Вектор рва 48, предназначенный для клонирования фрагментов днк в бациллах

(46 (71 В 4 учно- генет следова ии сел й инст тельсции7 .2/04 о 1, Ьег. ЕДНАЗНАЧЕННЫЙГМЕНТОВ ДНК В сится к биотехической промышчивосдетерминанта усто гцину и область р ет на стабильное миды РВА 910, С 1 а гмент размером 1, яс 1 - фрагмент ра отвечающие за ре расположена ти к эритрою торая отвеча дование плаз С 1 а 1 - фра оасл Сл)вел15 т.п.н.змером и С 1 а 11,25 т,пцию,ик ДНК ой щих нек 4 мк го Мяс 1 , мМ ти ече 1 . Плаэ мид ную ают рестриктаобеспечиваю ДНК, для чего ера, содержащ рН 7,9, 10 мМ тозтанола 150 1 ед, активно инкубируют в Пр имеррВА 910 обрабатывТао 1 в условияхполный гидролизДНК в 50 мкл буф10 мМ трис-НС 1,10 мМ 2-3-меркапЯаС 1, добавляютфермента Тао 1,ГОСУДАРСТ 8 ЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГННТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗО ВТОРСНОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(54) ВЕКТОР рВА 48, П ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ФРА БАЦИЛЛАХ(57) Изобретение отн нологии и микробиоло Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано. для. создания промышленных продуцентов ферментов, аминокислот, витаминов, применяемых в медицине, сельском хозяйстве, пищевой и легкой промьппленности.Целью изобретения является повышение стабильности наследования фрагментов ДНК в условиях отсутствия селективного давления.Сконструированы на основе криптической плазмиды В. ашу 1 о 11 ЧцЫ, рВА 910 векторные плазмиды, содержащие следующие области: РяТ 1 - С 1 а 1 . фрагмент размером 2,0 т,п,н., где ленности и может быть использовано для создания промышленных продуцентов, Цель изобретения состоит в повышении стабильности наследования фрагментов ДНК в условиях отсутствия селективного давления. Получен вектор, способный реплицироваться в бациллах, в частности в В. яцЬс 11 я и в промышленных штаммах В.ашу 1 о 1 доиеГасдепя. Вектор сконструирован на основе криптической плаэмиды В, агпу 1 о 1 щцеХасхепя. Вектор стаГбильно наследуется беэ селективного давления, сохраняется у 1003 клеток в течение 40 генераций, при включении в вектор фрагмента ДНК .размером 5,8 т.п.н. сохраняется у 1003 клето в течение 20 генераций.ние 20 мин при 65 ОС, реакцию останавливают добавлением 125 мкл 963-ногоэтанола, После растворения осадка вбидистиллированной воде получают набор Тап 1 - фрагментов ДНК рВА 910 с5различной степенью гидролиза, 5 мкгплазмиды рЕ 194 сорб обрабатываютрстриктазой Тао 1 до полного гидролиза, Реакцию проводят, как описа- Оно выше, но к 5 мкг ДНК добавляютед. активности Тац 1 и инкубируютс есь 60 мин при 65 С. Реакцию ост навливают добавлением 125 мкл 967 н го этанола. После растворения ДНКТс Т-фрагменты ДНК рВА 910 и рЕ 194с)рб смешивают в соотношении 1:1( мкг рВА 910 и 3 мкг рЕ 194 сорб)и легируют в течение ночи в 50 мклбрферар содержащего 6 мМ трис-НС 1,р 1 7,6, 6 мМ МяС 1, б мМ 2-з-меркаптэтанола, 50 мМ ИаС 1. 0.5 мМ АТФ,20 ед, активности ДНК-лигазы Фага Т 4.