Способ получения l-аланина

(21) 440823 (22) 26.04,8 (46) 15.03.9 (71) Научн ческий инс (72) А,Г.Ази рян стве, химической, ф щевой промышленн ния является повыш Способ заключается честве продуценто ВгечЬастегцв Ла В.йачцв ВКПМ В - 3 ера АА 5 и АА 6 со статочных по одновременно ус аминомасляной ки заразой, аммо минеоальными сол ществами после 9 ход 1-аланина дос м ераорганизмов под ВКПМ Вс мышленных микро ми ВКПМ Ви вен но.Штаммы полу ными приемами и 14067 (коллекцион ответст- лекционв АТСС В). ны генетика-сштамма ВЯач и номер ВКПМ Мутации устойчивости к О,1: а- аминомасляной кислоте могут быть либо спонтанными, либо индуцированными в результате обработки микроорганизмов любым химическим например, М-метил-М -нитро-й.нитро.зогуанидин) или физивеоким Гнапример, х ультрафиолетовые лучи) мутагеном. Совмещение в геноме микроорганизмов мутации устойчивости к О,1: а - аминсмасляной кислоте и мутации осуксотрофности по О-аланину может быть осуществлено в любой последовательности.Получение штамма В,йачцв ВКПМ В. ГОСУДАР СТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР(57) Изобретение относится к микробиолотической промышленности и касается получения аминокислоты 1:аланина. которыйможет быть использован в сельском хозяйИзобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения аминокислоты 1:аланина, который может быть использован в сельском хозяйстве, химической, фармацевтической и пищевой промышленности.Целью изобретения .является повышение выхода 1.-аланина.Способ заключается в следующем.В качестве продуцентов используют мутантные штаммы Вгач 1 Ьастег 1 цв Йачцв, обладающие наряду с потребностью в О-аланине устойчивостью к О,1: а аминомасляной кислоте.Примерами штаммов продуцентов 1- аланина, недостаточных по О-алакину, обладающих устойчивостью к О 1.- а-аминомасляной кислоте, являются следующие мутанты бактерий вида ВгечЬас 1 ег 1 цв йачцв: штаммы В,Пачцв АА 5 и АА 6, депонированные во Всесоюзной коллекции проармацевтической и пиости, Целью изобретеение выхода 1:аланина В использовании В кав 1-аланина штаммов чцв ВКПМ Ви 992 (лабораторные но- ответственно), недоО-аланину и тойчивых к 0,1- аслоте. На среде с санийным азотом, ями и растовыми веб ч ферментации вытигает 43.82 г/л,5 30 35 40 45 50 55 Штамм В.Лачце ВКПМ В - 42 выращивают в мясопептонном бульоне (МПБ) при 30 С с аэрацией до достижения титра 10 клеток/мл, клетки отмывают от МПБ центрифугированием и ресуспендируют в цитратном буфере (рН 5,5). К полученной суспензии добавляют И-метил-К -нитро-Инитрозогуанидин (Н Г) до конечной концентрации 300 мкг/мл и инкубируют в условиях аэрирования в течение 20 мин при 30 С, Затем клетки отмывают от мутагена охлажденным МПБ, переносят в пробирки с 10 мл МПБ, инкубируют в течение 1 В ч при 30 С и рассеивают на поверхности среды следующего состава, мг/мл воды; глюкоза 20; Ка 2304 2; К 2 НРО 4 1; КН 4 С з; КН 4 ЧОз 1; М 9304 х 7 М 20 0,1; МпЯО 4 х 5 Н 20 1 х 10 Ре 304 х 7 Н 20 1 х 10; биотин 5 х 10 "; тиомина хлорид 1 х 10 .; агар-агар 20; О,: а - аминомасляная кислота 30; рН 7,4.Колонии, выросшие на этой среде после 4 - 5 сут инкубирования при 30 С, выделяют и проверяют их алолзинпродуцирующую способность, Один из отобранных таким способом мутантов, продуцирующий повышенные количества ОА-аланина, вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, нуждающиеся для роста в О-аланине, известным методом. Штамм ВУачцв ВКПМ В является одним из отобранных таким способом мутантов.Получение штамма В.Лачца ВКПМ В.Штамм ВЛачца ВКПМ Вобрабатывают НГ и отбирают мутант, нуждающийся в О-аланине. Полученный мутант вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, устойчивые к О,:ааминомасляной кислоте, как это описано при получении штамма В.Лачцв ВКПМ В, но с той разницей, что в состав среды вносят также О-аланин в концентрации 0,1 мг/мл, Один из отобранных таким образом мутантов, продуцирующих повышенные количества .