7-замещенные 9 -метоксимитозана, обладающие противоопухолевой активностью

(46) 07.04.87 (71) Бристоль (72) Долатрай Такуси Канеко Дойле (СА) (53) 547,759. (56) Патент С кл 260-268 Бюл. Фейерз Коханлал(57) Изобретениемитомизина С, в чобщей формулы 1 МЕТОКСИМИТОЗАНА,ОЛЕВОИ АКТИВ ается производныхности соединенийСА - С(0)-С 11 ф -С -С (О) -С СН ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ где А - ИН; ОСНз, КзК 4 И - С(К) =И В - К К Б-С(К ) =Й-; ЙН; К,-Й СН формил; К -Н; СН ; К и К - каждый в отдельности метил или изопропил или вместе с И - пиперидин или морфолин, которые как обладающие противоопухолевой активностью могут быть использованы в медицине. Для выявления лучшей активности у соединений указанного класса были получены новые 1. Синтез их ведут из митомицина С или митомицина А или их И-алкилпро-изводных с соответствующим амидоацеталем в безводной среде органического растворителя (хлороформ, дихлорметан, а также смесь хлороформа и ме- ао танола) при 50-65 С до получения соединения, где В или А+В представляют собой группу К,К 4 И-СК )=М-, с последующим хроматографическим выделением С целевого 1. Активность последнего по отношению времени выживания группы, обработанной препаратом,ко времени г, выживания контрольной группы составляет 141-3113 при дозе 25,6-6,4 мг/кг массы(для Р = 388 Мцгп лейкомии), 2 табл.0001831 ОСНОС-Вси О Ъ - В (1) де А - амино-,бщей формулыдК К И - С=Из д етокси- ил руппа В - амино- илобщей формулы амидиновая уппа К К И-С=И 4 етил;25 н 1 13Изобретение относится к новым производным митомицина С, а именно к 7- замещенным 9 а-метоксимитоэана общей формулы где К, - водород, формил или мКд - водород или метил;К и К - каждый в отдельности метилзили изопропил или вместе сатомом азота,к которому ониприсоединены, образуют пиперидин или морфолин,обладающим противоопухолевой активностью,Целью изобретения является поискв ряду производных митомицина С соединений, обладающих более высокойпротивоопухолевой активностью.П р и м е р 1. 7- (Диметилами о)иметилену амино-И (диметиламино)-метилена-метоксимитозан (соединение 1 ).7- (Диметиламино)метилен 1 аминоюИ -(диметиламино)-метилен-формил 9 а-метоксимитозан (соединение 11).К суспензии 500 мг (1,50 мМ) митомицина С в 25 мл хлороформа добавляют в целом 9,6 мл (2,4 мл порциямичерез О, 18, 21 и 23 ч) И, И-диметил -Формамид диметилацеталя и суспензиюперемешивают при 50 С в течение 41 ч,После выпаривания растворителя и избытка реагента при пониженном давлении получают темно-зеленый остаток;ТХС (хлористый метилен/метанол 20;1)показывает отсутствие митомицина Спри наличии двух новых зеленых компонентов (К К = О, 16 и 0,22), Основной компонент (К Г = О, 16) выделяютхроматографией мгновенного испарения,используя смесь хлористый метилен 20 30 35 40 45 50 55(метанол 20:1) в качестве элюента,в виде зеленого твердого вещества(340 мг 51,5%), который после растворения в диэтиловом эфире с последующим добавлением гексана дает соединение 1 в виде темно-зеленого аморфного порошка.ВычисленоНайдено,7: С 56,20; Н 6,28;И 17,88,Вычислено,7: С 56,71; Н 6,08;И 18,90,Второстепенный компонент (К Г0,22) выделяют (180 мг, 25,35%) вв виде аморфного твердого вещества,которое после осаждения из диэтилового эфира и гексана идентифицируюткак соединение 11Найдено,7.: С 55,41; Н 5,96;И 16,99.С Н И О,Вычислено,7.: С 55,89; Н 5,93;17 ь 78В растворах соединений 1 и 11 либо в этилацетате, либо в И,И-диметилформамид диметилацетале при стояниипри комнатной температуре более 10 чпроисходит превращение соединения 11= 0,16), что удостоверяется ТСХ, сполучением раствора с повышенным содержанием соединения 1.Примеры 2-7 выполняют аналогичнопримеру 1 с модификациями, указанными ниже, с получением различных до -полнительных соединений предлагаемо- .го изобретения.П р и м е р 2. 