Способ получения носителя для иммобилизации белков

Союз СоветсиикСфцианистнчеснинРесттубиин Оп ИСАНИЕИЗЬЬРЕТЕН ИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и 897770(51)М. Кл,С 07 Г 7/02//С 12 й 11/00 3 ЬаударстеенаЮ квинтет СССР не аннан нэебретеннй н аткритнйОт 1 убликовано 15;01.82. Бюллетень М "(53) УДК 577,15. .07(088.8) Дата опубликования описания 18.01. 82 . А.И. Кестнер, Х.Я. Кипперр К.А. Кив 1 тсХ.Р.-В. Егоров, А.Э. Эрин, А.К. Арен(72) Авторы изобретения Таллинский политехнический институт научно-исследовательский институт прбиохимии НПО "Биохимреакти 1) Заявитель 4) СПОСОБ П ИИИОБИЛИЗАЦИ 1 НОСИТЕ ами и активации п носителя пол тся к оности кей длятивнык ластиспосоиммобили о слоялитерат ния но мер пол бел вещест в п олученные пре% именение в кадля проведения й в химической, шевой промышлен 10 Изобретение относи биотехнологии, в час бам получения носител зации биологически ак например ферментов. П параты могут найти пр честве катализаторов ферментативных реакци фармацевтической и пи ности,В настоящее время для иммобилизации ферментов используется большое количество носителей как органической, так и неорганической природы. Наибольшего внимания заслужзтвают органоминеральные материалы; в частности покрытые полимерами пористые крем- неземные материалы. Носители такого типа характеризуются хорошими гидро- динамическими свойствами и достаточной стабильностью получаемых препаратов. Свойства получаемых препаратов во многом зависят от способа покрытия на носителе,уре описан ряд способов ителей для иммобилизац пропитки пористого неорганического материала органическим ппенкообразуецим веществом, содержащим реакционноспособные группы.Известен способ, в котором в качестве пленкообразующего вещества используют полиакролеин, Носитель (Фарфор, измельченное стекло) пропитывают мономером, содержащим свободные альдегидные группировки, Полимеризация происходит на поверхности носителя. В результате модификации носителя таким способом получают носитель со свободными альдегиднымн группами. Иммобилизация фермента (трилсина, па" паина) производится через реакцию альдегидньм групп носителя с аминогруппами фермента 113Недостатком этого способа является малая операционная стабильность по лучаемых активированных носителей.Покрытие неорганического материалалинейными полимерами, обраэукж 1 имисяпри полимеризации винильных полимеров, не обеспечивает достаточную нерастворимость, а следовательно, стабильность получаемых ферментных препаратов, Этот способ также ограничивает модификацию носителя альдегидсодержащими полимвраьв, а свяэываниеферментов только через альдегидныегруппы не всегда дает возможность получить препараты с высокой активностью и высокой стабильностью. Известныйспособ не обеспечивает также и высокого содержания белка на единицу носителя. (При иммобилизации трипсинадостигается связывание до 0,2 мгбелка иа 1 мл носителя)Известен также способ полученияносителей для иммобилизации белковпутем пропитки пористого неорганического носителя органическим плеикообразующим веществом. В качестве ;пленкообразующего вещества используют эпоксидную смолу. отверждение которой на носителе проводят при помощи полиэтиленполиамнна. Носитель далее активируют при помощи реагентов,выбранных из группы, включащей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой кислоты, пара-бензохинон 1",21,Недостатком этого способа являетсяневозможность несложной регенерацииносителя после инактивации иммобилизованного фермента в процессе его использования, небольшая реакционостойкость и стабильность носителя,Целью изобретения является повышение реакцноноспособности носителейотносительно белков, повышение стабильности получаемых коньюгатов иобеспечение регенерации носителя.Цель достигается тем, что согласноспособу получения носителя для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразукзцнм веществом,содержащим реакционноспособные группы, с последукицей активацией носителяреагентами, выбранными из группы,включающей глутаровый диальдегид,диизоцианат адипиновой кислоты илипара-бензохинои, неорганический носитель пропитывают растворами адипиновой кислоты и 1,6-гексаметилендиаминав соотношении эквивапентов адипиноврйкислоты и 1,6-гексаметилендиамина1:1,5 после чего осуществляют поли 1110 4конденсацию при 80-200 С в атмосфере инертного газа в течение 2-3 ч,Способ осуществляется следующим;образом.