-аланина; обозначен В.Лачцгл ВКПМ В - 3992,Штаммы-продуценты-аланина В.йачцв ВКПМ В - 3991 и ВКПМ Впо своим культурально-биохимическим признакам не отличаются от исходного штамма В.йачца ВКПМ В - 42, за исключением признаков устойчивости к О.- а - аминомасляной кислоте, ауксотрофности по О- аланину и-аланинпродуцирующей способности.Штаммы имеют следующую характеристику.Культурально-морфологические признаки. Клетки овальные, слегка вытянутые, длиной 1,7-2,5 мкм, бесспоровые, неподвижные, грамположительные.На мясопептонном агаре (МПА) на 2 сут роста при 30 С образуют колонии диаметром 2 мм, круглые, гладкие, окрашенные в желтоватый цвет.Штрих на МПА: на 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, плотная, цвет желтовато-кремовый. Рост по уколу в МПА: умеренный, в основном на поверхности среды.Минеральная среда Гловера с глюкозой: для роста необходим биотин, тиамин и О-аланин, 2 сут роста при 30 С колонии диаметром 1 мм, цвет светло-кремовый. Рост штриха на 2 сут умеренный, плотный, цвет светло-кремовый, На картофере рост и образование пигмента с желтым оттенком.Желатину на разжижают. Физико-биохимические признаки.Отношение к источникам углерода: ассимилирует глюкозу, сахарозу, маннозу, фруктозу, мальтозу; слабее - галантозу, рамнозу,сорбозу,сорбит,ацетат,этанол; не ассимилирует лактозу.Отношение к источникам азота: ассимилирует аммонийный азот, мочевину.Факультативные аэробы.Оптимум роста при 30 - 32 С и рН 7,2- 7,8,Отношение к антибиотикам; чувствительны к канамицину, тетрациклину, ампициллину, левомицитину (хлорамфениколу) и стрептомицину,Отношение к фагам: чувствительны к представителям всех известных на сегодняшний день 7 групп бактериофагов, лизирующих В.Пачцт, которые выделены на производстве лизина (группам ЭВ, Нф, Еф, ТфЛф и Кф), Эти группы охватывают около 10 независимых фагочых изоляторов.Условия хранения: в лиофилицированном состоянии; в пробирках с 0,7 МПА после посева уколом под слоем вазелинового масла; срок хранения - 2 года; на поверхности скошенного 1,5%-ного МПА в холодильнике при 4 С; пересевы через 1,5 мес.Посевной материал штаммов-продуцентов для поступающей ферментации может быть приготовлен любым известным способом, таким как выращивание на поверхности питательных сред или в жидких питательных средах, содержащих усвояемые источники углерода, азота, неорганические соли и органические вещества, обеспечивающие рост штаммов.К органическим веществам относятся витамины (биотин, тиамин), а также другиесоединения, в том числе аминокислоты, если они необходимы для роста штаммов-продуцентов. Так, в состав посевных сред длявыращивания штаммов ВКПМ ВиВКПМ Внеобходимо вносить О или 5ОА-аланин в концентрации не менее 80мг/л,В качестве питательной ферментационной среды для культивирования штаммовВ.Лачцв ВКПМ Ви ВКПМ Вмогут быть применены питательные среды, со-.держащие усвояемые источники .углерода,ацетона, минеральные соли и органическиевещества, стимулирующие рост и накопление 1:аланина. В качестве усвояемых источников углерода могут быть использованытакие углероды, как сахароза, глюкоза,фруктоза, мальтоза, маниоза, крахмал, гидролизат крахмала и меласса; многоатомныеспирты, такие как глицерин и сорбит; органические кислоты, такие как уксусная, молочная, фумаровая, малеиновая; спирты,такие как метанол и этанол, Указанные источники углерода могут быть использованыкак в отдельности, так и в сочетании друг с 25другом в различных массовых соотношениях. Общее количество источника углерода. может быть введено в начале ферментациилибо порциями в процессе ферментации.В качестве усвояемого источника азота 30могут быть использованы как органические,.