7- (Диизопропиламино)метиленамино - И (диизопропиламино)метилена-метоксимитозан (соединение 111 ),Суспензию митомицина С (200 мг,0,6 мМ) в И,И-диизопропилформамиддиэтилацетале (3 мл) нагревают приперемешивании в течение 15 ч при 53 С,Реакционную смесь выливают в 50 млводы и экстрагируют этилацетатом(3 " 30 мл). Объединенный органический экстракт сушат (Иа , БО ) и вы 2паривают с получением темно-зеленогосиропа, ТСХ (хлористый метилен/метанол 10:1) показывает наличие основного зеленого компонента с К Г = 0,43и примесей, движущихся быстрее (К Г=1301831 40 мощью двукратной хроматографии мгновенного испарения с использованием .смеси хлористый метилен/метанол 20:1в качестве элюента.Найдено,7.: С 62,03; Н 7,80;И 14,60.Вычислено,7: С 62,55; Н 7,91;И 15, 10.П р и м е р 3. 7-Е(Диметиламино) 10метилен амино-М в (диметиламино) -метилена-метокси-Б -метилмитозаню(соединение 1 Ч ),10В этом примере порфиромицин (Мметилмитомицин С), 130 мг (0,37 мМ) 15замещают в качестве исходного соединения в реакции с 0,8 мл (1,5 мМ)И,И-диметилформамид диметилацеталя,используя 10 мл хлороформа и 2 млметанола в качестве реакционного 20растворителя, время реакции 50 минпри 50 С. Соединение 1 Ч получают ввиде сиропа после выпаривания реакционного растворителя. Это соединениезатем очищают хроматографией мгновенного испарения, используя 20 г силикагеля и смесь хлористый метилен/метанол (20: 1) в качестве элюента,Найдено,7.: С 57, 11; Н 6, 11;Х 17,99.30Вычислено,7.: С 57,60; Н 6,55;Н 18,33.Эта методика дает соединение Ч7-амино- Н-диметиламино-метиленаМЕтОКСИ-И 1 О -МЕтИЛМИтОЗая, В КаЧЕСтВЕпобочного продукта с выходом 307,ТСХ : К й = 0,40 (хпористый метилен//метанол 9:1).Найдено,7.; С 54,68; Н 6, 13;Б 16,59вычислено,7.: С 56,53; Н 6,20;Н 17,38,45 П р и м е р 4, 9 а-Метокси-Е(1- пиперидиниламино) метилен аминоюИ -(1-пиперидинилметилен) митозан (соединение Ч 1 ).М-(диэтоксиметил) пиперидин50 (3 мл) и митомицин С (200 мг) взаимодействуют при 60 С в течение 2,5 ч в хлороформе (3 мл). Продукт получают с выходом 27,67., ТСХ : К Е = 0,20 (хлористый метилен/метанол 20;1).55Найдено,7: С 6 1,01; Н 6,85; В 15,34.С,Нй,О,. 4Вычислено, 7: С б 1, 79; Н 6,87;И 16,02.И"-формил производное предьдуще.го вещества, И " -формила-метокси 7-Е(1-пиперидиниламино)метилен 7 амино-И-(1-пиперидинилметилен) митозан получают в качестве основногокомпонента, выход 437, ТСХ : К й0,25 (хлористый метилен/метанол20:1).Найдено,7: С 59,99; Н 6, 17;И 15,07.С 8 Н ьБ ОВычислено,7.; 60,08; Н 6,52;И 15,21.П р и м е р 5. 9 а - Метокси-Е(1 -1 аморфолино) метилену амино-И (1-морфолино-метилен митозан (соединение Ч 11).Перемешиваемую суепензию митомицина С (200 мг, 0,6 мМ), в хлороформе (10 мл) и М-диэтокси метилморфолина (4 мл) нагревают при 53 С в течение 42 ч. Реакционную смесь концентрируют до консистенции сиропапод высоким вакуумом. С помощью"сырой" хроматографии мгновенногоиспарения (сгцйе Е 1 азЬ СЬговагоцгар 1 у ) (хлористый метилен/метанол 25:1)отделяют зеленые компоненты от избытка реагентов. Объединенные зеленыереагенты растворяют в 20 мл этилацетата и промывают водой (3 " 20 мл),Объединенные промывки реэкстрагируютэтилацетатом (3 15 мп). Все этилацетатные фракции объединяют, сушат/метанол 10:1) которого свидетельствует о наличии отдельного компонентас К й = 0,33 и несколькихзеленыхпримесей (К й 0,35-0,40). С помощьюхроматографии мгновенного испарениякомпонент с К й = 0,33 вьделяют(130 мг, 56,87) в виде темно-зеленого аморфного твердого вещества, которое характеризуется как соединение Ч 11 ).1Найдено,7: С 53,07; Н 6,03;М 15,37.Вычислено,7: С 56,78; Н 6,06;Б 15,90.юП р и м е р 6. 7-Амино-Б -диметиламинометилена-метоксимитозан(соединение Х),600 мг суспензии (1,79 ммоль)митомицина С в 2 мл метанола обрабатывают 3 мл Я,М-диметилацетамиддиметилацеталя. Затем суспензию нагревают до 75-80 С и перемешивают втечение 2 ч. На этой стадии ТСХ (хлористый метилен/метанол 10:1) показывает, что почти весь митомицин С израсходован в процессе реакции, Нахроматографе полученный продукт проявляется в виде зеленой полосы.