТ). На Рис, 9 схематически изображены указанные плазмиды.Вышеупомянутые конструкции векторов также позволяют экспрессировать интактные чужеродные гены в неслитойформе. Это может иметь место, если встроить чужеродный ген таким образом, чтобы трансляция, начинающаяся на кодирующей области, происходящей от Е, соИ (ас г или 1 ас+ САТ), останавливалась непосредственно перед стартовым кодоном экспрессируемого чужеродного гена, и/или если чужеродный ген имеет сильный сайт связывания с рибосомой Е. соИ. В атом случае конструкция работает аналогично бактериальному оперону, содержащему два гена. Однако, в системе, содержащей два гена, часто трудно достичь оптимизации экспресии гена (результат являлся ненадежным), и поэтому были разработаны новые члены вышеупомянутого семейства векторов, которые, в основном, используются в экспрессии интактных генов. Для достижения этой цели, из плазмиды рЕР-Ч 1/23 Р Н 4 удаляли область, кодирующую й-пептид, сохраняя при этом регуляторные последовательности, и встраивали соответствующий сайт расщепления для рестриктирующей эндонуклеазы в плазмиду с оптимальным расстоянием до 1 ас-регуляторных последовательностей. В первой стадии указанного конструирования клонировали небольшой Кз 1- А 1 в 1 - фрагмент плазмиды рЕВ-Ч 1/23 Р Н 4 (см. Рис. 7) в уникальные сайты йз 1 1-Рно 1 той же плазмиды, Как показано на Рис. 7, указанный Ац 1-сайт расположен непосредственно выше стартового кодона трансляции, и очевидно также, что, в то же время,.левая половина этого АЬ 1-сэйта расщепления является половиной Рно 11-сайта расщепления. Следовательно. если соединение указанных двух фрагментов было осуществлено правильно, то уникальный Рно И-сайт расщепления плазмиды рЕВ-Ч 1/23 Р Н 4 будет регенерирован. Полученная плазмида была обозначена; рЕР-Ч 1/23 (АТО); эта конструкция является подходящей для экспрессии чужеродных генов, имеющих. свой собственный стартовый кодон трансляции АТС,Этот тип чужеродных генов может быть встроен во вновь созданный Рнц 11-сайт расщепления, после затупления концов, Эффективная экспрессия чужеродного гена возможна в том случае, если он имеет не более, чем 8 п,о. (предпочтительно 4 п,о,) выше АТО-кодона. В этом случае расстояние между стартовым кодоном трансляции чужеродного гена и сайтом связывания с рибосомой ас-происхождения является оптимальным или близким к нему,Кроме того, для облегчения экспрессии синтетических генов осуществляли дополнительную модификацию плазмиды рЕЙ -И/23 (-АТО), В укаэанный уникальный Рно11-сайт расщепления встраивали синтетический С 1 а 1-линкер (содержащий С 1 э 1-сайт5 расщепления). Фрагмент между вновь созданным Са - сайтом с Са 1-сайтом в области полилинкера плазмиды удаляли. Этобыло осуществлено путем рециркуляризации большего фрагмента после расщепления плазмиды рестриктирующейэндонуклеазой С 1 а 1, Полученную в результате плазмиду обозначали: рЕЯ - Ч 1/23(+АТО). Эта плазмида является исключительно ценной для экспрессии чужеродногогена, не имеющего стартовый кодон трансляции АТО (в основном для синтетическихгенов), Любой чужеродный ген, подобныйэтому, может быть встроен в С 1 а 1-сайт указанной плазмиды, после присоединениялинкеров Са 1 к его концам. В этом случаеесли ориентация вставки была правильнойтрансляции чужеродного гена будет начинаться в ЛТО-последовательности С 1 а 1-линкера, Расстояние между этим АТО-кодономи 1 ас-происходящим сайтом связывания срибосомой составляло 8 п.очто являетсяоптимальной в Е. соИ, Указанный вектор,конечно, является весьма ценным для экспрессии чужеродных генов, имеющих свойсобственный сайт связывания с рибосомой,Клонирование таких генов легко осуществить при помощи сайтов расщепления длярестриктирующей эндонуклеазы, располо 35 женных в обл.сти полилинкера плэзмиды(+АТО),40 Как указывалось выше, удаляя внутренние 4 п.о. уникального Из 1 1-сайта расщепления из каждой из описанных вышеплазмид, можно получить в соответствии свышеописанной процедурой семейство век 45 торов рЕВ - Ч 1/23 (-йз 1),В никеследующей части описания настоящего изобретения приводятся примерыиспользования некоторых членов семействавекторов рЕЯ - И/23 (-йзЦ.5 О П р и м е р 2, Осуществление эффективной экспрессии генов при помощи векторов,полученных в настоящем изОбретении.В целях иллюстрации того, что с помощью векторов экспрессии настоящего55 изобретения можно действительно осуществлять более эффективную экспрессию генов, чем с помощью известных векторов, проводили следующие сравнительные эксперименты.