Способ получения убихинона-9

Все а еО П Союз Советских Социалистическю Республик(51) М. Кл. С 12 Э 13 аявлено 11.10 1705684/28-1 единением зая Гасударственных кюмвтет Сюеата Иевютрюв ССС пю делам веююретеей н вткрмткй(53) УЛК 577 15 .08(088.8) 45) Лата опубликования описания 27.1 Н. В, Тарасова, Е. А. Обольникова, А. Д. Гололобов, Г. И. Самохвалов, С. В. Чепиго, Г. И. Иванова и В. М. Куликова Авторызобретеи биосинте сесоюзный научно-исследовательскбелковых веществ,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИ 1 ХИНОН при интенсивном перем ивании и аэрироБиомассу из культурал ыделяют сепарированием помощью жирорастворит н, петролейный эфир, эк ин) остаточные углеводо ругие вещества. Твердую ют фильтрацией и высуш мом, получая белково-витй жи и удаляют нз нее елей (гексан, ацестракционный бенроды, липиды и фракции отделяивают под вакууаминный концентто Изобретение относится к микробиологи= ческой промышленности.Известен способ получения убихинонапутем культивирования его продуцентов, отделения выращенной биомассы и омыления. ее с последующим вьщеленнем убихинонаиэ неомыленной фракции.Целью изобретения является одновременное получение наряду с убнхинономбиошрота. 10Достигается это тем, что перед омылентеем биомассу высушивают, затем экстрагируют с получением нри этом бношрота и биолипидов, биошрот удаляют, а полученнные биолипиды омыляют, 15Кроме того, в качестве продуцентов убихиионаиспользуют вид Сатйьда дц Ялртою 3 т,иэ которого берут щтаммы НП, Н.Предложенный способ осуществляют следующим образом. 20Вначале культивируют продуценты убихинона. В качестве продуцентов используюткультуру вида Свпййа о 1 ИиглоткЪв виде штаммов НПи Н. Выращивание ведут непрерывным или периодическим способом ванин среды воздухом.В качестве источника углерода используют фракции парафиновых углеводородов, содержащие Н-алканы с 10-24 атомами углерода, а также нефтяные дистилляты, содержащие 10-40% комплексообраэующих углеводородов.Водную минеральную среду используют следующего состава: сульфат аммония, фосфорная кислота, хлористый калий, сернокислый магний и смесь микроэлементов.Выращивание культуры вида Саттйда умегтпопдт 1 проводят при интенсивном перемешивании и аэрировамии среды воздухом при рН 4-4,5 и температуре 28-36 С.401180зрат-биэшрот, который удаляют. Затем фильтрат, содержащий растворитель и экстрагируемые им вещества, выпаривают под вакуумом,при этомсухой остаток состоит из смесилипидэв, стерэлов, жирорастворимых витаминов и остаточных углеводородов. При этомубихинэц, обладая липидными свойствами,также нахэдится в этой смеси, которая вдальнейшем называется биожиром. Выходбиожира составляет 5-30% от веса сухой1 Обцолассы.Убихинэн сэдержится в биожире в количестве 0,05-0,2%,Выделение убихицона из биожира проводят в несколько стадий. Вначале биожирэмыляют метанольным раствором едкого кали в присутствии пирэгаллола при постояноцэм перемешивации при 90-100 С. Затемотделяют фракцию неомыленных липидов путем экстракции растворителем, причем вкачестве пэследнего используют серный илицэтрэлейцый эфиры цли гексан, Далее удаляют раствэритель, экстракт сушат и из него,содержащего цеэлылеццые липиды, углеводэрэды ц другие вещества, выделяют убихицэн путем хрэматэграфии на окиси алюминия.Убихцнон выделяют кристаллизацией из абсэлютцэгэ этацэла; выход егэ составляет60-70% эт веса концентрата.П р и л е р 1. Культуру вида с 1 пМОдвчИ 1 егтиопй 1 НПвыращивают ца средеслэдующегэ сэстава (г/л):(С 1 о - Сг 4)10Азот (в виде сернэкцслэго аммонияили аммиачной воды) 0,7при рН 4,0 - 4,2 и температуре 32-36 С.Прэцесс ведут непрерывно в опытно-промышленных ферментерах емкостью 750 мс аэраццей и перемешиванием при степениразбавления 0,15 час,Пэлученцую биомассу выделяют сепарациейУвысушивают в распылительной сушилке и экстрагируют бензинэм,Выхэд биэжира 5% эт веса сухой био массы,Далее провэдят омыление, для чего помешают 10 мл биэжира в колбу, снабженную мешалкэй и сэедцнеццую с холодильником, и приливают в негэ 20 мл 10%-ного 60 4метанольного раствора едкого кали, содержашего 0,2 г пирогалЪола.Процесс омыления ведут в течение 30 минпри 90-100 С. Неомыленную липидную фракцию извлекают, проводя трехкратную экстракцию по 50 мл серным эфиром. Эфирные экстракты сливают вместе, промывают водойдо нейтральной реакции и отгоняют растворитель. Затем остаток из колбы переносят наколонку с окисью алюминия 11 степени поБрокману (размеры колонки, см: высота 15,диаметр 2, высота слоя окиси алюминия 10).