Полученной смесью трансформируют клетк В. яцЬс 111 я ЯВ 112, высевают ихн Ь-агар о эритромицином 10 мнг/мн),Из выросших клонов выделяют плазмиднь 1 е ДНК и анализируют их с помощьюрйстрикционного картирования. Крометого, определяют стабильность насле,дОвания полученных плазмидр выявляютстабильно наследуемую плазмидурРА 6013 р состоящую из несколькихТйц 1"фрагментов, обладающую устойч востью к эритромицину плазмидырЬ,194 сорб и имеющую область репли 35кации плазмиды рЕ 194. С помощью ресарикционного анализа выявляют Мяр 1 ЕсоК 1 - фрагмент плазмиды рВА 6013,где расположены детерминанта устойчивости к эритромицину и область рагротвечающая за стабильное наследование плазмиды рВА 6013,Для удобства манипулирования этимфрагментом и для дальнейшего использования его в качестве метчика криптических плазмид проводят ряд генноииженерных манипуляций, 4 мкг ДНКрВА 6013 в 50 мкл буфера, содержащего10 мМ трис-НС 1, рН 7,4, 6 мМ ИяС 1 рр6 мИ 2меркаптоэтанолар б мМ КС 1и 8 ед, активности фермента. Мяр 1 риикубируют 60 мин при 37 С в 50 мкл.оРеакцию останавливают добавлением125 мкл 967.-ного этанола, После расзворения плазмидную ДНК обрабатывают 55рестриктазой ЕсоК 1 в 50 мкл буфера,содержащего 100 мМ трис-НС 1, рН 7,10 мМ МдС 1, 6 мИ 2меркаптоэтаиола, 50 мМ ИаС 1 э 10 ед. активностиЕсоК 1, Реакцию останавливают, какописано выше.Аналогично рестриктазами ЕсоК 1и Асс 1 гидролизуют 5 мкг ДНК рБС 19.Затем гидролизованные плазмидные ДНКсмешивают в соотношении 1:1 и ферментативно сшивают ДНК-лигазой ФагаТ 4, Полученной смесью трансформируют клетки Е.со 11 ТС, высевают ихна Ь-агар с ампициллином (100 мкг/мп)о1выращивают при 3 С 16 ч и среди ампициллин-устойчивых клонов выявляюттакие, которые содержит плазмиду сискомым Мяр 1-ЕсоК 1-фрагментом. Такую плазмиду называют рУС 19-1.Затем проводят рестрикцию рБС 19-11и рВК 322 рестриктазами Нпд 1 П иРяс 1, смешивают в соотношении 1:1,сшивают ДНК-лигазой фага Т 4, легированной смесью трансформируют клетки Е.со 11 ТС, отбирают клоны, содержащие плазмиду с участком Ряс 1Н 1 пй 111 из рВК 322, Такую плазмидуназывают рБС 19-1 О. 5 мкг ДНК рВА 910и 5 мкг рБС 19-10 обрабатывают рестриктазой,ЕсоК 1, сшивают с ДНКлигазой Фага Т 4, полученной смесьютрансформируют клетки В.яцЬ 11 яЯВ 112 и отбирают клоны, вырастающиена Ь-агар е с эритр омицином (10 мкг/мп) .Та кие клоны содержат пла змиду р ВА 14,которая стабильно наследуется безселективного давления и придает клеткам устойчивость к эритромицину.1 мкг ДНК рУС 19 и 2 мкг ДНК рВА 14инкубируют с рестриктазой РяС 1 вусловиях, описанных выше, проводятферментативное легирование полученных после рестрикции фрагментов, Рестрикцированную плазмидную ДНК смешивают в соотношении 1;10 (рБС 19рВА 14) и сшивают в стандартныхусловиях, Полученной смесью трансформируют клетки Е.со 1 р отбираютна Ь-агаре с ампициллином (100 мкг/мл)клоны, содержащие бирепликонную плазмиду рВА 14-9. Расщепление рВА 14-9рестриктазой Е.