Штамм бактерий bacillus alvei продуцент рестриктазы в 1

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК Н ЛЬСТВУ КЗЧ 40 в не гид оГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ,ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР САНИЕ ИЗО К АВТОРСКОМУ СВ(71) Институт биологической и медицинскойхимии АМН СССР и Институт биохимии ифизиологии микроорганизмов АН СССР,53) 577.15 ,088.8)56) Опдегаз Т.Й., Огеепоцд 1., ЯсЫ(П(гаос1., ВоЬегтз В.,1. Тччо пеа гезтг 1 сс 1 опап(опасеазез 1 гоп Рготецз ч(11 даг 1 з, - Нос,АсМз Вез, 1981, ч,9, р.4525-4536.54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ВАСИ ШЯ АЫЕ -ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ВАМ 157) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практикенаучно-исследовательской работы в молекулярной биологии и генетической инженеИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в практике научно-исследовательской работы, в молекулярной биологии и генетической инженерии.Цель изобретения - выявление штамма ВасП 1 оз а 1 че 1, обладающего более высоким выходом рестриктазы.Штамм - продуцент ВасИ 1 цз а 1 че 1 675 выращивают на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.Рестриктаза Вач 1 - изошиэомер рестриктазы Рчо 1, узнает участок нуклеотидной последовательности ДНК САОСТО и расщепляет ДН К бактериофага А в 15 участ 678833 А 1(51)5 С 12 1 ч 9/14, 1/2 рии. Целью изобретения является выявление штамма ВасИцз аче 1, обладающего более высоким выходом рестриказы Вач 1. Штамм - продуцент ВасПцз аче ВКМ В выращивают на питательной среде, содержащей бульон Хоттингера, в условиях аэрации, целевой. продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса штамма ВасИ 1 из а 1 че 1 675 содержит рестриктазу Вач 1, узнающую и расщепляющую нуклеотидную последовательность ДНК САО СТО в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах, Для иэошиэомера Вач в рестриктаэы Рчв И выход очищенного фермента 370 ед,на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного фермента Вач 1 составляет 2,0 - 2,4 х 10 ед, активности на 1 г сырой3биомассы, что в 5 - 6 раз превышает известного Рч(1 И (370 ед). ках, ДНК аденовируса 2 в 24, ДНтрех, плазмиду рВВ 322 в одном и р лиэует ДН К ИХ 74.Поиск штамма - продуцента проводили с помощью разработанного экспресс-метода тестирования активности рестриктаз в толуольных экстрактах иэ микробных клеток с последующим электрофорезом в агароэном геле продуктов расщепления ДНК.Штамм ВасИ 1 цз а 1 че 675 получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранится под М ВКМ- МС 1 В 8212 и не является идентичным штамму ВасПцз аче 1 АТСС 6348, продуценту известной рестриктазы Вач 1,Характеристика штамма.Морфологические свойства. Палочки размером 0,5-0,8 х 2 - 3 мкм расположеныпоодиночке и парами, споры, Грам-положительны (признак непостоянный, варьируетГр-Гр), Клетки подвижны (признак варьирует),Культурально-биохимические свойства, 5На скошенном агаре - слабый нежный налет. Колонии на МПА очень мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями, Намясо-пептониом бульоне и бульоне Хоттиигера - равномерное помутнение, сероватая 10нежная пленка, Отношение к кислороду -аэроб, Утилизация углеводов - на глюкозе,лактозе, сахарозе образует кислоту, Лакму, совое молоко - свертывание, пептонизация,Индол - не образует. Желатина уколом - 15медленное, кратерообраэное разжижение.Чувствительность к антибиотикам,Культура обладает множественной резистентностью к антибиотикам. Резистентна кпенициллину, стрептомицину, канамицииу, 20полимиксину, неомицииу, метициклину, нистатину, ампициллину, Чувствительна к тетрациклину, левомицетину, эритромицину,олеаидомицину, карбеиициллину, линкомицину, геитамицину, оксациллииу. 25Оптимальные условия выращивания ихранения (среда, рН, температура, срок пересева). Кульура хорошо растет на твердыхи жидких питательных полноценных средах;мясо-пептонном агаре, бульоне Хоттингера, 30среде 1 В,На бульоне Хоттиигера за 4-5 ч ростдостигает А 6-о = 1,2 - 1,4, Выход биомассы6 - 8 г/л, При выращивании на средеВ накопление биомассы ниже 4 - 5 г/л. 35Оптимальные для образования рестриктазы Вач 675 условия - культивирование иа среде Хоттингера в течение 4 - 5 ч додостижения конца логарифмической фазыроста, 40На среде "рыбный экстракт" культурарастет медленно, а активность рестриктазыв биомассе значительно ниже, чем при культивировании на средах Хоттингера иВ.