Способ выделения вирусных антигенов

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 19432 А я)5 С 12 К 7/00 ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН АВТОРСКОМУ СВ ЕЛЬСТВ щ. 198 Апв 1977,87, %11,с. генетика, 19 ЕЛЕН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(54) СПОСОБ ВЫД ИЯ ВИРУСНЫХ АНТИГЕНОВ(57) Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к химическим методам получения белковых фракций вирусов,Изобретение относится в области медицины и ветеринарии, а именно к химическим. методам получения белковых фракций вирусов, и может быть использовано при конструировании диагностических препаратов.Известен способ получения вирусныхантигенов путем осаждения вариантов полиэтиленгликолем (ММ 6000) или высаливания сульфатом аммония,Однако эти методы характериэуютея. низким выходом и недостаточной степеньюочистки вирионов, что не позволяет получать воспроизводимые результаты,Известен также фильтрационно-хроматографический метод, обьединяющий в себепреимущества микрофильтрации и молекулярно-ситовой хроматографии. и может быть использовано при конструировании диагностических препаратов, Цель - повышение выхода целевого продукта. Для осуществления способа в клеточно-культуральную среду вносят преципитационную смесь следующего состава, об.0: твин 20 7-13; 100-ный раствор хлорида кальция 10- 20; 32 - 40;-ный раствор ПЭГ (м,в. 4000- 6000) на растворе Хенкса рН 7,2-7,4 остальное. Полученную смесь инкубируют при постоянном перемешивании при 410 С в течение 4 - 5 ч, а затем центрифугируОют, К выделенному осадку добавляют зкстракционную смесь, содержащую додецилсульфат натрия и хлорид калия на 0,02-ном растворе Версена, и инкубируют в течение 1,5 - 2 ч, Затем экстракционнуюБ смесь центрифугируют и отделяют супернатант, 11 табл. Известен способ выделения вирусных 4 антигенов, включающий следующие операции: после появления полного цитопатиче- со ского действия вируса культуральную ф жидкость вместе с клетками собирают и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. В дальнейшем из осадка клеток антиген экстрагируют в 4 раза 20-ным раствором тритона Хв 1 М КС 1 (рН 7,0), После 30 мин: а перемешивания при комнатной температуре материал центрифугируют 5 мин при 10000 об/мин, Затем надосадочную жидкость из 4 проб смешивают. Полученный экстракт является концентратом антигена из клеток.Недостатками прототипа являются частичная потеря на начальном этапе культу- ральной, вирусосодержа щей среды,- первичная культура почек теля а б каза Конечнне, в концентрате Исхо Обций белок, Элект н, нп Титр вируснйх белков в РСКбъеи ККС ОД, Титр вир нл РСКная никроскопня Энхойвирусннх иг оае 4 Ф ФЕЕрейлагае" 1000+Ве 5 1 й 2549 э 7+5 ь 17 5 э 49+Оъ 05 вй иетод:10250,9+Е,17 14,ЗаЗ,1 1000 а 10 ич фКК хеита ИРТ клеточно-культуральная среда, садерзщ бцнй белж по Лэури рус кц ктор О.Осиповых рректор Т.Малец Заказ 741 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ ССС 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 изводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород. ул.Гагарина, 101 Получаникон центрата вирусбелков ставитель Э.А,Макаринхред М.Моргентал Структура нуклеокапснйасохранена, количествоего увеличено, Отмеченоболыюе количество вирконов ИРТ Отнечено знач иеньюее колич окапсийа с ча полностью изие структуройпредставляющей собой запас вирусногобелка; неполная экстракция клеток, содержащих вирусные белки; структурные нарушения вирусных антигенов; низкаяактивность выделенных белков, 5Цель изобретения - повышение выходацелевого продукта.Поставленная цель достигается тем, чтов способе выделения вирусных антигеновпутем осаждения клеточно-культуральной 10среды, экстрагирования антигенов раствором, содержащим хлорид калия, и последующего центрифугирования, осаждениеклеточно-культуральной среды проводятсмесью следующего состава, об%; 15Твин 20 7 - 13100 -ный раствор хлорида кальция 10 -2032 - 4070-ный раствор ПЭГ (м,в, 40006000) на 20растворе Хенкса рН 7,2 - 7,4 Остальноепри постоянном перемешивании в течение4-5 ч при 4 10 С, затем смесь центрифугируют при 4300 - 5200 ц в течение 35-40 мин, 25а экстрагирование антигенов из образовавшегося осадка проводят 0,020 -ным раствором Версена, содержащим додецилсульфатнатрия и хлорид калия при следующем соотношении компонентов, гlл: додецилсульфат натрия 8-12; хлорид калия 74-75, втечение 1,5-2 ч с последующим центрифугированием зкстракционной смеси при 860010400 ц в течение 10 - 15 мин с отделениемсупернатанта. 