Способ получения 3-0 -глюкуронпиранозил соясапогенола

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИН Ф С 07 Э 63 РЕ ПАТЕНТУО н,он Н отличадинение форму Н НО О 3-О-(Р-а - 01 ЕНОЛА б ечение ыд ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ.И ОТКРЫТИЙ АНИЕ ИЗ(46) 07,11,85. Бюл. Мф. 41 (71) Оцука фармасьютикал Ко., Лтд(1 (72) Масанао Синохара, Есимаса Накано, Хироцугу Каисе, Такетоси Изава и Васеи Миязаки ( 1 Р) (53) 547.689.6.07(088.8) ;,(56) ЗазцЬхчо Агджа Нгоуок 1 Яцш 1. .1 цшд 1 со ТаКайа. А 1 с 11 сазц Та 1 сас 1 а, АЬгЫ 8 ешеп 1 оХ 1 есгцге Ргоягашз оп Бешхпаг оЕ гЬе Р 1 азш 1 п КезеагсЬ Аззосдаг.акоп 65, 1977.МепеЯ КацаЕц:(Лшшцпо - СЬеш 1 зг дц 1 сЬ,1 ашашцга ега 1, Ей АзаЕцга ЯЬоеп. ТоКуо, Ларап, 1973, р,830- 834.-ГЛ)ОКУРОНПИРАНОЗИЛ)-СОЯСАПформулыРщ и й с я тем, что соы де К - С -Сб алкил, идролизуют при 50-110 С в -6 ч и соединение формулыляют из гидролизата.1 1190989Изобретение относится к способуполучения нового производного соясапогенола ; именно 3-О-(3-0- глюкуронпиранозил)-соясапогенола В формулы Вычислено,7; С 68,11, Н 9,21.С 6 Н 80 уНайдено,7: С 67,85; Н 9,08Тонкослойная хроматография на сили 5 кагеле с использованием "К 1 езе 1 СеЬ Р "25 Ф(коммерческое название для силикагеля компании МегсЕ).1. Хлороформ-метанол-вода (приобъемном отношении 65:35:8).0,38.Г2. Изопропанолн. водный раствор аммиака (при объемном отношении 100:15) Р= 0,21.Растворимость. хорошо растворим15 в метаноле, этаноле, н-пропаноле,н-бутаноле, водных растворах щелочей, пиридине, диметилсульфоксидеи диметилформамиде растворим в ацетоне, этилацетате и метилэтилкетоне;20 слабо растворим в бензоле, хлороформе, диэтиловом эфире, н-гексане ипетролеином эфире.Б. Соясапонин В (500 мг) растворяют в 30 мл этанола, насыщенного хло - 25 ристым водородом, и раствор кипятятс обратным холодильником в течение3 ч. К реакционной смеси добавляютхолодную воду.для осаждения преципитата, который собирают и промываютводой. Затем осадок очищают на колонке силикагеля методом хроматографии (растворитель для элюирования: смесь хлороформа и этанола вобъемном отношении 20:1, 10: 1, 5:1,2:1)35и получают 75 мг 3-0-(6-0-этил-В-глюкуронпиранозил)-соясапогенола В.Полученное соединение смешиваютс 2 мл этанола и 2 мл 1 н, водного,раствора едкого кали и смесь кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь смешиваютс холо ной водой, устанавливают рНомощью 1 н, водного расой кислоты с последующиманием н-бутанолом. Фракола выпаривают досухакристаллизуют остатокороформа и ацетона (вношении 1:1), Получают-П-глюкуронпиранозил)- а В,.т.пл. 231-232 С ОН СОО 0 ОН омплемента ной акка спо ения 3 соясапоре имл, му Полученное соединение растворяютдоколо 1 с и в 2 мл метанола и 2 мл 1 н. водноготвора солян раствора едкого натра добавляют кэкстрагиров первому раствору с последующим нагре цию н-бутан ванием с обратным холодильником в тев вакууме и чение 2 ч. После этого реакционнуюиз смеси хл смесь смешивают с холодной водой,объемном от .значение рН устанавливают равным 145 мг 3-0-( с помощью 1 н. водного раствора со-соясапонин ляной кислоты и экстрагируют н-бутанолом, фракцию н-бутанола концентри(с разл,). Руют досуха при пониженном давлении. Кристаллизацией остатка из смеси хлороформа и ацетона (в отноше нии 1:1 по объему) получают 50 мг3-О-(Р-глюкуронпиранозил)-соясапогено- ной кислоты ла б, т.пл . 231-232 С (с разл.). нием с обра е о ды .