Способ получения смеси 5 -рибонуклеотидов из раствора нуклеиновых кислот, содержащего дезоксирибонуклеиновую кислоту

(1% И С 07 Н 21 0 рте 5-РИБОЕИНОВЫХИБОНУКк медиц ения 5 етен оксиощение ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСНУКЛЕОТИДОВ ИЗ РАСТВОРА НУКИСЛОТ, СОДЕРЖАЦЕГО ДЕЗОКСЛЕИНОВУЮ КИСЛОТУ(57) Изобретение относитсяне, точнее к способам полурибонуклеотидов. Цель изобпредупреждение разложениярибонуклеиновой кнслоть и способа. Для этого фермент 5 -фосфодиэстеразу иммобилизуют, образуя ковалентную связь между ферментом и полимерным носителем с каналами от 100 нм и объемом пор 2-3 м(г (например, эпоксидный носитель К, являющийся сополимером из глицидилметакрилата, аллилглицидилового эфира, метакриламида и метилен-бис-метакриламида. Раствор природных нуклеиновых кислот, содержащий дезоксирибонуклеиновую кислоту с мол.м. более 100000 и рибонуклеиновую с мол.м. менее 50000, пропускают через колонку с 5 -фосфодиэстеразой, Для получения 5 - инозинмонофосфата гидролизат пропускают через колонку с фиксированной на носи теле з -дезаминазой, Результат соединения определяют, измеряя ферментативную активность на полимере и в промывочной воде. 1 з.п. ф-лы.Изобретение относится к областичедцины, в частности к способам поучея 5" -рибонуклеотидов.Целью изобретения является предуреждение разложения дезоксирибонук"йеиновой кислоты и упрощение способаЬа счет использования природньгх нукеицовых кислот, содержащих дезокси еибоцуклеиновую кислоту с мол.м. боее 100000 и рибоцуклеиновую кислотумол.м, менее 50000Способ осуществляется следующимбразом,П р и м е р . Фермент 5-фосфодистеразу иммобилизуют путем образоваия ковалентной связи между ферменом и полимерным носителем, в качесте которого используют такие полимерые пористые носители, которые имеютаналы диаметром от 100 цм и объем:ор 2-3 мл/г, предпочтительно 2,5 мл/г;,собенно хорошим носителем для 5- осфодиэстеразы является эпоксидцыйноситель (К) Ойпергит С, представяющий собой сополимер из глицидилметакрилата, аллилглицидилового эфира, метакриламида и метилен-бис-метакрламида. Фермент соединяют с полимерным носителем при условиях,. цевлияющих на стабильность фермента.Результат соединения определяют путемизмерения фермецтативной активностина полимере и в промывочной воде.роцесс осуществляют следующим обазом.352 г 5 -фосфодиэстеразы (цуклеазыК р, фирма Лмацо) растворяют в 80 мл1 Г 1 буферного раствора фосфата с рН7,8, Раствор подают в колонку, содеркащую 20 г эпоксидного носителя ("Ой- "пергит С") с каналами диаметром до100 нм и объемом пор 2-3 мл/г слегка перемешивают и оставляют на 3 дцяпри комнатной температуре. Полимернуюсмолу отфильтровывают и промываютследующими жидкостями: бидистиллятом;1 И раствором ЫаНСО ,. 0,5 М раствором Г 1 аС 1; бидистиллятом; 1 М раствором НС 1; бидцстиллятом. Промытуюсмолу помещают в 0,05 Г 1 ацетато-буферцый раствор и загружают д стеклянную колонку с двойной рубашкой диаметром 2,6 и высотой 20 см, Для измерения активности иммобилизованной51-фосфодиэстеразы субстрат-раствор, 55состоящий из 4% РНК и 0,1 мИ раствора сульфата цицка и 0,05 М ацетатабуферного раствора с рН 4,5, пропускают через колонку со скоростью протекания (БЧ) 20-ЗОЬпри 55 С. Количество мононуклеоотидов определяют фотометрически с помощью жидкостной хроматографии наколонке КР ("гечегзеЛ р 1 азе" сили 1 Вкагель, гидрофобизированньп алифатическими соединениями с углеводной цепочкой, содержащей до 18 атомов углерода). Злюировацие осуществляют нодой, подкисленной фосфорной кислотойдо рН 2,1, при скорости потока 2 мл/ /миц. Проявление осуществляют с помощью УФ-излучения с длиной волны 254 нм.И р и м е р 2. Водный раствор, содержащий 0,9% (вес/объем) природной нуклеиноной кислоты, в котором количество РИК и ДНК находится в соотношении 4:1 и ДНК имеет мол.