35Обоснование количества ингредиентовсостава для преципитации (ПС) и экстрагирования антигенов (ЗС), используемых приосуществлении предлагаемого способа.Отклонения; допущенные при приготовлении состава ПС и ЭС в сторону увеличения или уменьшения количеств влияют накачество получаемой субстанции вирусныхбелков. 45Качественно-количественный составПС и.ЭС обоснован оптимальными результатами выделения максимального количества обогащенной фракции вирусных белков(табл.1).Обоснование указанных режимов представленно в табл, 2.Такие ингредиенты, как Твин(40 или80), 10 -ный раствор хлорида кальция идодецилсульфат натрия, а также и композиционный ЭС и ПС предложены для выделения вирусных белков впервые.. Длительность хранения ПС и ЭС составляет 122 мес при 5+2 С,ПС получают следующим образом,Предварительно готовят 32-40 -ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) м.в. 4000 - 6000 на растворе Хенкса. Затем берут 7-13 мл Твина 20, 40 или 80, добавляют 10-20 мл 100 -ного хлорида кальция (коммерческий раствор в ампулах) и доводят смесь до 100 мл ранее приготовленным 32 - 40 -ным раствором ПЭГ.Таким образом получают ПС следующих составов, мл:Твин710%-ный раствор хлорида кальция 10 32%-ный раствор ПЭГ (м,в.4000) на растворе Хенкса рН 7,2 до 100 1 Твин13100 -ный раствор хлорида кальция 2040-ный раствор ПЭГ(м.в,6000) на растворе Хенкса рН 7,4 до 100Твин10100 -ный раствор хлорида кальция 15360 -ный раствор ПЭГ(м.в,5000) на растворе Хенкса рН 7,3 до 100ЭС получают следующим образом. 0,8- 1,2 г додецилсульфата натрия и 7,4-7,5 г хлорида калия растворяют в 10 мл 0,02%-ного раствора Версена (коммерческий).Таким образом были получены следующие составы ЭС:И Додецилсульфат натрия 0,8 г Хлорид калия 7,4 г0;02 -ный раствор Версена (коммерческий) до 100 млЧ Додецилсульфат натрия 1,2 г Хлорид калия 7,5 г0,02%-ный раствор Версена (коммерческий) до 100 млИ Додецилсульфат натрия 1,0 г Хлорид калия 7,45 г0,020 -ный раствор Версена (коммерческий) до 100 млП р и м е р 1. Выделение вирусного антигена из ККС, содержащей РСВ. Респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) штамм " опц" культивируют по разработанному способу, однако возможно культивирование РСВ любым другим известным способом.ККС разделяют на 2 равные части, одну из которых - контрольную, обрабатывают известным способом. Опытную часть обрабатывают следующим образом.В ККС, взятую в обьеме 1 л с исходным титром 1:2095, вносят преципитационную смесь состава, мл,Твин710-ный раствор хлорида кальция 10 320 -ный раствор ПЭГ м,в. 4000 на рас- твореХенкса рН,7,2 в количестве 200 мл до 100 млПолученную смесь инкубируют при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 ч при 4 С, затем центрифугируют при 4300 д, в течение 40 мин. Супернатант сливают, а к осадку добавляют экстракционную смесь (ЭС) состава;Додецилсульфат натрия 0,8 г Хлорид калия 7,4 г0,02% раствор Версена (коммерческий) До 100 млиз расчета 7 мл ЭС на осадок, полученный из 1 л преципитированной ККС. Полученную взвесь инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке при 37 С в течение 1,5 ч и затем центрифугируют при 8600 д в течение 15 мин. Супернаант в количестве 12 мл, содержащий белки в количестве 20,68 мг/мл, отделяют и используют в качестве сенситина для приготовления диагностикумов.П р и м е р 2. Способ проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что в качестве ПС используют состав, мл:Твин1010%-ный раствор хлорида кальция 1536%-ный раствор ПЭГ м.в. 5000 на раствореХенкса рН 7,3 До 100Полученную смесь.инкубируют в течение 4 ч при 10 С, затем центрифугируют при 5200 д в течение 35 мин.