Способ получения биомассы sтrертомyсеs, обогащенной эндонуклеазой рестрикции sfi i.

(5)5 С 12 й 9/1 ИЯ ИЗО Т ВТО ви ссы сез й в еде еп а Я) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИПРИ ГКНТ СССР МУ СВИДЕТЕЛЬСТ(71) Институт цитологии и генетики СО АНСССР и Научно-исследовательский и конструкторско-технологический институт биологически активных веществ(56) Журавлева Л,И., Орешкин Е.НБезбородов А.М. Выделение и очистка эндонуклеазы рестрикции Яас 1 из ЯсгерсоаусезасЬгоао 9 епез АТСС 12767. - Прикладнаябиохимия и микробиология, 1981, т.23, М 2,с.208 - 215,Орехов А.В., Ребентиш Б.АДебабовВ.Г, Новая сайт-специфическая эндонуклеаза из Ясгерсоаусез-Яцг- Доклады АНСССР, 1982, т,263, йг 1, с.211 - 220. Изобретение относится к микробиологии и касается способов получения биомассы бактерий 5 сгерсоаусез ЛаЬГасцз с высоким содержанием рестриктазы Ю 1 1.Зндонуклеазы рестрикции являются важными инструментами генетической инженерии. Рестриктаза Бб 1, выделенная из Ясгерсоаусез йаЬгас) з Я, является уникальным ферментом, способным узнавать и расщеплять октануклеотидную палиндромную последовательностьварьируемым участком вставки 5 -ООСС 1 ч 4 й 66 СС.Способы получения рестриктаз различаются между собой используемыми штаммами, условиями культивирования, стадиями очистки. Оптимизация каждой(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ ЯТРЕРТОМУСЕЯ, ОБОГАЩЕННОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗОЙ РЕСТРИКЦИИ ЯГ(57) Изобретение относится к области микробиологии и касается способов получения биомассы бактерий Ясгерсоаусез баЬГасцз с высоким содержанием рестриктазы 56 1, и увеличение выхода целевого фермента. Способ заключается в следующем. Колонии микроорганизма Ясгерсогпусез йаЬгасоз (ВКПМ Я), выросшие на твердой питательной среде, гомогенизируют и переносят в жидкую питательную среду, состоящую из 3,5-3,70/ гидролизата кильки, Выход биомасы составляет 18 - 20 г/л культуральной жидкости, выход рестриктазы Ю1000 ед/г. 5 табл., 1 ил. стадии позволяет увеличить выход целевпродукта, однако решающего значеможно достигнуть, целенаправленно влна биосинтез рестриктазы, изменяя услокультивирования.В литературе сведений о полученииомассы Ясгерсоаусез т 1 гпЬГас)з, обогащной эндонуклеазой рестрикции Яй 1,обнаоужено.Известен способ получения биомамикроорганизмов вида ЯсгерсоауасЬгоао 9 епез АТСС 12767, включающисебя культивирование в колбах на срследующего состава. г/л: глюкоза 10,0; итон 4,0; дрожжевой экстракт 4,0; Мцк 7 НО 0,5; К 2 НРО 4 4,0: КН 2 Р 04 2.0 (сред. на круговых качалках(200 об/мин) при 30 С,рН среды 7,0-7,1; культивирование продолжали 24 ч. Выход биомассы 6,85 г/л.Недостатком способа является сложный состав питательной среды, низкий выход биомассы и невозможность, используяштамм, получить эндонуклеазу рестрикцииЫ .Наиболее близким к предлагаемому является способ получения биомассы изЯсгертогпусез огзепз, включающий культивирование продуцента на питательной среде 5 при температуре 30 С в колбах втечение 15 ч при перемешивании. Клеткицентрифугировали и хранили при 20 С, Выход биомассы составляет 8,2 г/л культуральной жидкости. Выход рестриктазы Бог20ед/г мицелия,Основными недостатками прототипаявляются: невысокий выход биомассы; низкий выход целевого фермента; многокомпонентная сложная питательная среда;невозможность данным способом получить, фермент, узнающий и расщепляющий последовательность нуклеотидов 5 -66 ССИз 66 СС-З,Целью изобретения является повышение выхода биомассы и увеличение выходацелевого продукта.