соК 1, последующеелегирование и трансформация В, яиЬТ 111 я 83112 позволяют выявить плазмиду рВА 4,5 мкг ДНК рВА 4 обрабатывают рестриктазой ЕсоКв следующих ус"ловиях: 100 мМ тряс-НС 1, рН 7,5,10 мМ ИяС 1 р, 6 мМ 2-8-меркаптаэтанола, 50 мМ ИаС 1 р 0,5 ед, активности ЕсоК 1. Объем инкубационной5 16 смеси 40 мкл, Инкубацию проводят при 3 С в течение 20 мин, Реакцию останавливают добавлением 100 мкл 96%- ного этанола. Затем ДНК перерастворяют в 20 мкл буфера ТЕ (10 мМ трис-НС 1, рН 8,0, 0,1 мМ ЭДТА), вносят смесь дезокситрифосфатов до конечной концентрации 0,25 мМ каждого. Объем доводят до 30 мкл буфером ТЕ и вносят 2 ед, активности кленовского фрагмента ДНК-полимеразы Е.со 1 д, Реакцию достройки липких концов проводят при комнатной температуре 30 мин и останавливают добавлением 75 мкл 96%-ного этанола, Осадок ДНК растворяют в 20 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС 1, рН 7,5, О мМ М 8 С 1 , 50 мМ МаС 1, 0,5 мМ АТФ, и цобавляют 20 ед. активности ДНК-лигазы фага Т 4. Легирование проводят при 15 ОС в течение 4 ч. Полученную смесь путем трансформации вводят в В,яцЪй д 11 я ЯВ 112 и отбирают трансформированные бактерии после высева на агаризованную 1,-среду, содержащую 10 мкг/мл эритромицина. Анализ ппазмид, выделенных из эритромицин-устойчивых клонов, позволяет выявить плаз. миды с одним участком узнавания рестриктазы ЕсорП р и м е р 2, Клонирование в плазмиде рВА 48 фрагмента хромосомы с геном РЬе А Вашу 1 о 111 и 1 Гас 1 епя,5 мкг ДНК рВА 48 инкубируют при 3 оС в течение 60 мин в буфере следующего состава: 1 О мМ трис-НС 1, рН 7,6, 10 мМ МяС 1, 2 - 3-меркаптоэтанол (6 мМ), 150 мМ НаС 1, 10 ед. активности Ря 1, Реакцию останавли- .овают нагреванием при 65 С в течение 25 мин, 5 мкг ДНК плазмиды рРНЕА 32 инкубируют при 37 С в течение 20 мин в смеси, содержащей 10 мМ трис-НС 1, рН ,6, 10 мМ МяС 1, 6 мМ 2-Р-меркаптоэтанола, 150 мМ ХаС 1 и 1 ед, активности Ря 1, Объем реакционнои смеси 50 мкл. Реакцию останавливают прогреванием, как описано выше, Получают частично гидролизованную ДНК рРНЕА 32. Гидролизованные ДНК рВА 48 и рРНЕА 32 смешивают в соотношении 3:1 (30 мкл рВА 48 и 10 мкл рРНЕА 32), добавляют АТФ цо конечной концентрации 0,5 мМ и 25 ед, активности ДНК- лигазы фага Т 4. Легирование проводят при комнатной температуре в течение 2 ч, Полученной смесью трансформируют В, яиЬ.1 дя В 112, после чего 15180 6высевают трансформированные клетки наагаризованную срецу Спицайзена, содержащую 0,4% глюкозы, 50 мкг/мп триптофана, 10 мкг/мл эритромицинафе 5нилаланина селективная среда не содержит. После инкубации в течение24-36 ч вырастают колонии, При анализеплазмидной ДНК, выделенной из обра=зовавшихся колоний, выявлена плазмидарВА 48-9, которая несет ген рйеА В,ашу 1 о 1 с 1 цеГасдепя и обеспечивает ростВ, яоЪС 11 дя ЯВ 112 на минимальнойсреде без фенилалгнина,рВА 48-9 стабильно наследуетсяв клетках В. яцЬ 11 з ЯВ 112, 5 мкгДНК рВА 48 инкубируют при 37 С в течение 60 мин в 50 мкл буфера, содержащего 10 мМ трис-НС 1, рН 7,9, 10 мМ20 МяС 1, 6 мМ 2меркаптоэтанола,150 мМ БаС 1 и 10 ед. активностиВаш Н 1. Реакцию останавливают добавлением 125 мкл 96%-ного этанола. ДНКперерастворяют в буфере, содержащей25 100 мМ трис-НС 1, рН 7,5, 10 мМ ИяС 1,6 мМ 2меркаптоэтанола, 50 мМ БаС 1,добавляют 10 ед . активности ЕсоК 1и инкубируют в течение 60 мин при37 ОС. Реакцию останавливают как опи 30 санс