В качестве ЭС используют состав: Додецилсульфат натрия 1,0 г Хлорид калия 7,45 г0,02%-ный раствор Версена До 100 мл инкубацию полученной взвеси проводят при 30 С в течение 2 ч и затем центрифугируют при 10400 д в течение 10 мин. Отделяют супернатант в количестве 9. мл, содержащий 18,32 мг/мл белка.Полученные концентраты вирусных белков (РСВ) анализировали на выявление титров антител в референс-сыворотках, определение структуры нуклеокапсида и наличие вирионов с помощью электронной микроскопии 3 ЕМВ известным способом; содержание белка по методу Лоури.Выделенные концентраты вирусныхбелков оценивают в реакции связывания комплемента (РСК) по цитопатическому действию (цПД) и в реакции агглютинации целлюлозы (РАЦ). Результаты титрований представлены в табл,З, где на примере серологических исследований изучена результативность получения РС-вирусных белков, 20 35 40 с данными электрофореза вирионов РС-виру 45 са, клеток для культивирования РС-вируса и сыворотки крупного рогатого скота (КРС), Это 50 510 25 30 Представленные в табл. результаты по : титрованию вирусных белков, полученных по известному и предлагаемому способам, показывают преимущество предложенного способа. При анализе указанных цифровых данных можно отметить, что вирусные белки, полученные по предлагаемому способу, в 3-128 раз превышали по своей активности результаты прототипа.В таблице.4 представлены усредненные данные по выходу белков, полученные в 19 опытах, а также результаты электронной микроскопии,Как показывают результаты, приведенные в табл:4, содержание белков в концентрате,.полученном предложенным способом в 4 раза больше, чем известным,Электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) на установке"Мультифор 2117" (1 КВ, Швеция) с применением имидазольного буфера в 10% ПААГ без системы концентрирующего геля. Для лизированных вирусных белков и примесей использовали тот же буфер с ДСН без мериаптоэтанола. Окраску электрофореграмм проводили с помощью красителя кумаси (6 - 250, "Яегча", ФРГ),Общий белок полученных вирусных концентратов представляет собой вирусные белки, белки клеток для культивирования вируса, включенные в состав вирионов и белков среды культивирования (сывороточные белки).При изучении электрофореграмм вирусных концентратов, полученных по прототипу и предлагаемому способу, отмечено, что в последнем случае происходит полное расщепление не только вирионов, но и инфицированных клеток.Электрофоретические исследования ви. русных концентратов, полученных по прототипу и предлагаемому способу, сопоставлены позволило выявить вирусспецифические и балластные белковые фракции, полученные на электрофореграммах. Материалы проведенных исследований представлены в табл,5, Полученные результаты электрофореза позволили заключить, что с помощью предлагаемого способа удается получить значительно большее количество белков, чем по прототипу. Так, на фореграммах выявлено 1.0 различного молекулярного веса белковых фракций, среди которых присутствуют как высоко -,средне-, так и низкомолекулярные белки. В случае электрофореза вирусно 1719432го концентрата по прототипу возможно получение 4 фракций белка.Было показано, что специфическими РС-вирусными белками являются фракции белка с ММ 160, 80, 56, 44, 37 и 24 кД. В это перечисление входят как белки суперкапсида, так и нуклеокапсида (ядро вируса). Представлен ные в табл.5 результаты электрофореза показали преимущество предлагаемого способа в сравнении с прототипом. Более того, тканевые белки, содержащие также и вирусные, могут быть с успехом применены для дальнейшей работы по приготовлению диагностических препаратов,П р и м е р 3. Выделение вирусного анхигена из ККС, содержащей вирус диареи (ВД),Вирус диареи, штамм "Оригон", культивируют известным способом, После получения вирусного урожая ККС разделяют на две равные части, Одну из них - контрольную - обрабатывают по прототипу, К другой части ККС Ь объеме 1 л и исходным титром 1:4584 добавляют 220 мл ПС состава, мл:Твин13100 -ный раствор хлорида кальция 20400 -ный раствор ПЭГ м.