Штамм бактерий lастовасillus рlаnтаruм продуцент рестриктазы lp

(5)5 С 12 1/20 ЕНИЯ САНИЕ И ВТ я к биотехнолоовано в молекусследованиях, ышленности, в тельской раборобных ютиз и годамиРес ндонук- акАТС 5 участв одном и ИХ 174 т,собай но-генеимеет азмиде стайчи- ельство леаэы р 6 АТи ках, аде и не гидРес ценный тически один уч рВЯ 322 вость к явление штамма продуцента релее высоким вы астоЬас 11 цз щивают на питай источники угые соли в анаэГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОМУ СВИДЕТЕЛЬС(71) Институт биологической и медицинскойхимии АМН СССР и Институт биохимии ифизиологии микроорганизмов АН СССР(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических исследованиях,микробиологической промышленности, впрактике научно-исследовательской рабоИзобретение относитсгии и может быть использлярно-генетических имикробиологической промпрактике научно-исследавты. Цель изобретения - вы 1 астоЬас 111 цзр 1 аптагцв - стриктазы, обладающей бо ходом фермента,Штамм - и родуцен р 1 аптагцв ВКМ Ввыра тельной среде, содержащ левада, азата и минераль Ы 1678832 А 1 ты, Целью изобретения является выявление штаммаассоЬас 1 цз р 1 амагцв, обладающего более высоким выходом фермента. Штамм - продуцентастоЬас 11 цз р 1 апсагцв ВКМ В - 578 выращивают в анаэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма 1 астоЬас 11 цз р 1 ап 1 агцв 578 содержит новую эндонуклеазу рестрикции 1 рг,1, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5 А Тф С 6 А Т в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах. Содержание рестриктазы в биомассе 6 - 7 х 10 ед,/г сырой биомассы. Для изоши 5замерарай - рестриктаэы Са выход очищенного фермента около 430 ед,/г сырой биомассы. Выход очищенного фермента 1.рт",1,6 - 1,7 х 10 ед,/г сырой биомассы, что при 5мерно в 400 раз превышает известные цифры для рестриктаэы С 1 а (430 ед.),условиях, целевои продукт выделялученной биомассы известными метриктазарг,1, изошизомер э естрикции С а узнает участ расщепляет ДНК фага А в 1 новируса 2 в двух, рВК 322 ролизует ДНК вируса ЯЧ 40 триктазар 6 1 представляе инструмент для молекуляр х исследований. Фермент асток расщепления на пл в гене, ответственном за у тетрациклину, Это обстоятпозволяет использовать вектор рВВ 322 дляклонирования любого фермента ДНК с 5-рСО - выступающими концами. Такие фрагменты ДНК образуются рестриктазойрг,1,а также Тас 1, Нра 11, Асу 1, Н 9 Ю 1, Яс 1 К 1, Маг1, Азу и другими,Поиск штамма - продуцента проводилипри помощи разработанного экспресс-метода определения активности рестриктаз втолуольных экстрактах бактериальных клеток с последующим электрофорезом продуктов расщепления ДНК в агарозном геле,Штамм бактерийастоЬас 111 оз, р 1 аптагшп 578 получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, гдехранится под ч. В КМ В - 578 фССМ 1845, 1904"АТСС 8014 = К С 1 В 8030, 6376 = ИСТС 6376.Характеристика штамма,Морфологические свойства, Палочки,часто образуют цепочки, неподвижны, грэмположительны,Культурально-биохимические свойства,На скошенном агаре рост по штриху нежный. Колонии на агаре мелкие, блестящие,края ровные, На мясо-пептонном бульоне ибульоне Хоттингера - осадок, бульон прозрачный.Отношение к кислороду - анаэроб.утилизация углеводов - на глюкозе, лактозе, мальтозе, манните, сахарозе образуеткислоту,Индол и сеооводород - не образует.)Келатина уколом - разжижения нет,4 увствитель ность к антибиотикам,Культура чувствительна ко многим антибиотикам: пенициллину, стрептомицину, канамицину, тетрациклину, хлорамфениколу,эритромицину, олеандомицину, неомицину,карбенициллину, линкомицину, гентамицину, метициклину, оксациллину, нистатину,ампициллину; резистентна к полимиксину.