Оптимальная температура роста 37 ОС, 45но растет и при 40-45 С,Рабочие культуры пересевают иа бульон Хоттиигера один раз в 7 - 10 дн, Храняткультуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизированном состоянии в ампулах,Культура непатогенна для мышей.Существенным фактором культивирования является аэрация, В анаэробных условиях выход рестриктазы Вачснижается, 55Инкубационная смесь для определенияактивности рестриктазы Вач 6751 обьемом25 - 50 мкм содержит 0,01 М трис-НС 1, рН7,5, 0,01 МсС 2, 0,001 М дитиотреитола, 0,05М МаС 1, 1 мкг ДНК фага Я и 1 - 20 мкл фермента. Инкубируюг при 37 С в течение 60мин, Продукты расщепления ДНК рестриктаэой определяют электрафорезом инкубационной смеси в геле агарозы споследующим прокрашиванием геля бромидом этидия, За единицу активности фермента принимают то минимальноеколичество (в мкл), которое необходимо дляполного расщепления 1 мкг ДНК фага Х при37 С за 1 ч иикубации в стандартных условиях инкубационной смеси.Выделение рестриктазы проводят фракционированием и хроматографией на колонках. Полученный фермент проявляетактивность в присутствии МцС 2 в концентрации 5-410 мМ при значении рН 7,5 - 8,3 итемпературе 30 С. Добавление в инкубационную среду КС 1 (20-30 мМ) стимулируетактивность фермента, в более высокой концентрации (100 мМ) КС 1 ингибирует рестриктазную активность,П р и м е р 1. Культуру Васц з а 1 че 1 В КМВ - 675 предварительно адаптируют на основной питательной среде (бульон Хоттингера), содержащей в 1 л 250 мл основногоперевара Хоттингера, 10 г 1 чаС 1, 1 г К 2 НР 04и до 1 л воды, Инокулят для ферментераготовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1;10 иразмножают в условиях аэрации.Выращивание культуры проводят последобавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды при 37 С вусловиях аэрации (1 л воздуха на 1 л питательной среды), рН среды 7,6, Во время фермеитации рН культуральной жидкостиподдерживают в интервале 7,4-7,6, Выращивание продолжают до достижения концалогарифмической фазы роста, Выход сыройбиомассы составляет 8 г/л культуральнойжидкости, Содержание рестриктазы Вач 6х 10 з ед,/г биомассы.Определение активности ферментапроводят во фракциях градиента после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе (ОЕ,"Ватман" ) экстрактов из обработанных ультразвуком клеток с последующим электрофорезом в агарозном геле продуктоврасщепления ДНКВыделение эидонуклеазы рестрикцииВач 6751,10 г биомассы Вас 111 цз а 1 че 675 суспендируют в буферном растворе и клетки разрушают ультразвуком при 2-4 С. Послеудаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток фермент фракционируют в двухфазной системе полиэтиленгликоль / декстран. Обогащенную рестриктазой верхнюю фазу хроматографируют вкалий-фосфатном буфере в градиенте КС 1 на1678833 Составитель И,ПриваловаТехред М.Моргентал Корректор Н.Король Редактор Н,Яцола Заказ 3183 Тираж 362 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 колонке с ДЭАЭ-целлюлозой (О Е - 52, "Ватман"), затем на колонке с голубой сефарозой.Получают 2,4 х 10 ед. активности рестриктазы в 4,0 мл глицеринового буфера, В ыходз очищенного препарата фермента 2,4 х 10 ед. активности на 1 г сырого веса биомассы, Препарат рестриктазы Вач 675стабильно сохраняет активность в течение не менее 6 - 9 мес. Фермент пригоден для картирования ДНК и генно-инженерных работ.П р и м е р 2. Культивирование штамма Васцв аче 675 проводят аналогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют средуВ, которая содержит в 1 л 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г МаС и до 1 л воды.Выход биомассы 5 г/л культуральной жидкости, Содержание рестриктаэы в биомассе 5 х 10 ед,/г биомассы. После проведения очистки фермента, выход рестриктаэыВач 675составил 2,0 х 10 ед,/г биомассы.3Таким образом, биомассы штаммаВасцз аче 675 содержит рестриктаэу Вач5 , узнающую и расщепляющую нуклеотидную.последовательность ДНК САС ФСТ 6, вколичествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах.Содержание рестриктазы Вачв био 10 массе 5 - 6 х 10 ед. на 1 г сырой биомассы,зДля изошиэомера Ван- рестриктаэы Рчцсодержание фермента ниже, Выход очищенного фермента Вачсоставляет 2,02,4 х 10 ед, активности на 1 г сырой15 биомассы, выход очищенной рестриктазыРчц- 370 ед. на 1 г биомассы. РестриктазаВачне содержит примесей неспецифических эндонуклеаэ и экзонуклеаэ,20 Формула изобретения Штамм бактерий Васиэ аче ВКМ В - продуцент рестриктазы Вач ,