Неорганический материал, предпочтительно силохром или силикагель,смачивают водным раствором, содержащим адипиновую кислоту и 1,6-гексаметилендиамин в соотношении эквива 1 О лентов адипиновой кислоты и диамина1.1,5. Носитель высушивают при 140 ЕСи после высушивания прокаливают в. специальной трубке в атмосфере пропанбутана при 180-200 С в течение 2-3 ч.Ф1 Затем носитель промывают водой и ацетоном и сушат при 120 С. Полученныйноситель (с содержанием активных аминогрупп в количестве 5 Ц мк экв на 1 гносителя) используют для иммобилиза 2 е ции протеолитических ферментов (трипсина, химотрипсина, панкреатина) спомощью бифуикциональных реагентов,таких, как глутаровый диальдегид,диизоцианат адипиновой кислоты или2 З пара-бензохинон,Л р и м е р 1, Получение носителя,модифицированного полиамндом,Для получения носителя проводятреакцию полимеризации адипиновой кислоты и гексаметилендиамна в порахносителя при количестве амкна свьппеэквимолярного(соотношение эквивалентов 1:1,5), 5 г силохрома или силикагеля смачивают 1 мл водного раствора, содержащего 0,13 г адипиновой кисЗф лоты и 0,16 г 1,6"гексаметилендиакна.Смоченный носитель,высушивают при140 С, проиаливают в специальной трубке (обмотанной нагревательной хромоникелевой проволокой) диаметром 40 мм40в атмосфере пропан-бутана при 180200 С в течение 2 ч. Затем промывают водой и ацетоном и высушивают при120 С.В результате получают носитель,фф содержащий на поверхности активныеаминогруппы в количестве 50 мк эквна 1 г носителя. Полученный носительиспользуют для иммобилизации протеолитических ферментов (трипсина, химоЖ трипсина, панкреатина) с помощью бифункционапьных реагентов, таких какглутаровый альдегид, диизоц-.нет адипиновой кислоты и п-бензожлнон.П р и м е р 2. Получение нераст 35 воримого Аерментного препарата с использованием носителя, модидлцированного полиамидом, актит.;-ро;.аннемглутаровым альдегидам.35 40 К модифицированному погыамидомносителю (5 г) добавляют 15 мл2%-ного водного раствора глутарового альдегида, Смесь перемешивают ивыдерживают при комнатной температурев течение 2 ч. После этого материалотмывают дистиллированной водой отглутарового альдегида на воронкеБюхнера до исчезновения глутаровогоальдегида в промывных водах и к влажному активированному носителю добавляют 5 мл раствора фермента (химотрипсина) с концентрацией 50 мг/мпв боратном буфере рН 8,0, Смесь перемешивают для удаления воздуха изпор и выдерживают при 20 С,в течениеч. После инкубации препарат проьвгвают в воронке Бюхнера боратным буфером рН 8,0 1 М раствором хлористогонатрия и затем еще боратным буЬером,добавляя эти растворы порциями. Объемпромывных вод составляет 100 мл.Полученный иммобилизованньвг препарат хранят во влажном виде в боратиом буфере в холодильнике.Содержание белка з препарате химотрипсина, определенное.по модифицированному методу йоури, составляет 15,5 мг/г (45% от количества, использованного для иммобилизации).Ферментативную активность препаратаопределяют на синтетическом субстрате этилового эфира ацетил-тирозина (АТЭЭ). Препарат обладает активностью 1550 Е/г. Выход иммобилизации по активности составляет 8,0%.Стабильность препарата при операционных условиях оценивают по остаточнойактивности после проведения гидоолиза 2%-ного раствора казенка с рН 8,0.при 30 вС в течение 17 ч в реакторес активным ротором (контрольный гид.