Способ получения холестериноксидазы

/04, 1984.НИЯ ХОЛЕСТЕРИмикробиолоов, в частноаэы;который нических анаится керменноксидн вкли ков, ваэы,гент но- инзом,Про ВКПМ Я глубинн щей, г/лртогпусез ачепсцае -840 Д) культивируютна среде, содержа - 10,0; К 2 НРО 4 0,5 - 1,5; СОэ 1,0-3,0; белковоуцент 51 834 (ВКМм способ крахмал 5 4 1,0 - 3,0; ст ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ ИЗОБР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬС юл. %35икробиологии АН СССРенецкий, Г.А. Ши ршоввС,Назарова, Л.Е,НикитинЕ.П.Яковлева и А,А.Селезне(57) Изобретение относгическому получению фсти фермента холестериможет быть использова Изобретение относится к области миробиологического получения ферментчастности фермента холестериноксидкоторый может быть применен как реав клинических анализах для количественго определения холестерина и в медицской практике для снижения холестеринакрови.Цель изобретения - повышение выходхолестериноксидазы и стабилизация холестериноксидаэной активности.Способ осуществляют следующим обра 5)5 С 12 М 9/04, 1/20// (С 12 й 9/О С 12 В 1:56) лизах для количественного определения холестерина, и в медицинской практике для снижения холестерина в крови, Целью изобретения является повышение выхода холестериноксидаэы и стабилизация холестериноксидазной активности, По изобретен ию и роду цент ЯТгер 1 оаусез а чеп б о ае ВКПМ 3-834 культивируют на питательной среде, где в качестве источника углерода используют растворимый или нерастворимый крахмал в количестве 5,0-10,0 г/л, в среду вводят минеральные соли, (г/л);СаСОЗ 1,0-3,0; (чН 4)2304 1,0-3,0; К 2 НРО 4 0,5-1,5; БВК 2 - 5, а в логарифмической фазе роста в возрасте 14-16 ч дополнительно вносят холестерин в количестве 0,02-0,05 г/л. Изобретение позволяет получать выход Б целевого продукта 2940 - 4500 ед,/л при ак- у тивности 420-550 ед./г,т 2,0-5,0; вода до 1 л, фмической фазы роьную жидкость вноестве 0,002-0,0056.ают до 20 - 24-часо, эатем мицелий от,5 М фосфатным омассы продуцента оверхностно-актив-Х 100. К 2 - 4-ной М фосфатном буфе 0.5%-ный Тритондут при 20 С при ании в течение 30фил ьтруют через бурат содержит холерагированную иэ оном-Х 100. витаминный концентра и по достижении логари ста (14 - 16 ч) в культурал сят холестерин в колич Выращивание продолж вого возраста культуры деляют и промывают буфером с рН 7,0. Иэ би фермент экстрагируют и ным веществом Тритон суспензии клеток в 0,05 ре с рН 7,0 добавляют Х 100. Экстракцию ве постоянном перемешив мин. Полученную смесь мажный фильтр, фильтериноксидазу, экст клеток продуцента ТритФерментативную активность определяют по образовакию холестенона в системе, содержащей 0,5 М фосфатный буфер с рН 7,0; 0,2 оь-ный,Твин; 1,5 мкМ/мл холестерина и экстракт фермента - 0,025-0,1 мл на 1,5 мл смеси, Определение ведут на спектрофотометре, измеряя изменение экстинкции при длине волны 240 нм, соответствующей максимальному поглощению для холестенона. За единицу холестериноксидазной активности прикимают количество мкМ холестенона, образующегося под действием холестериноксидазы замин при 370(Выход фермента. с 1 л культуральной жидкости составляет 2940 - 4500 ед, холестериноксидазы при урожае мицелия 7,0 - 9,0 г/л с активностью 420-550 ед./г.При содержании в среде менее 5,0 г/л крахмала урожай мицелия значительно снижается, а внесение в среду более 10,0 г/л крахмала ке оказывает влияния на процесс, Холестерин в концентрации от 0,002 до 0,005 наиболее эффективен для предотвращения снижения активности холестериноксидазы, вызываемого физиологическими причинами в процессе культивирования Я 1 г, 1 ачепбо 1 ае ВКМ АД.