ный белок аккумулировался в бактериальных клетках в количестве до 20 - 60 от полного клеточного белка.П р и м е р 4. Для иллюстрации исполь 5 зования семейства новых векторов настоящего изобретения в общих чертах и дляэкспрессии низко и высокомолекуляоногобелка экспрессиЯ высокомолекулярногобелка обычно является проблематичной в Е,соИ проводили следующий эксперимент;1. С 1 а - Рзт 1-фрагмент клонированногоас-оперона Е. соИ встраивали в С 1 а 1 - Рм 1- сайт плазмиды Р -альфа 1 пт/23 -йз (при 15меняя частичное Рз 1 1-переваривание,расщепляли только один Рм 1-сайт), Такимобразом, была встроена полная кодирующая последовательность гена 1 ас ъ Продукт1 ас г-гена (фермент Р -галактозидаза), являются одним из самых крупных белков (мол.масса: 135000). В соответствующем штаммехозяина, после индуцироеания с помощью1 РТ 6, можно производить этот фермент взначительной степени (до 15 - ЗОО/р от общего клеточного белка) в ферментно-активнойформе,2. Векторы экспрессии настоящего изобретения могут также действовать как бактериэльный оперон, содержащий два гена.Испытания этих функций векторов проводили с использованием двух различных чужеродных генов бактериальногопроисхождения, Первым таким геном являлся вышеупомянутый ген хлорамфеникол 35 ацетил-трансферазы, который был выделениз плэзмиды рВР 329,Тад 1-фрагмент, выделенный иэ рВР 329,клонировали в С 1 а 1-сайт плазмиды рЕВ -И/23 -Кз 1) Р 1 Н 4, В этом конструировании40 САТ-ген экспрессировался из промотора6/23 -йз 1). с использованием его собственного сайта связывания с рибосомой. Процесс транляции проходил на одной длинноймРНК-молекуле, которая является общей45 для а-пептида и САТ-генов. После проведения электрофореза в ПААГ полного клеточного белка индуцированных клеток быловыяснено, что две самые сильные полосыотносились к а -пептиду и САЧ-белку. Кон 50 струкцию плазмиды также модифицировалив плазмиду, экспрессирующую белок слияния, В первой стадии этой модификацииудаляли Н 1 пс Н 1-сайт расщепления, расположенный ниже области полилинкера. Этобыло осуществлено путем перевариванияВА. 31-знзонуклеазой после ХЬа 1-расщепления и затем путем рециркуляризации припомощи лигазы Т 4, После чего осуществляли еще одну делецию (после расщепленияв Плазмидную конструкцию осуществляли с использованием вектора экспрессии рКК 223 - 3, содержащего вышеупомянутый "идеальный" промотор (тас-промотор) в качестве исходного материала (1, Вгопз 1 пз;РЬэппаса, Моесцаг 8 оодса 1 ч. 27-4935- 01), который имеет нуклеотидную последовательность, абсолютно идентичную последовательности плазмиды рЕЙ-И/23 в области, кодирующей полный а-пептид и в обеих 3- и 5-нетранслированных областях.Эти две плазмиды одного и того же репликатиеного типа (Со 1), так что, если с их помощью получают разное количество апептида или его мРНК, то это возможно лишь при использовании разницы между двумя промоторами, которые они содержат.Это сравнение не проводили в отношении полупериода жизни мРНК или эффективности трансляции, так как две мРНК, полученные с помощью различных плазмид, являются идентичными.мРНК, полученная с помощью плазмиды рЕВ - Ч 1/23 -МзЦ является короче нэ 4 п,о., чем мРНК, полученные при помощи вышеупомянутых двух плазмид, в других отношениях эта плазмида идентична им, При сравнении указанных трех плазмид, е других отношениях эта плазмида идентична им, При сравнении указанных трех плазмид, проведенном путем измерения количеств продуцироеанных мРНК и а-пептида был установлен тот же порядок; рЕЙ - И/23 - Мз 11; рЕВ-В/23; рКК 223-3 производное, где.каждый вектор обеспечивает экспрессию в 1,5 - 2,0 раз выше, чем последующий.. В приведенных ниже примерах описаны испытания векторов экспрессии настоящего изобретения.П р и м е р 3, Получение белка в Е, соИс помощью новых векторов экспрессии без встраивания чужеродного гена.Уровень экспрессии а -пептида, полученный без встраивания чужеродного гена (М-терминальная часть 3 -галактозидазы в плазмидэх рп)еб И/23 -Мз) и р 1-альфа 1 ж/23 -Из 11 может быть определен не только путем измерения его ферментной активности, но и путем измерения количества полученного белка при помощи электрофореза в полиакриламидном геле с ДДС-йа. В соответствующих клетках-хозяевах ас д, продуцирование а-пептида не может быть обнаружено без индукции. При выращивании бактериальной культуры в УТВ-среде , при 37 С в фазе логарифмического ростаи при индуцировании путем добавления 0,1-5 мМ 1 РТО, экспрессия гена начиналась от промотора о 23 .Св) и вкспрессирован --