Элюацию убихицона проводят смесью петролейного и серного эфиров (9:1), общийобъем 300 мл. Содержащую убихинон фракцию отделяют в виде желто-оранжевой полосы. Элюат упаривают на роторцэл испарителе при 45-50 С и остаток взвешивают.Вес остатка 25 мг, содержание в нем,уби.хинона, определенное пэ модифицированномуметоду Кревена, 22 мг или 2,2 мг на 1 млбиожира.Затем для получения кристаллическогопрепарата остаток растворяют в 0,5 мл абРсэлютцогэ этацэла и оставляют на сутки длякристаллизации при 0 С, причем после однойперекристаллизации выделяют 13 мг убихинона,Препарат имеет следующую фцзцкэ-.химическую хц;,дктепцстцку; т:;мпература плавлении 43,6- 14,4 С; эти цэл ( экцслеццый)272 ьм;. ) 80; этацэл (вэсстацэв "(оленный) 2;М цм;50,5; массеэкт 1 " 794; (Я+2) 796; (М) 779;,л;.ц с г(е 235 и 197% ца тэнкэслэйш,Гхс,л; ка левых пластинах в системе адетэцвода (95:5) 0,31; пэлэжение пятен соответствует кристаллическому препарату убцхицэца, испэльзуемэгэ как метчик,На осцэвании полученной физико-химической характеристики препарата установлено,что культура Сапйс 3 а риЕС 16 гпопф 11 П при росте на среде с очищенными жидкими парафинами синтезирует убихинэн - 9.П р и м е р 2. Культуру вида Саъй 1 дцсиИ 1 ептэткБт Нвырашивают на средеследующего состава (г/л):( ИН ) 50 087Нз РО (70%-ная) 1,75КС 1 1,14Мо 50,1, 7 Н О 0,55Р е бО+ 7 Н О 0,045Мг 504 Н 20 0,03 1Хн 5 О 7 Н О , 0,033Си 60 5 Н О 0,004В качестве источника углерода в средудобавляют нефтяной дистиллят из нефти Мангышлакского месторождения в количестве15%, что соответствует 4% пэ сэдержациюкомплексообразуюших углевэдорэдэв.Выращивание культуры проводят периодическим способом в ферментере емкостью30 л при постоянном перемешивании и аэрации, После сепарации и сушки получают170 г биомассы, из которой путем экстракции бензином получают 28 мл биожира, Омыление проводят таким же образом и притех же условиях, как указано в примере 1.Затем экстракцию неомыпенной фракции проводят петролейным эфиром (фракция 40- 10-60 С), отгоняют растворитель и хроматоографически на окиси алюминия выделяют концентрат убихинона, который составляет32 мг; содержание убихинона в концентрате, определенное по методу Кревена, состав ляет 27,5 мг,Таким образом, содержание убихинона вбиожире, полученном из культур, выросшихна среде с фракцией нефтяного дистиллята,составляет 1,1 мг/мл биожира. 20Из 25 мг концентрата после кристаллизации из абсолютногоэтанола получают15 мг кристаллического препарата с температурой плавления 43,8-44,5 С.При хроматографическом анализе на селикагелевых пластинах в системе ацетонвода в соотношении 95:5 положение пятенвыделенного препарата соответствует метчику 0 и образцу убихинона, выделен 9ного из культур вида ОпййО Дц 1 И 1 егеон 611; 30НП.П р и м е р 3. Культуры вида Сляйдар 1 ВИе 1 ръопй 1 Нвыращивают на средетого же состава что и в примере 2, Способ выР35ращивания непрерывный, степень разбавлеония среды 0,2 час при 30-32 С. Выделение биожира проводят из сырых культур путем экстракции ацетоном с последующим переводом жирорастворимых компонентов в гексан. При этом из 170 г дрожжей при их влажности 817 о,получают 7,5 г биожира. Омыпение биожира, получение неомыленной фракции и вьщеление из нее убихинона проводят так же, как в примере 1.После хроматографической очистки получают 10 мг концентрата, содержащего 6,96 мг убихинона. После кристаллизации из абсолютного этанола выделяют 4,08 мг убихинона.формула изобретения1. Способ получения убихинонапутем культивирования его продуцентов, отделения выращенной биомассы, омыления ее с последующим выделением убихинонаиз неомыленной фракции, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью одновременного получения наряду с убихинономбиошрота, перед омылением биомассу высушивают, затем экстрагируют с получением при этом;биошрота и биолипидов, биошрот удаляют, а полученные биолипиды омьияют.2. Способ по п.1, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что в качестве продуцентов убихинонаиспользуют вид Сайда Цц 1 йбегзпоъ Вт.3. Способ по пп 1 и 2, о т л и ч а ющ и й с я тем, что из вида СаъйдауюИ 1 егтпопдй используют штаммы НП,Н, Составитель А, БражниковаРедактор Н. Спиридонова Техрец Н. Анпрейчук Корректор А, КравченкоЗаказ 3356/4 Тираж 541 Подписное ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская набд, 4/5 Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4