Растворитель и летучие вещества удаляютконцентрированием реакционной смесидосуха при пониженном давлении с получением сиропа, который растворяютв хлористом метилене и наносят наколонку с 40 г силикагеля, после чего колонку элюируют 200 мл 17-ногометанола в хлористом метилене,200 мп2 Е-ного метанола в хлористом метилене и 400 мл 5 Е-ного метанола в хлористом метилене. Фракции, содержащиезеленую полосу, представляющую собойпродукт, объединяют и концентрируютдо аморфного твердого вещества, весящего 110 мг. Выход 137 Это вещество растворяют в 2 мл ацетона и осаждают из раствора добавлением гексана,Продукт собирают фильтрацией,Найдено,Е, С 58,89; Н 6,89;И 17,64.Вйчислено,Е: С 58,46; Н 6,83;И 17,79,Противоопухолевая активность поотношению к РМцгпе лейкемии,В табл. 1 приведены результатылабораторных исследований на СЭР,мышах-самках, которым внутрибрюшинноимплантировали опухолевый прививочный материал, содержащий 10 асцитныхклеток Ршигпе лейкемии, и которым вводили различные дозы тестируемого соединения формулы 1 или митомицина С. П р и м е р 7. 7,9 а-ДиметоксиИ -диметиламинометиленмитозан (соединение 1 Х ),Вместо митомицина С (пример 1)берут митомицин А (170 мг) и подвер -гают взаимодействию с И,И-диметилформамиддиметилацеталем (0,6 мл) в растворе хлороформ/метанол (10: 1) при50 С в течение 1 ч. Целевой продуктполучают с выходом 487, ТСХ : К Г,9 а-диметокси-И -диметиламинометиолен-М 1 а-формилмитозана с выходом16,57., ТСХ : К Е = 0,61 (хлористый55метилен/метанол 9:1) .П р и м е р 8. 7- 1-(Диметиламиюно)этилиден 3 амино-И - ь 1-(диметил 5 13018 танола, добавляют И,М-диметилформамид диметилацеталь (0,64 мп,4,8 мМ)о и раствор перемешивают при50 С в течение 50 минТонкослойная хроматография (хлористый метилен/метанол 90:10) показывает следы непрореагировавшего митомицина С (К Г = 0,22 ) и два новых компонента (К Г = 0,42 и 0,33 соответственно). Раствор концентрируют при пониженном давлении 10 до консистенции сиропа, этот сироп подвергают хроматографии мгновенного испарения (25 г силикагеля), используя хлористый метилен/метанол (20;1) в качестве элюента, 15Быстрый компонент (К 1 = 0,42) выделяют в виде зеленого аморфного твердого вещества (60 мг, 22,57) и идентифицируют как соединение 1 с помощью его ЯМР-спектра (пиридин й ). 20Основной синий компонент (К Й = 0,33) выделяют в виде аморфного твердого вещества (148 мг, 63,37) и характеризуют как соединение 7111, Аналитический образец получают осаж дением из хлористого метилена и н - пентана.Найдено,7; С 54,70; Н 6, 14; И 1,95.Вычислено,й; С 55,48; Н 5,91; М 17,98. Соединения вводили путем внутрибрюшинной инъекции, На каждую дозу брали группу из шести мышей, которые получали одну единственную дозу соединения в первый после заражения день. В каждую серию экспериментов включали группу из десяти мышей, которым вводили физиологический раствор. Группы, обработанные митомицином С, были включены в качестве положительного контроля. Для каждой1301831 Таблица 1 Среднее изменениевеса при дозе" Соединение Максимальный эффект, Минимально (пример) 7 Т/С доза, мг/кг эффективвеса ная доза максималь- минимально эффек- но эффективнои тивной-1,2 Х(8 ) В скобках значения, полученные при введении митомицина С в качестве положительного контроля в том же эксперименте." Грамм на мышь; дни 1-6 при максимально и минимально эффективных дозах. тивности при заражении мышей В 16меланомой коричневой,группы мышей в течение 30 дней отмечали время выживания в днях, а в конце 30-дневного периода регистрировали число выживших особей. Мышей взвешивали перед введением препарата и 5 повторно на 6 день. Изменение веса быпо принято в качестве меры токсичности веществаВ эксперимент брали мышей весом 20 г каждая и потерю веса до2 г не считали чрезмерной. Результаты выражали в 7 отношения Т/С (сгеайей/сопго 1 ), которое представляет собой отношение времени выживания группы, обработанной препара 15 311(244 )Ф 6%4 (ЗР 2 )183(272); 6,4(3,2)233(244 )р 6,4(3,2 )141(224 ); 25,6(3,2)233(272); 12,8(3,2 ) В табл, 2 представлены результатыисследования противоопухолевой актом, ко времени выживания контрольной группы, обработанной физиологическим раствором, которое было принято