и во с следующим ки олодильником ч тным обладающего антик Ртивностью,Цель изобретения - разработсоба получения нового соедин-0- (-В-глюкуронпиранозил)генола В , обладающего преимуществами в фармакологической активностиперед глицирризином,Пример 1.А. Соясапонин В (500 г) растворяют в 30 мл метанола. После добавления 1,5 мл 15 н. серной кислоты раствор нагревают с обратным холодильником в течение 3,5 ч. К реакционной смеси добавляют холодную водудля образования осадка который соби)рают и промывают обильно водой. Пципитаты адсорбируют на колонке сликагеля и проявляют смесью хлороформа и этанола поочередно (20: 1 пообъему 200 мл, 10:1 по объему 1505:1 по объему 200 мл и 2:1 по объе200 мл) для получения 71 мг 3-0-(6-0-метилП-глюкуронпиранозил)-соясапонина 6. П р и м р 2. Соясапонин В(1 г) раств ряют в 70 мл дистилли 5 рованной во раствор смешивают с 5 мл 15 н диого раствора солячение 2,5 ч. Реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом. Фракцию н-бутанола выпаривают досуха под вакуумом. Остаток адсорбируют на колонке силикагеля и проявляют смесью 5хлороформа и этанола (в объемномотношении 20, 1, .10: 1, 5: 1, 2: 1) .Получают .350 мг 3-0-)-Э-глюкуронпиранозил)- соясапонина В , т.пл.231. 232 С (разлагается). 1 О11 р и м е р 3. 3-О-(6-0-Метил0-глюкуронпиранозил)-соясапогенол8 (70 мг) добавляют к 2 мл диоксана и к смеси добавляют 1;5 мл 15 н.Н БО. Результирующую смесь нагревают с обратным холодильником в течение 2,5 чРеакционную смесь экстрагируют н-. бутанолом и н-бутанольную фракцию концентрируют до сухого,остатка при пониженном давлении20Остаток, адсорбируют в. колонке с силикагелем и проявляют смесью хлороформэтанол в последовательности 20:110:.1-5: 1-2." 1 (по объему) с получением 24 мг 3-О-(-П-глюкуронпиранолиз) соясапогенола Ь, т.пл. 231-232 С, (с разл,),П р и м ер4. Р.аствор 1 г соясапонина б в 70 мл дистиллированной воды смешивают с 5 мл водного.раствора:, в котором содержится 3,6 гтрифторуксусной кислоты, и смесьнагревают. с. обратным холодильникомв течение 2 ч, Реакционную смесьэкстрагируют н-бутанолом. Н-бута 35нольную фракцию Концентрируют до сухого остатка при пониженном давлении. Остаток адсорбируют в колонкес силикагелем и проявляют смесьюхлороформ - этанол в последователь- . 40ности 20.1-10:1 .-5:1-2:1. (по объе-.му) с получением 175 мг 3-0-(/3-0 глюкуронопиранозил)-соясапогенола В,т.пл 231-232 С (с разл.).П р и м"е р 5. 3-0-(6-0-Метил-.(70 мг) добавляют к 2 мл воды и ксмеси добавляют 1,5 мл концентрированной соляной кислоты. Полученнуюсмесь нагревают при 50 С в течение .50о6 ч. Реакционную смесь экстрагируютн-бутанолом .и фракцию.н-бутанола концентрируют досуха при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на силикагеле вколонке нпроявляют смесьюхлороформ - этанол последовательно составами (20:1, 10:1, 5:1, 2:1,пообъему) с получением 22 мг 3-0-ЦЗ-Р"глюкуронпиранозил)-.соясапогенолаВ, т.пл. 231-2320 С (разложение).П р и м е р 6, 3-0-(6-0-Метил0-глюкуронпиранозил)-соясапогенолВ (70 кг) добавляют к 2 мл диметилсульфоксида и к смеси добавляют 2 мл1 н. водной гидроокиси натрия. Полуоченную смесь нагревают при 110 С в. течение 2 ч. После смешения реакционнойсмеси с холодной водой и доведениязначения рН до 1 с помощью 1 н. водной соляной кислоты, реакционнуюсмесь экстрагируют н-бутанолом ифракцию н-бутанола концентрируют досуха при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на колонке с силикагелем и проявляют смесью хороформэтанола последовательно составами(70 мг) добавляют к 2 мл диметилформамида и к смеси добавляют 3 мл1 н. бикарбоната натрия. Полученнуюосмесь нагревают при 90 С в течение3,5 ч. После смешения реакционнойсмеси с холодной водой и доведениязначения рН до .1 с помощью 1 н. водного раствора соляной кислоты, реакционную смесь экстрагируют н-бутанолом и фракцию н-бутанола концент-.