П р и м е р 1. Культивирование продуцента Я 1 г. 1 ачепдиае ВКМ АД и подготовку посевного материала проводят на среде следующсго состава, г/л: крахмал нерастворимый 10,0; КгНР 04 1,0; (Р 4 Н 4)гЯ 04 1,0; СаСОз З,О; белково-витаминный концентрат З,О; рН 7,0, Посевной материал готовят в колбах Эрленмейера на 250 мл с объемом среды 70 мл, выращивание ведут на качалке с 180 об;/мин в течение 24 ч при 28 С. Количество посевного материала 10; об./об.), Культуру выращивают в колбах Эрленмейера на 250 мл с объемом среды 70 мл на качалке с 180 об./мин. Через 14 ч культивирования в колбы вносят холестерин из расчета 0,002 О/., Культивирование продолжают до 22-часового возраста, затем мицелий отделяют, промывают 0,005 М фосфаткым буфером с рН 7,0. Фермект экстрагируют из мицелия раствором ТритонХ 100 и определяют его содержание в экстракте, Холестериноксидазная активность составляет 550 ед./г. Урожай сухого мицелия 8 г/л. Выход фермента 4400 ед./л,П р и м е р 2. Культивирование продуцента Яг.ачепсЬае ВКМ АД и подготовку посевного материала проводят на среде следу,ощего состава, г/л: крахмал не. растворимый 5,0; КгНРО 4 0,5; ИН 4)гЯ 04 1,0, СаСОз 1,0; белково-витаминный концентрат 2,0; рН 7,0, в условиях, описанных в приме-. ре 1. Через 16 ч культивирования в культу ральную жидкость вносят 0,003 холестерина и продолжают культивировать до 20 ч, Мицелий отделяют, промывают и определяют ферментативную активность, как описано в примере 1. Холестерикоксидазная активность мицелия составляет 420 ед,/г,урожай сухого мицелия 7,5 г/л; выход фермента 3150 ед./л,П р и м е р 3. Культивирование продуцента Ятг. ачепбШае ВКМ АД проводят в условиях, описанных в примере 1, на среде следующего состава, г/л: крахмал раствори- . мый 10,0; КгНР 04 1,5; (МН 4)гЯ 04 3,0, СаСОз 3,0; белково-витаминный концентрат 5,0; рН 7,0. Холестерин вносят после 16 ч роста в количестве 0,004 оь и выращивание продолжают до 24 ч. Холестериноксидазная ак 10 15 тивность мицелия составляет 500 ед./г, урожай сухого мицелия 9,0 г/л; выход фермента 4500 ед,/л 20 П р и м е р 4. Культивирование Ятг.1 ачепдц 1 ае ВКМ АД проводят в круглых колбах на 3 л с 0,5 л среды на качалке с 190 об,/мин. Посевной материал готовят в колбах Эрленмейерана 250 мл с 70 мл среды, при посеве используют 14 О (об./об,) 24-часовой культуры. Применяют среду следующего состава, г/л: крахмал растворимый 5,0; КгРО 4 1,0; (КН 4)гЯОа 1,0; СаСОз 2,0; белково-витаминный концентрат 2,0; рН 6,9, Холестерин вносят в 16-часовую культуру в 30 количестве 0,005и выращивание продолжают до 22 ч, Мицелий отделяют ка центрифуге при 5000 об./мин, промывают и 35 определяют ферментативную активность Холестериноксидазная активность мицелия составляет 420 ед./г; урожай сухого мицелия 7,0 г/л; выход фермента 2970 ед,/л. П р и м е р 5. Культивирование Ятг,ачепдШае ВКМ АД проводят в условиях, описанных в примере 1, используя среду следующего состава, г/л; крахмал нераство 40 римый 8,0; КгНР 041,0;(МН 4)гЯ 042,0; СаСОз 2,0; белково-витаминный концентрат 4,0; дазная активкость мицелия составляет 400 ед,/г; урожай сухого мицелия 8,5 г/л; выход фермента 3400 ед./г.Изобретение позволяет предотвратить быструю инактивацию фермента и повысить его выход в 2 - 3 раза.Формула изобретения Способ получения холестериноксидазы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента Ятгер 1 овусев ачепоЫае ВКПМ Яна питательной среде, содержащей источники углерода и азота, углекислый кальций, белково-витаминный 50 55 45 рН 6,9, Холестерин вносят в 15-часовуюкультуру в количестве О,ООЗО/ и выращивание продолжают до 22 ч, Холестеринокси"1678831 Составитель Е.ВоробьеваТехред М.Моргентал Корректор Н,Король Редактор Н.Яцола Заказ 3183 Тираж 361 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 концентрат и воду, с последующим выделением фермента из клеток, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повМшения выхода холестериноксидазы и стабилизации холестериноксидазной активности, в качестве 5 источника углерода в питательной среде используют крахмал, в качестве источника азота - сульфат аммония, дополнительно в среду вносят двузамещенный фосфат калия при следующем соотношении компонентов, г/л: крахмал 5 - 10; углекислый кальций 1 - 3; сульфат аммония 1-3; двузамещенный фосфат калия 0,5-1,5; белково-витаминный концентрат 2-5; вода до 1 л, при этом в логарифмической фазе роста вводят холестерин в количестве 0,02-0,05 г/л,