Поставленная цель достигается тем, чтоинокулят продуцента фермента, содержащий 8 - 10 колоний микроорганизмов на 1 лсреды, подвергают гомогенизации передкультивированием, а культивирование биомассы Ясгер 1 оаусез йеЬгатцз ведут на йитательной среде, содержащей гидролизаткильки в количестве 3,5 - 3,7;4, в течение 48 -53 ч при перемешивании, которое в течениепервых двух суток осуществляют со скоростью 200 - 220 об/мин, а начиная со вторыхсуток - 150 об/мин,Способ заключается в следующем,Колонии микроорганизма ЯтгертовусезйгпЬгазиз (ВКПМ 5-750), выросшие на твердой питательной среде, переносят (из расчета .8 - 10 колоний на 1 л жидкойпитательной среды) в стеклянный гомогенизатор. Колонии тщательно ресуспендируютдо образования гомогенной массы, послечего переносят в жидкую питательную среду,состоящую из 3,5-,7 гидролиэата кильки,Культивирование ведут на термостатированных качалках при 30 С в течение 48 - 53ч при перемешивании, при этом в течениепервых суток (24 ч) перемешивание осуществляют со скоростью 200-220 об/мин, а начиная со вторых суток (с 25 ч) - со скоростью150 об/мин.После 53 ч культивирования клетки центрифугируют и выделяют из биомассы рестриктазу Ябизвестным способом (табл 1),Выход биомассы составляет 18-20 г/лкул ьтурал ь ной жидкости. В ы ход рестриктазы 86составляет 1000 ед. акт./г. Удельная5 активность рестриктазы 51 1 составляет3000 ед/мл,Получаемая рестриктаза Юузнает ирасщепляет последовательность нуклеотидов 5-66 ССч 4-66 СС-З, свободна от неспе 10 цифического нуклеазного загрязнения ипригодна для использования в генноинженерных работах,Определяющими отличительными признаками способа являются следующие.15 1, Инокулят продуцента фермента, содержащий 8 - 10 колоний микроорганизмовна 1 л питательной среды, подвергают гомогенизации, что позволяет повысить выходбиомассы.20 Особенностью 51 гертоглусез бгпЬпа 1 озявляется то, что колонии этого микроорганизма представляют собой сферические образования в форме шариков. Поэтомунебходимо перед высевом в жидкую пита 25 тельную среду провести тщательную их гомогенизацию, что дает возможностьполучать гомогенную биомассу. состоящуюиз колоний размером 1.5 2 0 мм с высокимвыходом.30 В случае отсутствия предварительнойгомогенизации биомасса представляет собой крупные клеточные конгломераты диаметром 5 - 8 мм и единичные мелкие колониидиаметром до 1,0 мм, что затрудняет выде 35 ление фермента.Зависимость выхода и качества биомассы от дозы посевного материала и режимаобработки представлена в табл,2.Из табл,2 видно, что оптимальным режи 40 мом для получения биомассы Б 1 гертогпусезбпЬгабаз является использование посевнойдозы 8 - 10 колоний субстратного мицелия на1 л свежей питательной среды и последующая гомогенизация инокулята.45 При использовании посевной дозы менее 8 колоний на 1 л выход биомассы падает.а при использовании более 10 колоний на 1л дальнейшее повышение выхода не происходит, однако наблюдается неравномерное50 разрушение биомассы.2, Культивирование продуцента веду 1на питательной среде. содержащей 3,53,7 гидролизата кильки в качестве органического источника аминного азота и55 незаменимых аминокислот, что позволяетповысить выход биомассы и целевого фермента,В табл,З представлена зависимость выхода биомассы и фермента от состава питательной среды.51015 20 Иэ табл.3 видно, что использование гидролизата кильки в экспериментально подобранной оптимальной концентрации (3,5-3,70 ) способствует максимальному накоплению рестриктазной активности, эа счет чего повышается выход целевого фермента.При использовании питательной среды с запредельными значениями концентраций гидролизата кильки (меньше 3,5 и больше 3,7 ) выход биомассы и фермента снижается,3. Культивирование продуцента ведут в течение 48-53 ч при перемешивании, при этом в течение первых суток (24 ч) перемешивание осуществляют со скоростью 200 - 220 об/мин, а начиная со вторых суток (с 25 ч) - со скоростью 50 об/мин, что позволяет повысить выход биомасы и целевого фермента.В табл.4 - 5 приведены зависимости выхода биомассы и фермента от времени культивирования и скорости перемешивания гомогенной биомассы.