рируют досуха при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на колонкес силикагелем и проявляют смесью хлороформ-этанол последовательно составами (20:1, 1 О:1, 5:,1, 2:1 по объему) с получением 27 мг. 3-0-(/3-Р-глЬкуронпиранозил)-соясапогенола 8,т.пл. 231-232 С (разложение .П р и м е р 8. 3-О-(6-0-Метил-/-0-глюкуронпиранозил)-соясапогенолВ (70 мг) добавляют к 2.мл тетрагидрофурана и к смеси добавляют45 мл. 1 н. карбоната калия. Полученную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 1 ч. После смешения реакционной смеси с холоднойводой и доведения значение рН до 1с помощью 1 н. водного раствора соляной кислоты, реакционную смесьэкстрагируют н-бутанолом и фракцию н-бутанола концентрируют досуха при пониженном давлении. Остаток адсорбируют на колонке с силикагелем и проявляют смесью хлороформ1190989 Таблица 1 АнтикомплеменОстрая токсичностьЛД ,мг/кг Соедитарная активность/мл 5 нение Более,300 1 ОБ 500-1000 Более 300 этанол последовательно составами,антикоплементарной активностью и .используются в качестве. лечебныхсредств при аутоиммунных заболеваниях.Фармакологические испытания,Испытываемые соединения:А. 3-0-(-Р-глюкуронпиранозил)--соясапогенол 8.Б. Глицирриэин (соединение длясравнения).1Антикомплементарная активность.Испытания заключаютсяв следующем. В пробирку загружают по 0,5 млводной дисперсии каждого из испытываемых соединений, по.0,5 мл сенсибилизированнЬх эритроцитов (СЭ),приэтом .культура .содержала 1 х 10 клеток/мл, 1 мл пятикратно разбавленного буферного раствора веронала,содержащего изотонический желатин(Этот 5-кратно разбавленный раствордля краткости назван ЖВБ) и по0,5. мл комплемента сыворотки (комплемент морских свинок) разбавленного 150 раз ЖВД. Смесь выдержива-.ют при 37 С в течение бО мин. Затем к ней добавляют 5 мл ледяйогоФизиологического раствора. и смесьцентрифугировали. Спектральнаяпаглощательная способность отделенного верхнего слоя определяласьпри ОП 4 и измерялась степень ингибирования гемолиза сенсибилизированных эритроцитов испытываемыми соединениями, 507 значение ингибирующей гемолиз активности (/мл), измеренное предлагаемым методом, показано:в .табл. 1 для каждого испытываемого соединения.Острая токсичность.Острая токсичность(ЛД , мг/кгвеса) испытываемых соединейий определена на мышах при внутрибрюшин.ном введении в случае соединения А .и при внутривенном введении соединения Б,1Полученные результаты показаны в табл. 1,Как видно из результатов, представленных в табл. 1, значение ост-.рой токсичности (ЛД ) предлагаемогосоединения такого порядка, которыйпозволяет применять его в качествелечебного препарата.Терапевтическое действие на нефротоксин, вызывающий нефрит.Нефротоксин крыс (для краткости НТ)получают следующим образом.Кора надпочечника крысы равномерносмешивалась с равным количеством физиологического раствора. Гомогенизи-.рованную смесь .