в. 6000 на растворе Хенкса До 100Полученную смесь инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке в течение 4 ч при 4 С, затем центрифугируют при 4300 9 в течение 40 мин. Супернатант сливают, а осадок детергируют в ЭС состава:Додецилсульфат натрия 1,2 г Хлорид калия 7,5 г.0,02 о -ный раствор Версена До 100 млЭС добавляют к осадку в количестве 5 мл на осадок, полученный от 1 л ККС,Полученную взвесь инкубируют при перемешивании на магнитной мешалке при 37 С в течение 2 ч, Полученный экстракт клеток центрифугируют при 10400 9 в течение 15 мин. Получают 9,8 мл супернатанта, содержащего 49,83 мгмл белка,В табл.б представлены данные по определению активности выделенных вирусных белков.Анализируя представленные в табл, 6 данные по определению активности выделенных вирусных белков в концентрате, можно отметить преимущество предлагаемого метода. При этом титры вирусных белков превышали аналогичные показатели прототипа в 4 - 8 раз,В табл,7 представлены результаты электрофореза полученного концентрата. Из представленных в табл.7 результатов электрофореза видно, что с помощьюпредлагаемого способа удается выделить 16фракций белка вместо 6 в прототипе,5Из 16 фракций 9 принадлежат суперкапсидной и нуклеокапсидной фракциям ВД, 4- клеточным белкам и 3 - белкам сывороткиКРС,По прототипу ЭФ полученного концен 10 трата позволяет определить только 5 вирусспецифических фракций белка.В табл,8 представлены усредненныеданные по выходу белка и результаты электронной микроскопии, полученные в 23 опы 15 тах,Из приведенных данных видно, что выход белка по предлагаемому способу в 5 развыше, чем в прототипе,П р и м е р 4. Выделение вирусных бел 20 ков из ККС, содержащей вирус инфекционного ринотрахеита (ИРТ),Урожай вируса ИРТ, штамм М 4016,получают известным образом, ККС инкубируют при 5 С в течение 5 ч при постоянном25 перемешивании на магнитной мешалке вприсутствии ПС состава .Преципитационную смесь вносят в ККСв количестве 200 мл на 1 л ККС. Через 5 чпреципитированную ККС центрифугируют30 при 5200 9 в течение 35 мин, Супернатантсливают, а осадок детергируют в ЭС составаЧ при соотношении: б мл ЭС на осадок,полученный при приципитации 1 л ККС.Полученную взвесь инкубируют при пе 35 ремешивании при 37 С в течение 1 ч 20 мини затем экстракт клеток центрифугируютпри 11000 об/мин в течение 15 мин. Отделяют супернатант в количестве 9,54 мл и анализируют.40 В табл,9 представлены результаты титрования полученного экстракта.Из представленных в табл.9 материаловпо титрованию вирусных белков в концентратах видно, что выделение вирусных бел 45 ков по предлагаемому методу значительнопревосходит прототип, Об этом свидетельствуют результаты титрований концентратов в РСК, ЦПД и РАЦ, где данные попредлагаемому методу превосходят прото 50 тип в 2 - 8 раз,Таким образом, независимо от видовойпринадлежности, структурных и геномныхособенностей предлагаемый метод позволяет получить вирусный концентрат, зНачи 55 тельно обогащенной по белку,В табл,10 представлены результатыэлектрофореза полученного концентрата.Представленные в табл,30 результатыэлектрофореза позволили заключить, чтоэлектрофоретическая характеристика ви10 1719432 таким образом значительно повысить выходбелка при одновременном повышении их активности. Располагая широким диапазоном различных белковых фракций, становится возможным получение строго специфических антисывороток для диагностики целого ряда вирусных заболеваний, что необходимо для своевременной и точной постановки диагноза. русного концентрата, полученного по предлагаемому варианту, содержит значительнобольшее количество белковых фракций, чемпри форезе концентрата, полученного попрототипу: 15 фракций по предлагаемому 5методу и 6 - по прототипу.Из 15 фракций белка все, кроме фракций с ММ 190 кД, являются вирусспецифическими, а из 6 - все 6 фракций. Однако вконцентрате, полученном по предлагаемому методу, на 9 фракций белка больше, чемв прототипе.Таким образом, получение вирусногоконцентрата вируса ИРТ по сравнению спрототипом позволяет выделить обогащен-" 15ный спектр белковых фракций суперкапсида и нуклеокапсидной фракции,В табл 11 представлены результаты поопределению выхода белка и электронноймикроскопии. Из данных табл.11 видно, что 20выход белка по предлагаемому способу в 3раза выше, чем в прототипе.