м. более 100000, а РНК - менее 50000, доводят до рН 4,5 ледяной уксусной кислотой и пропускают через колонку с иммоби/лизованцой 5 -фосфодиэстеразой (согласно примеру 1) при 55 С. Скорость потока через колонку регулируют таким образом, чтобы осуществлялось 100%-цое превращение РНК, Для выделения 5 -рибоцуклеотидов разрушенный раствор нуклеиновых кислот пропуска- ют через колонку, заполненную слабо- основной иоцообмеццой смолой РБО 1,11 Е Л 7 в ацетатцой форме. Для очистки и выделения ДНК элюат с колонны концентрируют с помощью КОМ 1 СОИ-патронов с полым волокном (полисульфоновое волокно, граница выделения 100000) и подвергают диализу по отношению к доде,. це содержащей солей. Через мембрану могут проходить молекулы с молекулярным весом менее 50000. ДНК осаждают, доводя рН раствора до 2,0 и после высушивания получают, в виде белого порошка. Отделение смеси 5 - рибонуклеотидов осуществляют путем селективной десорбции ацетатными ра" створами повышающейся концентрации: СЫР: 0,1 и. уксусная кислота; АМР: 0,3 н. уксусная кислота; 7 МР: 0,4 н. ацетат аммония; СМР: 0,5 и. ацетат аммония. Общий выход 5-рибоцуклеотидов 75-80%.П р и м е р 3. Водный раствор, содержащий 3% (вес/объем) природной нуклеиновой кислоты, в котором количество РНК и ДНК находится н соотношении 4:1 и ДНК имеет мол.м, более 100000, а РНК - менее 50000, доводятг 1 41 О кисОтой,сарж 1 е ццую, Ц 1 К Отф 11 ьт ровывают и вмсуц 11 ают.Общий вьход смеси 5 -рибонуклеотцдов, солежащец,НК, составляет 75- 807,.Таким образом, способ получения 5 -рибонуклеотидов не требует предварительной очистки РНК и тем самым не влечет за собой разрушение ДНККроме того, раствор, полученный гидролиэом наряду с 5 -рибонуклеотидами и неразрушенной ДНК содержит также еще примеси протеинов и солей фермецтов, которые можно выделять очисткой.Раствор, полученный гидролизом природных нуклеиновых кислот, содержащий также 5 -аденозинионофосфат, можно использовать непосредственно для получения 5 -ицоэинмонофосфатаприменяемого в качестве усилителя вкусовых свойств, при этом не требуется предварительное выделение ДНК.(1. Способ получения смеси 5 -рибонуклеотидов из раствора нуклеиновых кислот, содержащего дезоксирибонуклеиновую кислоту, путем гидролиэа рибонуклеиновой кислоты с последующим выделением продукта ионообменной или адсорбциоцной хроматографией, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью предупреждения разложения дезокси" ибонуклеиновой кислоты и упрощения пособа, раствор природных нуклеиноых кислот, содержащий дезоксирибоуклеиновую кислоту с мол.м. более 00000 и рибонуклеиновую кислоту с 1 ол.м. менее 50000, пропускают через олонку с 5 -фосфодиэстеразой, предарительно иммобилизованной .на макроористом полимерном носителе с канаами диаметром до 100 нм и объемом ор 2-3 мл/г.2. Способ по п,1, о т л и ч а ю и й с я тем, что для получения -иноэинмонофосфата: гидролизат ропускают через колонку с фиксироанной на носителе 5 -дезаминазой, инал Корректор А.Обручар 35 рП р и м е р 4. Водный раствор 2% с (вес/объем) природной нуклеиновой кис- в лоты (РНК) ДНК 1:1, мол.м. ДНК более н 100000, РНК - менее 50000) обрабатывают., по примеру 2 и для разложения40 пропускают через колонку с иммобили- к зованной 5 -фосфодиэстеразой. Элюат в с помощью ИаОН доводятдо рН 8,5 ии с целью адсорбции нуклеотидов пропус- л кают через колонку, заполненную силь- и.45 ноосновным анионообменником 1 К А 4000 (хлоридной формы). Элюат с ионитовой 1 колонки концентрируют с помощью мем" 5 бран н-" эснове полых волокон и дово- . п л". . о 2,0 концентрированной соля вСоставитель Л.ШилРедактор О.Спесивых Техред М.Моргента Заказ 5568/59 Тираж 348 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб д. 4/5 3 14351рН до 4,5 легяО уксусной кислотОЙо,и при 55 С пропускают через колонку, -с иммобилизовацной 5 -фосфодиэстеразой согласно примеру 1, Скорость потока через колонку регулируют таким5образом, чтобы осуществлялось 100%ное превращение РНК (например, приактивности 265 г РНК на 1 л фиксированного фермента в час раствор пропускают через колонку с помощью насоса со скоростью 2,12 л/ч), В полученном растворе содержится также 5 -аденозинмонофосфат. Для получения изнего 5 -инозинмонофосфата раствор 1пропускают через вторую колонку с иммобилизованной 5 -дезаминазой (такжесогласно примеру 1). Элюат с колонкиконцентрируют с помощью мембран наоснове полых волокон и прошедшую через мембрану часть доводят до рН 1,52,0 концентрированной соляной кислотой, затем пропускают через колонку,заполненную гранулированным активи рованным углем, адсорбируют 5 -рибо Ф о р м у,л а и з о б р е т е н и януклеотиды. Из оставшейся части прирН 2,0 осаждают ДНК и затем высушивают. Выделение смеси 5-рибонуклеотидов осуществляют путем селективнойдесорбции щелочцыми метанольными растворами следующего состава: 50 об.ч.метанола, 49 об,ч, воды и 1 об.ч. концентрированного водного раствора аммиака. Общий выход 51-рибонуклеотидов 75-80 Х.