Способ иммобилизации алкогольоксидазы

КС 1, 1 мМ ЭДТА и 50 ммоль азида нат.рия, В раствор добавляют 0,02 мл 57 ного глутарового альдегида, смесьтЩательно перемешивают и выпивают намЭкропористую лавсановую мембрану(ядерный фильтр) проницаемостью 10,7,дйаметром пор 0,54 мкм, площадью9 см, Для получения ферментной мембраны, применяемой в анализаторах для 10о 1 ределения этилового спирта, на пов 1 рхность приготовленной двухслойноймембраны надевают ацетатцеллюпознуюмембрану толщиной 10 мкм, Полученнуютрехслойную мембрану помещают в холфцильник в течение суток, затем разрезают на куски, надевают на электрод и, тщательно отмыв струей буфера,определяют ток ферментного электроцап 1 и рН 8,0 при 0,6 В отн. Ад/АдС 1 20электрода сравнения.Аналогично проводят иммобилизациюакогольоксицазы с использованием азида натрия в концентрациях 100 и590 ммоль или в отсутствии азида натрйя по известному способу, Готовятаналогичные примеру 1 ферментные электроды.В табл. 1 приведены сравнительныепараметры полученных электродов, Изме рния проводят в 0;01 М фосфатном,буфре (0,1 М ЕС 1, 1 мМ ЭДТА), рН 8,0,Из приведенных в табл, 1 данныхвдно, что при тех же концентрацияхэанола ток или чувствительность элек т 1 одов, содержащих иммобилизованныемембраны, изготовленные согласно предл;гаемому способу (2-4), значительновЦше, чем содержащих мембрану, приго-,тсвленную согласно известному спосс 1 бу.Мембраны, изготовленные согласноизвестному способу, обладают низкойчтвствительностью и непригодны дляиспользования в анализаторах этанола., 45прскольку при определении в реальныхмНогокомпонентных средах соотношениефонового и полезного сигналов превышает 57. из-за наличия в них посторонних веществ,50П р и м е р 2Для выяснения интервалов используемых концентрацийазица натрия аналогично примеру 1 проводят иммобилизацию алкогольоксидазыбез нанесения ферментного растворана ядерный фильтр с использованием55азида натрия в гелевой структуре вразличных концентрациях, В этих иммобилизованных препаратах при-0,6 В отн. Ац/АвС 1 электрода сравнения определяют алкогольоксидазную активность в Е/г. Вычисляют остаточную ферментативную активность (7) по сравнению с неиммобилизованным препаратом, Измерения проводят в 0,01 М Фосфатном буфере, рН 8,0 (1,0 М КС 1, 1 мМ ЭДТА) в присутствии 10 мМ этилового спирта.Полученные данные приведены в табл,2,Данные, приведенные в табл,2, показывают, что при концентрациях азида натрия 0,25-500 ммоль активность иммобилизованной алкогольоксидазы увеличивается в 1,5-40 раз по сравнению с ферментным препаратом, приготовленным без азида натрия, При концентрации азида натрия более 500 ммоль активность уже не увеличивается. Кроме того, увеличивать концентрацию нецелесообразно, так как гель при больших концентрациях азида натрия становится менее жестким, а следовательно, ухудшаются механические свойства получаемых ферментных мембран, При эксплуатации менее жесткой Ферментной мембраны фермент начинает вымываться из геля, Таким образом, оптимальные концентрации азида натрия при изготовлении ферментной алкогольоксидазной мембраны 0,25-500 ммоль.Активность иммобилизованной алкогольоксидазы зависит от рН буферного раствора, в котором проводятся измерения. При наличии в буферном растворе, 10 мМ этилового спирта и используя ферментную мембрану, приготовленную по примеру 1 с азидом натрия в гелевой структуре 100 ммоль, при рН 6,0 ток электрода равен 12 нА, при рН 7,0 - 22 нА, при рН 7,5 - 27 нА, при рН 8,0 - 32,5 нА, при рН 8,5 35 нА, при рН 9,0 - 32,5 нА, при 10 - 20 нА, Таким образом, наилучшие результаты реализации способа получе- ны в буферных растворах рН 8,0-9,0.П р и м е р 3; Для определения стабильности иммобилизованной алкогольоксидазы изготавливают ферментную мембрану с использованием азида .натрия концентрации 500 ммоль и по известному способу по примеру 1 и определяют зависимость тока электрода от продолжительности эксплуатации.Полученные результаты приведены в табл,3 (концентрация этиловогоТа блица 1 Количество явила натрия,мэоль электрола, мкА/смэ, при концентрации этилового спирта, Ю т -"2- 15 20 ЭО 40 50 70 Плотность тока"1 Х Известнья 1 способ 0,047 0,070 0,107 0,017 0,0 ЗЗ 0,1 ЗЗ 0,17 З 0,21 З Прецлагаемый способ 0,066 0166 0,699 0,669 0,866 1698 . 1,998 6,726 6,625 50 100 500 0,1 ЗЗ 0,336 1,395 О 197 0,2700,510 0,666 1,998 2,664 0406 0,982 4,029 0,540 1339 5,395 Т а б л н ц а 2 Концентрацияланца лат-Т Г Активность иммобнлнэо ванной алко- гольоксицазм, Е/г Оэ 05 0057 0063 0070 030 072 120 200 093 М 0,027 О,ОЗ 9 Остаточиал активность бэермен- та, Х 09 1Э 17 2,1 З,5 10 24 36 ЭЗ З 1 19 Таблица 3 Способ Зависимость тока электрола, нА, от процолннтельности эксплуатацэцэе сут12 1416 О 1 З 1э 11 11 О 122 21 12 1 21 11 йрецлагааэв 42 41 41 . 42 42 39 37 35 . 32,5 30 29 27 25 23 22 20 о о о о о О 0 О О 10 09 017 05 02 О 1 0 О р в м е ч а в н е. Кояцентрацнл азмца натрия 500 ммоль. 51 б 51спирта в ячейке 0,5 мМз другие условия аналогичны примерам 1, 2).Электроды, содержащие мембраны,работают в среднем по 8 ч сут прикомнатных условиях. Остальное времясуток ферментные мембраны хранятсяв буферном растворе при комнатныхусловиях,10Иэ табл.З видно, что чувствительность электрода, приготовленного на основе иммобилиэованной алкогольоксидаэы по предлагаемому способу, в течение 1 мес эксплуатации уменьшается на 50 Ез тогда как мембрана, приготовленная по иэвестному способу,79 6полностью теряет активность в течение 10 дней.Формула изобретенияСпособ иммобилиэации алкогольоксидаэы, включающий введение алкогольоксидаэы из Сапс 1 Ыа ЬоЫзпдз в гелевую структуру, содержащую сывороточный альбумин и глутаровый альдегидв буферном растворе, и последующеенанесение на ядерный фильтр, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения активности и стабильности,в гелевую структуру дополнительновводят аэид натрия в концентрации0,25-500 ммоль, а иммобилиэацию проводят при рИ 8,0-9,0,1615179 3 10 0 огСоставитель А.Семеноведактор Н.Гунько Техред Л.Сердюкова Корректор А. 0 бРУщчЗаказ 3961 Тираж 490 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГК113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 СССР. роизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина,101