Способ получения биомассы бактерий providencia sтuаrтii, обогащенной рестриктазой р sт 1

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ЯО,7 А ОБРЕТ ЕН ЕЛЬСТВУ БАКТЕ- АЩЕННОЙ 11 И.С.,льтуральнои жидко риказь жанием сх высокимРвс 1.Цель ида биомас о ости,я вы повыш эобреени сы и ферм т ОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕК АВТОРСКОМУ СИИ(56) Яш 1 сЬ Р.1., В 1 асспег Р.К., Пачев 1. ТЬе 1 во 1 ас 1 оп апй рагса 1 сЬагассег 1 гас 1 оп оГ а пе гевсг 1 сс 1 оп епдопцс 1 еаве йгош Ргоч 1 оепс 1 а всцагс 11. в ,1. Мцс 1 е 1 с Ас. Кев., 1976, ч. 3, Р 2 р. 343-353.Бгееп Р 1., Неупе 1 сег Н.Ь., Во чаг Р., Кодг 18 цег К.Ь., Вес 1 асЬ СочаггцЬдав А.А., ВасЬпап К., Кцвве 1 01., Та 1 с К., Воуег Н.И. А ееп га 1 шеспод чог сне рцгйсас 1 оп оГ гевсг 1 ссоп епгушев. - Бцс 1 е 1 с Ас 10 Кев., 1978, ч. 5, 9 7, р.2373-2380.Лабораторная методика производст ва биомассы РгочЫепсда всцагсы, утв. 03. 10.81. Изобретение относится к микроб ической и химической промышле менно касается способа получе массы бактерий РгочЫепса вс 4 С 12 И 1/20, 9/22 (С 12 И 1/20, С 12 К 1:01) 2(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАСРИЙ РКОЧ 1 ЭЕВС 1 А БТЦАКТ 11, ОБОРЕСТРИКТАЗОЙ РБТ 1,(57) Изобретение относится к микробиологической и химической промышленности, а именно касается способа получения биомассы бактерий Ргоч 1 йепс 1 авсцасс 11 с высоким содержаниемрестрик- . таэы Рвс 1. Цель изобретения - повышение выхода биомассы и фермента. Для этого в качестве источнг ". азота и витаминов используют рыбнь 1 гидролизат в процессе выращивания на стадии достижения оптической плотности бактериальной суспензии 1,25-1,75 опт. ед, в среду вводят лактоэу и свежую питательную среду, причем лактозу вводят в количестве 0,6-1,6 г/л (в виде 402- увив ного раствора), а свежую питательную среду - в концентрации 1 Опо отношению к объему ферментера и процесс ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 2,5- 3,5 опт. ед. В результате использования предлагаемого способа выход биомассы возрастает до 12,5-13,0 г/л культуральной жидкости, а выход рестриктаэы повышается с 400-600 до до 61000-66000 ед./г биомассы или с 3000-4800 до 762500-858000 ед/лСпособ осуществляют следующим образом. 55 В процессе культивирования вводятсвежую питательную среду и лактоэу,что позволяет культивировать клеткиРгочЫепса зсцагс до достиженияоптической плотности бактериальнойсуспензии 2,5-3,5 опт.ед. (ФЭК, фильтр 0У 6, кювета 0,5 см).При введении лактоэы в количествахменее 0,6 г/л (в виде 40 Е"ного раствора), например 0,1 г/л, снижается выход биомассы и фермента. Введениелактоэы в количествах более 1,6 г/л(в виде 402-ного раствора), например2,1 г/л, приводит к снижению выходабиомассы и фермента, При этом происходит сильное закисление среды, в которой развитие бактерий РгочЫепсаэсцагг. происходит слабо.При введении свежей питательнойсреды в концентрации менее 1 ОХ по отношению к объему ферментера (например, 5 Х) снижается выход биомассы ифермента,При культивировании бактерий Ргоч 1 депс 1 а эсцагсд до оптической плотности бактериальной суспенэии менее2,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр У 6, кювета0,5 см), например 2,0 опт. ед., происходит снижение выхода биомассы ифермента, так как незавершен процесспостепенной ассимиляции лактозы и рыб 35ного гидролизата. При культивированиибактерий РгочЫепса вгцагС 1 до оптической плотности бактериальной суспензии более 3,5 опт. ед. (например,4,0 опт. ед.) происходит снижение выхода биомассы и фермента, так как происходит старение культуры и наступаетфаза отмирания клеток.П р и м е р 1. Оживление штаммаРгочЫепсда вгцагсд 17 ВКПМ В45осуществляют на сухом питательном агаре, содержащем 35 г/л сухого питательного агара и 1,Ол воды, в чашкахПетри.Инкубируют в термокамере при 35"37 Св течение 16-18 ч.С поверхности агара в чашках Петри культуру переносят бактериологической петлей в качалочные колбы с питательной средой, содержащей 50 г/л рыбного гидролиэага и до 1,0 л воды. Вкаждой колбе находится 200 мл среды.Культуру в колбах выращивают на качалке при 35-37 С в течение 16-18 ч. Посевной материал готовят иэ расчета 8 Е по отношению к объему питательной среды, загруженной в ферменте.