Из табл,4 и 5 видно, что увеличение урожая клеток в первой фазе культивирования(24 ч) происходит при перемешивании со скоростью 200 - 220 об/мин, что связано с эффективным разрушением клеточных ассоциаций, а уменьшение скорости перемешивания до 150 об/мин во второй фазе роста (после 24 ч) способствует увеличению гомогенной биомассы, обогащенной рестриктазой,На чертеже представлены электрофореграммы продуктов гидролиза линеаризованной по Чзр - сайту плазмиды рОКВ 85 ферментом Яб 1, где:1 дорожка - ДНК рОКВ 852 дорожка - обработка ферментом 15 мин3 дорожка -- " 30 мин4 дорожка --- 45 мин5 дорожка --- 1 чКак видно из чертежа при культивировании бактерии Ягертогпусеэ баЬг 1 атоэ предлагаемым способом получают рестриктазу Й 1, специфически гидролиэующую субстрат, не имеющую побочных интерферирующих активностей,П р и м е р 1, Клетки выращивают на твердой питательной среде(СПА). 9 колоний стерильно помещают в стеклянный гомогенизатор и тщательно ресуспендируют, однородную суспензию добавляют в 1 л питательной среды, состоящей из 3,6 гидролизата кильки, Культивирование ведут на термостатированных качалках при 30 С с перемешиванием 210 об/мин в течение 24 ч, далее 150 об/мин, После 50 ч культивиро 25 30 35 40 45 50 55 вания клетки центрифугируют. Выход биомассы 20 г/л. Биомассу хранят при -70 С.20 г клеток суспендируют в 80 мл буфера А (0,01 М калий-фосфатный буфер, рН 6 7,5, 10М В-меркаптоэтанол, 10 ф М ЗДТА, 10М фенилметилосульфонилфторид) и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе, Обломки клеток удаляют центрифугированием (18000 об/мин, 30 мин при 4 С) и надосадочную жидкость наносят на 250 мл ДЕАК-сефарозы 6 В (РЬагтас 1 а), уравновешенной буфером А, затем колонку промывают буфером А до ичезновения УФ- поглощающего материалал в элюате. Несвязавшийся с колонкой белок высаливали добавлением сульфата аммония до 70 насыщения и собирали центрифугированием(10000 об/мин, 20 мин при 4 С). Осадок растворяли в 0 мл буфера А содержащего 0,15 М МаС 1,диализовали против буфера А, содержащего 0,15 М МаС в течение 16 ч и наносили на 50 мл гепаринсефарозы (РЬаггпаса), Колонку промывали буфером А, содержащим 0,15 М йаС 1 до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате, затем буфером А, содержащим 0,14 М МаС 1 и 0,01% жееп 20 (Яегча), до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. затем фермент элюировали буфером А, содержащим 1 М КаС 1, Белок в смыве высаливали добавлением сульфата аммония л 70% насыщения и собирали центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин при 4 С). Осадок белка растворяли в 5 мл буфера А. содержащего 0,15 М МаС 1, диализовали против буфера А, содержащего 0,15 М КаС 1, в течение 16 ч, наносили на 15 мл гепарин-сефарозы, уравновешенной буфером А, содержащим 0,15 М йаС 1, и злюировали 150 мл градиентом 0,5 - 1,5 М МаС в буфере А. Объем каждой фракции 5 мл. Аликвоты иэ каждой фракции(1 мкл) инкубировали 1 ч при 50 С с 1 мкг ДНК фага Т 7 и анализировали в геле агарозы. Реакции, расщепляющие ДНК фага Т 7 (21 - 29), объединяли, диализировали 3 ч против 2 л буфера А, содержащего 0,15 М КаС 1, наносили на 20 мл НТР - Ь 1 оде 1 (В 1 ойас 1) и элюировали 400 мл градиентом (буфер А, содержащий 0,15 М ЙаС. буфер А, содержащий 0,5 М калий-фосфат и 0,15 М МаС 1), Объем фракций 10 мл. Фракции, содержащие Ю 1, определяли так же, как при хроматографии на гепарин-сефарозе, Фракции 29-32 объединяли и диализовали против буфера, содержащего 0,01 М трис-НС 1, рН 7,5, 0,2 М КС 1, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотрептол, 500 глицерин,За единицу активности принимали минимальное количество фермента, необходиСтепень Удельная активность Стадии очистки Активность,ед.акт. очисткиед/мл ед/мгШ т ж Грубый лизат ч 50 100. 