Таким образом, преимущество предлагаемого способа состоит прежде всего втом, что для выделения белка на первом 25этапе используется клеточно-культуральнаясреда, содержащая вирус и его антигены,обрабатываемая преципитационнойсмесью. Это позволяет в значительной степени преципитировать и осадить вирионы, 30инфицированные вирусом, балластные (сывороточные) белки, свободные вирусные антигены. Затем; на втором этапе, применяяспециально подобранный состав (экстракционная смесь), удается в максимальном 35количестве экстрагировать из инфицированных клеток целый спектр вирусных белков, а также дезинтегрировать вирионы и Формула изобретения Способ выделения вирусных антигенов, включающий осаждение культуральной среды, зкстрагирование антигенов раствором, содержащим хлорид калия с последующим центрифугированием, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, осаждение культуральной среды проводят смесью следующего состава,. об%:Твин7 - 13; 10 -ный раствор хлорида кальция 10-20; 32-40 -ный раствор полиэтиленгликоля (М,М, мол.М. 4000 в 60) на растворе Хенкса рН 7,2 - 7,4 до 100, при постоянном перемешивании в течение 4 - 5 ч при 4-10 С, центрифугирование проводят 4300-5200 9 в течение 35-40 мин, а экстрагирование антигенов - 0,02-ным раствором Версена, содержащим додецилсульфат натрия и хлорид калия при следующем соотношении компонентов, г/л: додецилсульфат натрия 8-12; хлорид калия 74 - 75; 0,02%-ный раствор Версена остальное,в течение 1,5 - 2 ч, после чего экстракционную смесь центрифугируют при 8600-10400 9 в течение 1.0-15 мин, а супернатант отделяют. Таблица 1 Ингредиенты Количество инг е иентов Увеличение от казанного Нарушение структуры вирусных белковПС 32-400 -ной водный раствор полиэтиленгликоля (м.в 4000-6000)100-ной раствор СаС 2 Твин( 40 или 80 (коммерческий) ЭС: Додецилсульфат натрия КС 1 0,020-ный раствор Версена комме ческийУменьшение от казанного Недостаточная преципитация вирусных белков1719432 Таблица 2 Показатели Увеличение Уменьшение Инкубация ККС ,содержащей4вирус более 5 при +10 Сотрицательно сказываетсяна. структуре вьделяемогобелка Преципитания:Инкубация Инкубация ККС, содержащейвирус менее 4 ч при 14 Сне позволяет добиться максимальной преципитации белков Центрифугирование преципи"тированной КС, содержащейвирус, более 6000 об/мин втечение 35 мин отрицатель-.но влияетна структурныесвойства выделяемой Фракции белка Центрифугирование преципитированной ККС .менее 5000 об/минв течение 40 мин не позволяет получать плотный осадокпреципитата, содержащего белки Центрифугирование Инкубация преципитата привыше 37 С в экстракционной смеси более 2 ч приводит к нарушению структурных образований выделяемой фрак" ции белка Экстрагирование:Инкубация Инкубация преципитата при С ниже 30 С в экстракционной смеси менее 1,5 ч приводит к значительному уменьшению вьделяемой фракции белка Центрифугирование экстракта более чем при 12000 об/минв течение 15 мин способствует уменьшению вьделяемойбелковой фракции5000 об/мин = 4300 ц6000 об/мин = 5200 д Центрифугирование Центрифугирование экстракта менее, чем при 10000 об/мин,в течение 10 мин приводит кпотере белка 10000 об/мин = 8600 д12000 об/мин = 10400 д1 ф 11 ЦМ 1 Ма3 от,мхцфюзлоц 11 Ф ах1 11 1 .Щ1 С 1 Д6ц2 фоцхф1тл1 Хтл11 Я 1 33 Х93- 11 х 1 а91 9 1 1 а с 33.1б 3 1,е9 11Х 11 1 1 вег еь11 93оУ Цф 11 ЛД 1 Я1 3 ОУМа о3- ХО. ОО1 т т 3 е11-тф 131 311о л Э 9 се Ц 9 а ф 3 У з. тс арво 9 ттэ ахт хсэ о,в а 3 9 Ф р Ы ц уа х ф 3 Э т л т й 3ее3 НеЦ ефьН 33 Ъ цъ О 3 О а 3 М.Ф О 3 033а ОЪ ЦЪ о о счОЪ а 3 Ъ 33 Ъ л чъ ОЪ иъ Са ОЪ 1. сч 3 Ъ МЪ соиЪ + СЭ ОЪ оаь 3 3 ЪТ ОЪ Сс о + 3 Ъ Э 3 Ф01 Иамх .1 й аа1 31 Х13 Ъ сЪ л ча ОЪ ЪО ъй л1 Х 1 СС Ах хЭР соЮ сч 1 Ю о Сс Н ь Ю о с13оФ Х1 1 1 1 1 1 1 1 СО, 11 й1х1 1 1 1 Э 1111 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1 1( 1 1 1 1 1 1 1 11 1 1 1 1с1 Х11 Э 11 О Ух . с1 Х 38 Х 13 О 111 1 о Эйзен р ч ХХХ 1 Эа ах й э хйси Ха Э 3- о ьийс 1айо чУхйхихЭ Сххуйх 52иЭ Эгсхссфао оХСЪ ХС 1