так и неОрганические соли аммония, например сульфат аммония, хлорид аммония, карбонат аммония, ацетат аммония, нитратаммония, фосфат аммония, лактат аммония 35и аммиак; мочевина; различные природныеазотсодержащие соединения, напримерпептон, гидролизат дрожжей, мясной экстракт и гидролизаты растительных белков.В качестве .минеральных солей могут 40быть использованы фосфорнокислый калий,фосфорнокислый натрий, сернокислый магний, хлористый натрий, соли железа, марганца, цинка, карбонат кальция.Накопление-аланина имеет место при 45культивировании в аэробных условиях в диапазоне температур 20-37 С и значений рН6,5-9;О.Появление Е-аланина наблюдается через 6 - 10 ч после начала ферментации. Мак- .50симальный уровень накопления -аланина вкультуральной жидкости достигается в результате полного потребления источнйка углерода через 32 ч и более (в зависимости отиспользования концентрации источника углерода). Степень конверсии источника углерода в целевой продукт колеблется от:0,.17до 0,29,Весь аланин в культуральной жидкости находится в :форме.Содержание :аланина определяют методом бумажной хроматографии и окрашивание нингидрином или с помощью аминокислотного анализатора.Накопленный :аланин может быть выделен из культуральной жидкости любымизвестным способом, таким как удаление клеток микроорганизмов и других нерастворимых частиц центрифугированием или фильтрацией, адсорбцией -аланина на ионообменнике смолы с последующим элюированием, концентрированием и кристаллизацией,П р и м е р 1. Посевной материал выращивают на посевной среде следующего состава, г/л воды: сахароза 30; сульфатаммония ЗО; калий фосфорнокислый одно- замещенный 3; сульфат магния х 7 НгО 1;сульфат железа х 7 НгО 0,01; сульфат марганца х 5 НгО 0,01; биотин 0,0001; тиаминабромид 0,0001; 0-аланин 0,25; мел 30; рН7,2.Инокулят с концентрацией микроорганизмов 10 клеток /мл, полученный с одно- суточного посева с МПА, вносят в посевную среду в количестве 5. Культивированиеосуществляют в колбах на качалках при 30 С. Продолжительность процесса выращивания посевного материала 16-18 ч, при этом концентрация микроорганизмов достигает 2 - 5 х 10 клеток /мл.9В колбы объемом 250 мл асептически разливают по 10 мл простерилизованной ферментационной среды следующего состава; г/л воды: сахароза 150; (МН 4 р 504 55; КНгР 04 3; Мд 504 х 7 НгО 1; О-аланин 0.1: Ре 304 х 7 НгО 0,01; МпЯ 04 х 5 НгО 0,01; био"тин 0,0002; тиамина бромид 0,00005; СаСоз 50; рН 7,5. Каждую колбу инокулируют одним из следующих штаммов: ВЛачба ВКПМ В - 3991, ВКПМ Ви известный штамм ВКПМ В - 3061, нуждающийся в 0- аланине, но не обладающий устойчивостью к О, 1: а- -аминомасляной кислоте, Выращивание осуществляют на качалке при 30 С в течение 96 ч. Содержание :аланина в культу- ральной жидкости штаммов приведено ниЖе:П р и м е р 2, Процесс проводят аналогично примеру 1 с той разницей, что концентрация сахарозы в ферментационной среде 120 г/л, а продолжительность ферментации 72 ч.Содержание 1:аланина в культуральной жидкости штаммов-продуцентов приведено ниже,Формула изобретенияСпособ получения :аланина, предусматривающий выращивание продуцирующего его штамма ВгеЖЬастег 1 цв Лаана,Б нуждающегося в О-аланине, в условияхазрирования в питательной среде, содержащей сахарозу, аммоний сернокислый, калийфосфорнокислый, минеральные соли, О алачнин,биотин, тиамин, мел и воду, до макси 10 мального накопления целевого продукта споследующим его выделением и очисткой,о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения выхода 1:аленина, в качествепродуцента используют штаммы15 ВгеЬастег 1 ов Иацв ВКПМ 8-3991или ВгечЬастег 1 цв Начав ВКПМ В 3892, дополнительно устойчивые к О,1:а-аминомасляной кислоте,. Составитель Л.А.МинееваРедактор О.Спесивых Техред М,Моргентал Корректор Н .Король Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул. Гагарина, 101 Заказ 741 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5