Ферментацию культуры проводят в ферментере "Е 1 есгго 1 цх" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1,0 л воды, при:рН 72,-7,4;подаче воздуха 100 л/мин;перемешивании 300 об/мин,добавлении лактозы (в виде 407-ного раствора) при достижении оптической плотности бактериальной суспенэии 1,75 опт, ед. (ФЭК, фильтр Р 6, кювета 0,5 см) в количестве 1,6 г/л (75 г лактоэы и 187,5 мп воды),добавлении 203 свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт.ед. (ФЭК, фильтр 9 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л.Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр 9 6, кювета 0,5 см).Выход биомассы 13,0 г/л культуральной жидкости.Выход рестриктаэы Рзг. 1: 66000 ед/г биомассы, 858000 ед/л культуральной жидкости .Для определения активности использован метод электрофореэа в геле. Активность определяют в конце выделения (после хроматографии на колонке с фосфоцеллюлозой).За единицу активности рестриктазы Рег 1 принимают количество фермента, которое требуется для полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л в течение 1 ч при 37 С.Выделение фермента проводят следующим образом.50 г биомассы бактерий суспендируют в 100 мп 10 мИ трис-НС 1 буфера (рН 7,2), содержащего 10 мИ 2-меркаптоэтанола, 1 мМ азида натрия, 1 ьИ трилона Б (буфер "А"), и доводят этим же буфером до объема 150 мп. К суспензии добавляют 1,5 мл 1 ОЕ-ного тритона Хи 150 мг лиэоцима. Лиэис проводят 1 ч при постоянном перемешиваиии. Дальнейшее фракционирование лиэата проводят в системе двухфазного разделения.Полученный лиэат добавляют к смеси, состоящей иэ 37,0 мл 152-ного водного раствора декстрана Т, 56 мп 303" ного водного раствора полиэтиленглико5 1518ля (ПЭГ) и 35 мп 4,0 М хлористого натрия (рН смеси 6,5). Тщательно перемешивают в течение 15 мин и центрифугируют на центрифуге "Н 18 Ь вреед(20000 х 8, 20 мин). Верхнюю ПЭГ-фазу5объемом 120 мп, содержащую фермент,отбирают, разбавляют двухкратный объемом буфера "А", добавляют тритон Х 100 (0,12) и наносят на колонку сфосфоцеллюпозой, уравновешенную буфером "А", содержащим 0,12 тритонаХ(буфер "Б"). Фермент элюируют0-1,0 М линейным градиентом концентрации натрия хлористого в буфере "Б".фракции, содержащие рестриктазу Рвс 1,концентрируют диализом против буфера"Б", содержащего 552 глицерина.Получают очищенный фермент Рвг 1в виде прозрачной бесцвегной жидкости.Рестриктаэа Рвс 1 расщепляет ДНКфага Л на 18 сайгов,Содержание нуклеаз - после выделения отсутствуют. 35Хранят рестриктазу Рвг 1 при -10 Св течение 1 г. П р и м е р 2. Оживление культурыи выращивание посевного материалапроводят подобно примеру 1.Ферментацию культуры проводят вферментере "Е 1 есгго 1 цх" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизатаи до 1,0 л воды, при:рн7,2-7,4 ,подаче воздуха 100 л/мин,перемешивании 300 об/мин,добавлении лактоэы (в виде 402-ного раствора) при достижении оптическойплотности бактериальной суспенэии1,5 опт. ед. (ФЭК, фкпьтр Р 6, кювета0,5 см) в количестве 1,1 г/л (50 глактоэы и 125 мл воды)добавлении 152 свежей среды придостижении оптической плотности бактериальной суспенэии 1,5 опт.ед. (ФЭК,Фильтр 9 6, кювета 0,5 см) 7,5 л. 50Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,0 опт. ед. (ФЭК,фильтр У 6, кювета 0,5 см),Выход биомассы 12,75 г/л ку ьтуральной жидкости.Выход рестриктаэы Рве 1: 63500 ед/гбиомассы, 809625 ед/л культуральнойжидкости,367 6Определение активности, выделениефермента Рвг 1.и хранение проводягподобно примеруП р и и е р 3. Оживление культурыи выращивание посевного материалапроводя подобно примеру 1,Ферментацию культуры проводят вферменте "Е 1 есгго 1 цх" с рабочей емкосгью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизатаи до 1,0 л воды, при:рН 7,2-7,4подаче воздуха 100 л/мин,перемешивании 300 об/мин,добавлении лактозы (в виде 40 Еного раствора) при достижении оптической плогности бактериальной сус,пензии 1,25 опт, ед. (ФЭК, фипьтрУ 6, кювета 0,5 см) в количестве0,6 г/л (5 г лактоэы и 62,5 мл воды)добавлении 107 свежей среды придосгижении оптической плотности бакгериальной суспензии 1,25 опт. ед.(ФЭК, фильтр М 6, кювета 0,5 см) вколичестве 5,0 л.Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспенэии 2,5 опт. ед. (ФЭК,фильтр Ьф 6, кювета 0,5 см).Выход биомассы 12,5 г/л культуральной жидкости.Выход рестриктазы Рвг 1: 61000 ед/гбиомассы, 762500 ед/л культуральнойжидкости.Определение активности, выделениефермента Рвг. 1 н хранение проводятподобно примеру 1П р и м е р 4, Оживление культуры и выращивание посевного материалапроводят подобно примеру 1.