Способ количественного определения вирусов

Изобретение относится к областииммунохимии вирусон и может быть использовано в различных областях ме-,дицины, сельского хозяйства для высокочувствительного экспресс-анализаматериала, содержащего вирусы,Пелью изобретения является упрощени е способа,П р и м е р 1, Анализ х-вируса 1 ркартофеля (ХВК) с использованием вкачестве полиэлектролитов полиметакриловой кислоты (ПМАК) и поли-Нэтил-винил-пиридиний бромида (ПВП),В качестне антител используют 15-глобулиновую фракцию кроличьей антисыноротки к ХВК. 1-глобулиновуюфракцию сыворотки крови выделяют двух"кратным осаждепнем 20 -ным воднымраствором полиэтиленгликоля (М,В. 20400-6000) с последуюодм диализом против.001 М К-фосфатного буфера(0,1 М БаС 1) рН 7,4.Перед использованием иммуноглобулины термостатируют при 56 С в те;ение ЗО мии. В качестве ферментаиспользуют пероксидаэу хрена (ПХ) сЕЕ=2,8-3,0 (производство НПО "Биохимреактив", г. Олайне, ЛатвийскаяССР) (ЕС 1,11.1,7). Коньюгат иммуноглобулинон с пероксидазой (АТ-ПХ)получают методом окисления углеводного компонента фермента периодатомнатрия.И качестве антигена используютвысокоочищенный вирусный препаратХВК. Препаратинное выделение очищенных экстрактов ХВК, его очистку иконцентрирование проводят по стандартной методике, используя несколь, ко циклов дифференицального центрифугирования,Полиметакрилоную кислоту (ПМАК)получают свободнорадикальной поли"мериэацией метакриловой кисЛоты с 45последующим выделением из метанолаФракции с ЙВ=200000-300000 добавлением ацетоуксусного эфира.Поли-К"этил-. 4-винил-пиридинийбромид (ПВП) получают алкилированием поли"4-винилпиридина избыткомбромистого этила при 60 С в тече"иие 30 ч с последующим высаживаниемв эфир. В работе используют ПВП сМВ -40000-100000. 55Экстракты вирусов иэ растительного материала получают, растирая ма"териал в Фарфоровой ступке с добавлением 0,01 М К-фосфатного буфера(0,1 М ИаС 1), 0,1 тритон Х)рН 7,4 в соотношении 1:5 (растительная масса: объем буфера), Полученныеэкстракты оснетляют центрифугированием 5 мин при 8000 об/мин. Послецентрифугирования надосадок подвергают дальнейшему осветлению встряхиванием с хлороформом (1/3 часть отобъема экстракта) .н течение 3 минс интенсивностью около 100 качанийв минуту. Далее, эмульсию центрифугнруют 5 мин при 8000 об/мин, Исполь"эуют водную фазу, В пробирку, содер"жащую О, 1 мл исследуемого образца(растительный сок, экстракт или очищенный препарат ХВК), добавляют0,05 мл раствора коньюгата АТ-ПХ(100 нг/мл по ПХ).н 0,01 М К. - фосфатном буфере (0,1 М ИаС 1 0,1 тритон Х) рН 7,8 (ТФБ) . После чегопоследовательно добавляют по0025 мл раствора ПМАК (0,2 мг/мл)и ПВП (0,5 мг/мл) н том же буфере.Осадок отделяют центрифугированием5 мин при 2500 об./мин на центрифугеТ 1-6 Е (ВасЬпап, Австрия), Осадок отмывают трижды по 0,25 мл ТФБ. Отьытый осадок растворяют в 0,05 М трисацетатном буфере (1 М ИаС 1 0,1 .тритон Х) рН 7,8 в течение1 мин при комнатной температуре. До-1банля 1 от 0,15 мл субстратной смеси(о-фенилендиамин 0,53 мг/мл, 0,008 .КО в 0,1 М К-цитратном буферерН 5,2), инкубируют 10 мин при комнатной температуре, Реакцию останавливают, добавляя 0,1 мл 4 М НЯОи определяют оптическую плотностьпродукта. Ферментативной реакции при490 нм, Пересчет оптической плотности продукта ферментативной реакциив концентрацию ХВК производят по калибровочному графику, полученномупри измерении стандартного препарата ХВК ннесенного в сок здоровогорастения. Чувствительность метода -8 нг/мл ХВК, время одного анализа15 мин, Метод дает возможность выявлять ХВК н проростках, листьях растений на различных стадиях вегетации,а также проводить контроль растений,оздоровленных методом культуры меристемП р и м,е р 2., Определение вируса гепатита В с использованием ПМАКи ПВП. К 0,1 мл исследуемого образ"ца (сыворотка нли очищенный препаратповерхностного антигена вируса гепа 139470 тита В) добавляют 0,05 мл раствора меченых ферментом антител (40 нг/мл по ферменту) и ТФБ инкубируют 5 мин при комнатной температуре и переме 5 иявании. Затем последовательно добавляют по 0,025 мл раствора ПИЛК (0,2 мг/мл) и ПВП (0,5 мг/мл). Осадок отделяют центрифугированием 5 мин при 2500 об/мин. К 0,05 мл надосадка добавляют 0,15 мл субстратной смеси (о-фенилендиамнн 0,53 мг/мл, 0,008 Ж ЯО в 0,1 М К-цитратном буфере рН 5,2). Инкубируют 5 мин при комнатной температуре, Реакцию оста навливают, добавляя 0,1 мл 4 МНВО и определяют оптическую плотность продукта ферментативной реакции при 490 нм, Чувствительность метода. - 0,5 нг/мл вируса, время анализа - 20 15 мин,По сравнению с разработанным на сегодняшний день медицинской диагностикой иммуноферментным твердофазным 25 методом анализа гепатита В, предлагаемый способ позволяет сократить время анализа с 5 ч до 15 мин при й4двухкр атной увеличении чувствитель- ности детекцин, Экспресс- метод де-, текции вируса гепатита В представ" ляет большой интерес для применения на станциях переливания крови, где в настоящее время используется метод встречного иммуноэлектрофореза, позволяющий определить в течение суток до 1 мкг антигена.Формула изобретенияСпособ количественного определения вирусов, включающий образование комплекса исследуемых вирусов с мечеными специфическими антителами и осаждение его под действием поли- катиона и полианиона, отмывание осадка, добавление субстрата и определение концентрации вирусов по концентрации метки, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа, меченые антитела добавляют непосредственно к вирусам, а поли- катион и полианион вводят последова тельно к полученному комплексу вирусы-меченые антитела, Составитель В. ДроздовРедактор Н. Тимонина Техред И.Дидык Корректор Н. КорольЗаказ 4673/ДСП Тираж 37" Подпи сно еВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5еПроизводственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4