смешивали с полнымстимулятором Фрейнда (продукт компании Эссо) в объемном отношении 30 1:192 мл полученной смеси инъекц ровали внутримьппечно кролику (весом3100 г) для иммунизации кролика. Че-рез полтора месяца брали кровь изсердца кролика и получали сыворотку.Полученную, сыворотку инактивировалипри 56 С в течение 30 мин, затем выОсаливали 403-ным насьпщенным воднымраствором сульфата амомния и фракционировали. Фракции -глобулина (И-Г)собирали для получения НФ.40Оценку терапевтического действияпроводили на самцах крыс линии Вистарс весом тела 150-160 г при трех повторениях для каждого испытываемогосоединения. Испытываемое соединение 45.вводили внутрибрюшинно один раз вдень в течение 7 дней, Через 1 ч после введения испытываемого соединения, на 3-й день вводили НТ (нефротоксин). НТ инъекцировали внутривеннов количестве 1. мл в вену хвоста каждой крысе. Физиологический раствор. соли использовали в контрольной группе.Уровень протеинурии (общее количество выделившейся мочи .в течение24-часового периода) измеряли методом белкового помутнения с использованием альбумина бычьей сыворотки,1190989 Та блица 2 Показатели До введенияКонтроль 7 10 14 17 22 32 20 25 27 37 12 19 20 31 Среднее значение 20 23 33 Предлагаемоесоединение 1,9 0,9 1,2 2,9 1,8 13(3 мг/тело) 2,5 2,7 Среднеезначение 3,2 2,3 1,3 9,7 35 40 45 50 55 как эталона, с помощью сульфосалициловой кислоты. Номер дня отсчитывается со времени введения испытываемого соединения, которое происходит за час довведения нефротоксина,Уровень протеинурии у здоровыхкрыс колеблется 0,5-5 мг/день. Еслиуровень протеинурии превышает этипределы, особенно если уровень протеинурии выше 10 мг/день, то можнос уверенностью говорить о том, чтоимеет место нефрит. Как можно видетьиз результатов. табл. 2, нефрит появился в контрольной группе, а в случае применения испытываемых предлагаемых соединений уровень протеинурии со времени введения нефротоксина до 10 дней после введения взначительной мере такой же, что и уздоровых крыс. Таким образом, введение предлагаемых соединений ингибирует первичные и вторичные иммунные реакции,Терапевтическое действие при нефрите Хеймана.В эксперименте использовали крыслинии Вистер самцов с весом180-200 г, Экстрагировали кору надПолученные результаты представлены в табл, 2,Уровень протеинурии, мг/день почечников крыс и гомогенизировали с равным количеством физиологического раствора по объему. Гомогенат центрифугировали при 1500 в течение 1 ч. Верхний слой жидкости очищали по известному методу и смешивали с полным стимулятором Фрейнда 37 Ка (выпускаемого компанией Элисо) в отношении 0,4: 1 по объему. Полученную смесь внутрибрюшинно инъецировали изологическим крысам в количестве 0,5 мг на крысу. Затем такое же количество смеси вводили каждые рве недели до тех пор, пока нротеинурия достигала уровня, превышающего 100 мг в день. Этот период составлял 6-8 недель.Каждое из испытываемых соединений внутрибрюшинно вводили крысам, больным нефритом Хеймана (весом 300- 350 г) один раз в день в течение 7 дней и затем измеряли уровень протеинурии (мг/день) описанным способом. Физиологический раствор использовали для контроля, Полученные результаты представлены в табл. 3..121 105 121 109 105 135 132 109 121 117 137 Среднеезначение 131 119 109 122 129 116 Предлагаемоесоединение 42 27 89 117 127 39 129 119 58 123. 123 112 28 Редактор С. Патрушева Заказ 70 10/62 Тираж 353 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д, 4/5 До введенияКонтроль