Ферментацию культуры проводят вферментере "Е 1 есгго 1 цх" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизатаи до 1,0 л воды, при:рн 7, 2-7,4подаче воздуха 100 л/мин,перемешивании 300 об/мин,добавлении лактозы (в виде 407-ного раствора) при достижении оптической плотносги бактериальной суспензии клеток 0,75 опт.ед. (ФЭК, фильтрУ 6, кювета 0,5 см) в количестве1,6 г/л (75 г лактозы и 187,5 мп вод,добавлении 207 свежей среды придостижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед.(ФЭК, фильгр 9 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л.Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактери 5 альной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр 9 6, кювета 0,5 см).Выход биомассы 5,6 г/л культуральной жидкости.Выход рестриктазы Рва 1: 31250 ед/г,0 биомассы; 175000 ед/л культуральной жидк ос ти .П р и м е р 5. Оживление культуры и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1. 15Ферментацию культуры проводят в ферментере "Е 1 есгго 1 ох" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 10 л воды, при: 20рН 7,2-7,4,подаче воздуха 100 л/мин,перемешивании 300 об/минЪдобавлении 207 свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр 9 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 лдобавлении лактозы (в виде 403-ного раствора) при достижении оптичес кой плотности бактериальной суспензии 2,25 опт. ед. (ФЭК, фильтр 9 6, кювета 0,5 см) в количестве 1,6 г/л (75 г лактозы и 187,5 мл воды).Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр 9 6, кювета 0,5 см).Выход биомассы 6,6 г/л культуральной жидкости. 40Выход рестриктазы Рве 1: 34200 ед/г биомассы, 225720 ед/л культуральной жидкости. П р и м е р 6Оживление культуры 15 и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1.ферментацию культуры проводят в ферментере "Е 1 ессго 1 цх" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1 л воды, при:рН 7,2-7,4 ) подаче воздуха 100 л/мин, перемешивании 300 об/мнн добавлении лактоэы (в виде 407-но 55 го раствора) при достижении оптической плотности бактериальной суспенэии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр 9 6, кювета 0,5 см) в количестве 1,6 г/л (75 г лактоэы и 187,5 мп воды).Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК, фильтр 9 6, кювета 0,5 см).Выход биомассы 7,6 ед/л культуральной жидкости.Выход рестриктазы Рвг 1: 40500 ед/г биомассы, 307800 ед/л культуральной жидкости.П р и м е р 7. Оживление культуры и выращивание посевного материала проводят подобно примеру 1.Ферментацию культуры проводят в ферментаторе "Е 1 есгго 1 их" рабочей емкостью 50 л на питательной среде, содержащей 50 г/л рыбного гидролизата и до 1 л воды, при:рН 7, 2-7,4,подаче воздуха 100 л/минперемешивании 300 об/мин,добавлении 203 свежей среды при достижении оптической плотности бактериальной суспензии 1,75 опт. ед. (ФЭК, фильтр 9 6, кювета 0,5 см) в количестве 10 л.1Процесс выращивания ведут до достижения оптической плотности бактериальной суспензии 3,5 опт. ед. (ФЭК,фильтр 9 6, кювета 0,5 см),Выход биомассы 8,2 ед/л культуральной жидкости.Выход рестриктазы Рвг 1: 37000 ед/гбиомассы; 303400 ед/л культуральнойжидкости.Таким образом в результате использования предлагаемого способа выходбиомассы возрастает с 7,5-8,0 до12,5-13,0 г/л культуральной жидкости,а выход рестриктаэы Рвг 1 повышаетсяс 400-600 до 61000-66000 ед/г биомассы или с 3000-4800 до 762500858000 ед/л культуральной жидкости.формула изобретенияСпособ получения биомассы бактерий РгочЫепсда вгиасГ 1, обогащенной рестриктазой Рвг 1, включающий культивирование продуцента на питательной среде, содержащей источники аминного азота и витаминов при аэрации и пе)ремешивании, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повьппения выхода биомассы и фермента, в качестве источника аминного азота и витаминов ис10 151836 7 Составитель Н.ХодаревРедактор М.Петрова Техред А.Кравчук Корректор М.Максимивинец Заказ 6567/30 Тираж 501 ПопписноеРчИИПИ Государственного комитета по иэобрет . ням и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 1 роизводственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина,101 пользуют рыбный гидролизат, в процессе выращивания на стадии достиженияоптической плотности бактериальнойсуспенэии 1,25-1,75 опт, ед. в средувводят лактоэу и свежую питательнуюсреду, причем лактоэу вводят в количес тве О, 6-1, 5-г/л, а свежую пи га гельную среду - в концентрации 10-207. поотношению к объему ферментера и процесс ведут до достижения оптическойплотности бактериальной суспензии 2,53,5 опт. ед.