000 1000 222 Очистка на ДЕАЕ-сефарозе 80,000 1,600 230 Сульфат-аммонийноеосаждение и очистка(градиентная хроматография) на гепарин-сефарозе 225 800 900 750 17.500 60.000 2 35.0000,5 30,000 Очистка от нтр-Ьоде 1 П р и м е ч а н и е. Активность объединенной фракции до диализа против 50/ глицерина. Удельная активность целевого продукта составляет 3.000 ед/мл или 60.000 едlмг мое для полного расщепления 1 мкг ДНКплазмиды рОКВ 85 в течение 1 ч при 50 С.Ферментный препарат хранят при-20 С,Из 1 г биомассы получают 1000 ед, рестриктазы ЯО с удельной активностью 3000 ед/мл,П р и м е р 2. Подготовку инокулята и культивирование ведут аналогично примеру 1, кроме того, что берут 10 колоний на 1 л 10 середы, состоящей из 3,7 гидролизата кильки, Перемешивание осуществляют при 220 б/мин в течение первых 24 ч, далее 150 б/мин. Клетки собирают после 53 ч. Выходиомассы 20 г/л. Выход фермента составляет 15 1000 ед/г, удельная активность 3000 ед/мл,П р и м е р 3, Подготовку инокулята и культивирование ведут так же, как в примее 1, кроме того, что берут 8 колоний на 1 л 20 вежей питательной среды на основе 3,5 О идролизата кильки. Перемешивание в перой фазе осуществляют со скоростью 200 б/мин. Клетки собирают после 48 ч, Выход биомассы 18 г/л, Выход фермента 1000 25 ед/г, активность 3000 ед/мл,Формула изобретения Способ получения биомассы Ягер 1 огпусев, обогащенной эндонуклеазой рестрикции ЯП 1, включающий подготовку инокулята, культивирование продуцента фермента на жидкой питательной среде, содержащей органический источник азота, углерода, минеральные соли и воду при 30 С с перемешиванием и последующим отделением биомассы от культу- ральной жидкости, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения выхода биомассы и увеличения выхода целевого фермента, в качестве микроорганизмов берут штамм Бтгер 1 оптусез бпЬга 1 цз ВКПМ 5=750, используют инокулят, содержащий 8-10 колоний микроорганизмов на 1 л среды, который перед культивированием подвергают гомогенизации, культивирование продуцента ведут нэ питательной среде, содержащей в качестве источника азота, углерода и минеральных солей гидролизат кильки в количестве 3,5 - 3,7%. в течение 48-53 ц при перемешивании, осуществляемом в течение первых суток со скоростью 200 - 220 об/мин. а начиная с вторых суток - 150 об/мин.1701745 10 Та бли ца 2 Доза посевного материала (количество колоний на 1 л среды) Режим обра- ботки Характеристика биомассы (диаметр клеток, мм) Выход Примечаниебиомас".сы,г/л 8 Без обработ 5 Крупные конгломерты (диаметр 5-8)Колонии мелкие выровненные (1,5-2) ки 18 Гомогениза 8-9 мелкиные азличаютмерамдо 3-ч) Табл Выход био од Ферментад.акт/г масс г/л е тестируется ердечно-моз говая вытяжка,051 КгНРО, 0,0011 РеБ 04 , О,05 Ж МдяО 0,014 аланин, минобензойная вой экстракт, изат 1 е тестируется кислота,Ильки,идролиза 8001000900200 12 18 20 16 Присутстг вуют круп ные и мел кие колонии 14 3,53,7 вая активност в-сре ция перети"раннем встеклянномгомогенизатореТо же Состав питательной с 0,1 ж кИО, 0 0,054 ИаС 1, 0,002 СаСОз 23, глюкоза, 10 мг/мл и-а 0,024 дрожже 0,054 гидрол Колонии выровне 2,0) Колонии сяпор (от 1,5 Плохо подвергавтсдезинтеграции Равномерное разруше ние клеток при дез- интеграции 0 Разрушение биомассы неравномерное1701745 Та блица Выход рестриктазыед,лкт/г Время культивирования, ч фоновая активность10060010001000800 24 40 48 53 58 Таблица 5 Число обоЧисло обо- Выход ротов пос- биомасле 24 ч сы, г/л об/мин Относительный выход фермента,ротов первые 24 ч,об/мин е 4 8 16 18 20 12 100 150 200 200 220 250 100 150 140 150 150 150 Не тестируется46809010060Некондиционнаябиомасса51Много мелких колоний наряду с2,0 мм40Некондиционнаябиомасса 160 200 18 220 Составитель Л. КучумоваРедактор Т,Лазоренко Техред М.Моргентал Корректор С,Черни роизводственно издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 101 каз 4512 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5