Оптимальные условия выращивания ихранения, Культура хорошо растет на МПБ,бульоне Хоттингера, средеВ и среде ч. 7,без аэрации, при 30-37 С.Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазург 1, получают при выращивании на питательной среде, котораясодержит в 1 л, г; дрожжевой экстракт 5;пептон 10; глюкоза 5; йа 2 НРОп 12 Н 20 2,2;МаС з; М 980 0,5; СаС 20,25.Существенным фактором культивирования являются анаэробные условия. Ваэробных условиях снижается выход фермента. Выделение рестриктазц проводятфракционированием и хроматографией на, колонках известными способами,П р и м е р 1. Культуру 1 ас 1 оЬас 1 цзр 1 амагшт штамм 578 предварительно адаптируют на основной питательной среде, со 10 держащей в 1.л , дрожжевой экстракт 5;пептон 10; глюкоза 5; Ма 2 НРО 4 12 Н 20 2,2; КаС з; М 950 0,5; СаС 12 0,25; при 37 С в течение ночи. Инокулят для ферментацииготовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10, и размножают в отсутствие аэрации, Фермектацию культуры проводят после добавленияв ферментер инокулята в соотношении 1:10 к обьему среды при 37 С при отсутствии аэрации; рН среды 7,2+0,2. Во время ферментации рН культуральной жидкости поддерживают в пределах 7,4 - 7,6, Выращивание продолжают до конца лаг-фазы,15 Выход биомассы составляет 7 г/л культуральной жидкости. Содержание рестриктазыр 1 1 б х 10 ед./г биомассы.Определение активности ферментапроводят с помощью экспресс-метода в то 20 луольных лизатах бактериальных клеток споследующим электрофорезом продуктоврасщепления ДНК в агарозном геле.Выделение рестриктазыр 1, 3 г биомассыассоЬасоз р 1 ап 1 агшп 578 суспенди 25 руют в буферном растворе и клеткиразрушают ультразвуком при 2-4 С. Послеудаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток фермент фракционируют 10-ным полиэтиленимином и затем30 подвергают фракционированию в двухстадийной системе полиэтиленгликольдекстрак, Обогащен кый рестриктазойэкстракт диализуют и хроматографируют вкалий-фосфатном буфере на колонке с35 ДЭАЭ-целлюлозой (ОЕ,."Ватман" ), затемна колонке с голубой сефарозой,Получают 1,7 х 10 ед, фермента на гбиомассы в 27,5 мл глицеринового буфера.Препарат рестриктазы Ьр 1 1 стабильно со 40 храняет активность в течение 9-12 мес. Фермент пригоден для анализа структуры ДНКи молекулярного клокирования,П р и м е р 2. Культивирование штаммаас 1 оЬасиз р 1 аптагца 578 проводят анало 45 гично примеру 1 за исключением того, что вкачестве питательной среды используютсреду, которая содержит в 1 л; бульон Хоттингера 250 мл; глюкоза 20 г, Выход биомассы 8 г/л культуральной жидкости.50 Содержание рестриктазц в биомассе 7 х 10ед, Й сцрой биомассы.После проведения очистки, выход рестриктазыр 11 составил 1.6 х 10 ед,г биомассы,55 Таким образом, по предлагаемому способу получают новую эндонуклеазу рестрикации 1 р 1,Биомасса штамма 1 ас 1 оЬас 111 цзр 1 аптагот 578 содержит новую рестриктаэурай, узнающую и расщепляющую нуклео1678832 Составитель И,ПриваловаТехред М.Моргентал Корректор О.Ципле Редактор Н.Яцола Заказ 3183 Тираж 363 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 тидную последовательность ДНК - А ТфС О А Т, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах, Содержание рестриктазы в биомассе 6-7 х 10 ед,/г сырой биомассы. Для изошизомера 1 р 11 - рестриктазы С 1 а 1, вцход очищенного фермента на 1 г биомассы около 430 ед. Выход очищенной рестриктазцрР составляет 1,6-1,7 х 10 ед, активности на 15г сырой биомассы, что примерно в 400 раз превышает значения, указаннце для известной рестриктаэы Са 1(430 ед.),5 Формула изобретенияШтамм бактерийассоЬас 1 Озр 1 аптагцв ВКМ В- продуцент рестриктазы 1 рб.