за 1007, Животные, которым вводили физиологический раствор, обычно погибали не позднее девятого дня,Таким образом может быть вычислена относительная активность предлагаемых соединений по сравнению с митомицином С, Минимальным эффектом считали 1257 Т/С. Минимально эффективной дозой, приведенной в табл.1 является доза, вызывающая минимальный эффект (1257 Т/С).1301831 эффективности и для каждого тестируемого соединения определяли максимально эффективную и минимально эффективную дозы. За минимально эффективную 5 дозу принимали такую дозу, котораявызывала 125% Т/С эффект. Для каждой дозы опытным животным внутрибрюшинно вводили тестируемое соединение на 1-й, 5-й и 9-й день, Среднее изменение веса в день, отмеченное при максимально эффективной дозе и при минимально эффективной дозе, использовали в качестве меры токсичности. Потеря веса в 2 г для 20 г мыши не считалась чрезмерной. Таблица 2 Среднее изменениевеса при дозе Максимальный эффектМинимальноэффективная доза максимально эффективной минимально эффективной) 295(198 )," 2,0(3,2 ) 111(5 ) Э В скобках значения контроля с митомицинам С. Соединения исследовали на противоопухолевую активность по отношению к В 16 Мцгпе меланоме при подкожном введении опухолевого имплантанта и40 внутривенном введении препарата,Гра" фик введения препарата и значения времени выживания (исследования проводили в течение 40 дней) определяли как указано, На 12-й день измеряли45 изменение веса. Максимально эффективная доза соединения 1 была 30 мг/кгЭта доза вызывала эффект 156% Т/С и прирост веса 1,5 г. В группы брали по шесть животных, и при этой дозе50 мыши выживали в течение всех 40 дней. Минимально эффективная доза была 0,25 мг/кг, при этой дозе на 12-й день изменение веса равнялось 1,0 г.Минимально эффективную дозу мито 55 мицина С не определяли.В кратком токсикологическом исследовании группам из пяти белых В ВЕ мышей на дозу внутрибрюшинно вводили Эксперименты проводили на В И., мышах, которым внутрибрюшинно инокулировали опухолевый имплантант. Протяженность эксперимента 60 днейНа каждую дозу тестируемого соединения брали группу из 10 мышей и для каждой группы определяли время выживания. У контрольных животных,инокулированных так же, как и опытные животные, и инъекцированных растворителем без препарата, время выживания составляло 21 день. Отношение времени выживания опытных животных ко времени выживания контрольных (% Т/С) использовали в качестве меры 1 однократную дозу соединения. В результате при оптимально эффективной дозе вводимого соединения не наблюдалось значительного уменьшения числа лимфоцитов При этой дозе также не отмечалось значительного повышения азота мочевины крови (В цп) или сывороточной глютаматфосфотрансферазы (81 РТ ), что указывает на отсутствие неблагоприятного воздействия на функцию почек или печени, а также на то, что препарат не подавляет активность лимфоцитов.Ввиду высокой противоопухолевой активности, выявленной в экспериментах на животных, а также пониженной токсичности в сравнении с митомицином С данное изобретение включает использование соединений общей формулы 1 для подавления опухолевого роста у млекопитающих. В этих целях они применяются системно (по всему организму) у млекопитающих, имеющих1301831 12 К, к к и-с=из 4 7-Замещенные 9 а-метоксимитозанаобщей формулы Составитель И,БочароваРедактор С,Пекарь Техред В.Кадар Корректор И.Эрдейи Заказ 1191/26 Тираж 372 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж.-35, Раушская наб., д,4/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул,Проектная,4 опухоли, в основном в нетоксичныхпротивоопухолевых эффективных дозах. Формула изобретения 01 снЪ - Я.где А - амино-, метокси- или группаобщей формулы В - амино- или амидиновая группа5 общей формулыКК К И-С=М 3 4 К - водород, формил или метил;К - водород или метил;К и К - каждый в отдельности метилз аили изопропил или вместе сатомом азота, к которомуони присоединены, образуют15пиперидин или морфолин,обладающее противоопухолевой актив-ностью,