выше,Аналогичным образом рестриктазамиВаш Н 1 и Есор 1 обрабатывают ДНКрВК 322, Гидролизованные, как описано выше,ДНК рВА 48 и рВЕ 322 смешивают в соотношении 1:2 и легируютв стандартных условиях ДНК-лигазойфага Т 4 в течение 2 ч. Полученнойсмесью трансформируют Б, яцЬе 111 зЯВ 112, клетки после трансформациивысевают на агаризованную 1-среду сэритромицином (10 мкг/мл). Из выросших клонов выделяют плазмиды и спомощью рестрикционного анализа выявляют плазмиду рВА 91, где единичныеучастки рестриктаз расположены вследующем порядке: Есор 1, Нпд 111,Есор Ч, ВашН 1, ХЬа 1, Яас 1, Ряг, 1.ДНК рВА 91 вводят в протопласты В.ашу 1 о 111 иейас 1 епя.50П р и и е р 3, Проверка стабильности плазмиды рВА 48.Проверку стабильности наследования плазмид проводят следующим образом. Штаммы В.зцЬс 111 з ЯВ 112, содержащие проверяемую плазмиду, рассевают на агаризованной 1,-среде с эритромицином до отдельных колоний и выращивают отдельную колонию в жид1615180 Составитель Т.ЗабойкинаРедактор Ы,Гунько Техред Л.Сердюкова Корректор А.Обручар Заказ 3961 Тираж 494 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,01 кой Б-среде без эритромицина в тече. -ние 24 ч с интенсивной аэрацией. Затем в бактериальной культуре опреде -ляют титр бактерий на среде с эритромицином и без него, Титры сравниваюти делают вывод о стабильности той,или иной плазмиды,П р и м е р 4, Стабильное поддержание плазмиды рВА 48 при клонировании в В.ащу 1 о 11 сце 1 ас 1 епя.Плазмиду рВА 48 вводят в протопласты промышленного штамма В, ашу 1 о 11 спеГасдепз Аизвестными методами,После регенерации протопласты высе,вают на агаризованную среду, содержащую 10 мкг/мл эритромицина, Стабильность плазмиды оценивают какописано выше. Плазмида стабильно на -следуется без селективного давленияи сохраняется у 100 клеток на протяжении 40 генераций,Плазмиду рВА 48-9 (пример 3) содержащую ген фенилаланина, вводятв промышленный штамм и анализируютстабильность наслецования без селективного давления. На протяжении 20генераций плазмида стабильно насле -дуется без селективного давления исохраняется у 100 , клеток.Таким образом, плазмида рВА 48 стабильно наследуется без селективного давления в клетках бацилл у 100 кле ток на протяжении 40 генераций, привстраивании в эту плазмиду фрагментаДНК размером в 5,8 т,пн. стабильность наследования сохраняется в отсутствии селективного давления у100 клеток на протяжении 20 генераций. О Формула изобретения Вектор рВА 48, предназначенный дляклонирования фрагментов ДНК в бациллах размером 4,4 т,п.н., содержащий - Рзг. 1 - С 1 а 1 - фрагментДНК размером 2,0 т,п.н. с геном устойчивости к эритромицину из рС 194и областью раг, отвечающий за стабильное наследование из криптической плазмиды рВА 910, С 1 а 1 - С 1 а 1фрагмент ДНК плазмиды рВА 910 размером 1,15 т.п.н., С 1 а 1 - ЕсоК 1фрагмент ДНК плазмиды рВА 910 разме" 25 ром 1,2 т.п,н ЕсоК 1 - Рай 1фрагмент ДНК плазмиды рПС 19 размером 0,05 т.п,н генетические маркеры: Еш " - ген устойчивости к эритромицину; уникальные сайты рестрик ции; ЕсоК 1, Бас 1, Крп 1, Вша 1Ваш Н 1, ХЬа 1 Ряс 1, емкость - неменее 5,8 т.п,н,