ролиэ). После такого гидролиза препарат иммобилизованного химотринсинаобладает активностью 1050 Е/г, чтосоставляет 68% от исходнойП р и и е р 3. Получение нерастворимого Ьерментного препарата с использованием носителя, модиЬицированного полиамидом, активированием диизоцианатом адипиновой кислоты,К 5 г модиЬицированного полиамидомносителя (пример 1) добавляют 20 мп0,25 н раствора диизоцианата адипиновой кислоты в толуоле и смесь кипяотят при 110 С в течение 1 ч. Послеэтого носитель Ьильтруют, промываютРацетоном и вггсунизают при 110 С втечение 1 ч, Вследствие такой обработ" ки получают носитель с активными изоцианатными группами. Носитель смачивают 8 мп боратного буЬера, Иммобилиэацию химотрипсина проводят, как описано в примере 2. Получают препарат химотрипсина с активностью на АТЭЭ 2400 Е/г; выход иммобилизации по активности составляет 18,6%. Содержание в препарате белка 16,8 мг/г и выход белка 48,8%.После контрольного гтщролиза препарат обладает активностью в количестве 44% от исходной,П р и м е р 4. Получение нерастворимого ферментного препарата (иммобилизованного химотрипсина) с использованием носителя, модиЬицированного нолиагягдом, активированием и-бензохнноном.5 г модийицирозанного полиамидом носителя (пример 1) нагревают с 20 мп0,5%-ного водного раствора и-бензохинона на водяной бане в течение 1 ч.Затем носитель промывают водой и ацетоном и высушивают при комнатнойтемпературе, Активированньп носительсмачивают 8 мп боратного буфера.Иммобилизацию химотрипсина проводят,как описано в примере 2. Получаютпрепарат с активностью 7200 Е/г (на АТЭЭ); выход иьягобилизации тго активности составляет 37,2%, Содержание белка в препарате состазляет 21,2 мг/т и выход белка 61,6%. После контрольного гидролиза препарат обладает активностью 60% от исходной.П р и и е р 5. Получение нерастворимого ферментного препарата (иммобилиэированиого панкреатина) с использованием носителя, модиЬицированного полиамидом, активированнем п-беизохиноном,5 г модифицированного полиамидом носителя (пример ) обрабатывают п-бензохиноном. как в примере 1. Лктивировангый носитель смачивают 8 мп боратного буФера. Иммобилизации паггкреатина проводят, как описано в примере 2, с тем различием, что концентрация фермента составляет 80 мг/мп. Получают нерастворимый препарат панкреатина с активностью 17,4 Е/г (активность определяют на 2%-ном раствореказеина), Выход иммобилизации по активности 23,6%. Содержание белка впрепарате составляет 24,2 мг/г и выход белка 56%. После контрольного гидролиза сохраняется 58% от исходнойактивности,897770 Формула йзобретения Составитель А. БочаровРедактор П, Веселовская Техред С. Мигунова Корректор У. ПономаренкоЗаказ 11869/33 Тираж 389 ПодписноеВН 11 ИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий11303 э 11 осква Л1 аушская наб, д. 4/5Фи 1 нтзл ППП Плтент, г. Ужгород, уп, Проектная,П р и м е р 6, Получение регенерированного носителя, пригодного для последукщего модиФицирования полимерами.Для удаления полиамидного покрытия с поверхности пор кремнеземсодержащего материала и возобновления свойств поверхности его проводят гидролиз с минеральной кислЬтой при кипячении.100 г регенерируемого носителя помещают в 1-литровую колбу, снабженную механической мешалкой, Добавляют 500 мл 1 н соляной кислотыи кипятят при перемешивании (600- 800 об/мин) в течение 1 ч, После этого раствор декантируют и носитель моют два раза горячей водой. Затем носитель высушивают на кювете при комнатной температуре или в термостате при 140 С. Способ получения носителя для иммобилизации белков путем пропитки пористого неорганического материала органическим пленкообразующим веществом, содержащим реакционноспособныегруппы с последующей активацией носителя реагентами, выбранными из группы включающей глутаровый диальдегид, диизоцианат адипиновой кислотыили пара-бензохинон, о т л и ч а ю -щ и й с я тем, что, с целью повышения реакционной способности носителя,10 повьппения стабильности получаемыхконъюгатов и обеспечения регенерацииносителя, неорганический носитель.пропитывают растворами адипиновойкислоты и 1,6-гексаметилеидиамина в15 соотношении эквивалентов адипиновойкислоты и 1,6-гексаметилендиамина1:1,5, после чего осуществляют поликонденсацию при 180-200 С в атмосФере инертного газа в течение 2-3 ч,20 Источники инЬормации,принятые во внимание при экспертизе1. Патент Великобритании В 1342136,кл. С 03 Н 1/02, опублик, 1973.2. Авторское свидетельство СССРд по заявке Ф 2490496/23-04, клкл. С 07 Й 7/02, 1977 (прототип).