Штамм вуд -2 n 203-продуцент амилолитических ферментов, используемых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта и способ получения амилолитических ферментов для осахаривания

(71) Всесоюзный научно-исследователский институт продуктов брожения"Пищевая промышленность", 1979,2. Авторское свидетельство СССРВ 753897, клС 12 Н 15/00, 1978.3. Патент США Кр 3988204,кл. 195-15, опублик. 1976.4. Авторское свидетельство СССРпо заявке йр 3345897,кл. С 12 Б 9/34, 19815. Авторское свиде о СССРВ 800185, кл. С 12 Р 1979.(54) ШТАММ АБРЕКСПДЛБ АЧАМОК 1 ВУДТ-.2 Р Р 203 -, ПРОДУЦЕНТ АМИЛОЛИТИЧЕКИХ ФЕРМЕНТОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ КРАХМАЛСОДЕРЖАЩЕГО,СЫРЬЯПРИ ПРОИЗВОДСТВЕ СПИРТА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВДЛЯ ОСАХАРИВАНИЯ(57) 1. Штамм Азрегдх 110 з ачашогхВУД Т(коллекция Музея промьппленных кольтур микроорганизмов ВНИ"Генетика", коллекционный В У 2продуцент амилолитических фермеиспользуемых для осахаривания кмалсодержащего сырья при произвве спирта. 2. Способ получения амилолитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающий выращивание посевного материала продуцентаАзрег 8111 ы ачашог, приготовлениепроизводственной питательной средыпутем гидролиза кукурузной муки солодом или бактериальной сб-амилазой,разваривание, вакуум-охлаждение; посев культуры продуцента, ферментацию,а также введение диаммонийфосфатадвумя дозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевным материалом с последующей стерилизацией и повторно впроцессе фермеитеции, о т л и ч е ю- ррищ и й с я тем, что, с целью сокраще"ния сроков культивирования продуцен"та, повышения активности ферментови получения наряду с амилолитическими ферментами целлюлозы и протеазы,необходимых для осахаривания при про-,изводстве спирта, в качестве продуцента используют штамм Азрегя 111 изачашог 1 ВУД Тйр Г 203, а в питательную среду двумя дозами в соотно"шении .3:1 вводят в качестве стабили"затора рН углекислый кальций или до-рломитовую муку в количестве от 1 до10 Х, причем большую дозу вносят настадии получения посевного материалав инокулятор, а меньшую - на стадииферментации п течении 20-24 ч отначала процес овместно с диаммонийфосфатом,3. Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что количество по-:севного материала, вводимого на ферментацию, устанавливают равным 3-103.1094346 Изобретение относится к микробиологической и спиртовой промышленности и касается нового штамма-продуцента амилолитических ферментов и способа получения амилолитических ферментов для осахаривания.Известны штаммы грибов из родаАзрегд 11 цз - продуценты амилолитических ферментов Я .Из известных штаммов наиболее 1 Облизким по технической сущности идостигаемому эффекту является термостабильный штамм Азрегяд 11 аз аюашог 1 ТУ 464 - продуцент амилолитических ферментов 2,5Существенным недостатком известного штамма является невысокая активность глюкоамилазы - 45-50 ед/мл иотсутствие других ферментов, необходимых для осахаривания. 20Известен способ получения амилолитических ферментов, используемыхдля осахаривания крахмалсодержащегосырья при производстве спирта, предусматривающий выращивание посевного 25материала, приготовление питательнойсреды, культивирование продуцентовна питательной среде, содержащей гидролизат кукурузной муки 3,Недостатком этого способа являет- ЗОся длительность процесса полученияферментов.Известен также способ культивирования Азрегяд 11 цз аюашогд - 466 напитательной среде, содержащей гидро- З 5лизованную солодом или альфа-амилазой кукурузную муку и в качестве стабилизатора рН доломитовую муку в количестве 1,5-3,0 Е. Активность амилолитических ферментов через 120-130 ч 40Ферментации соответственно глюкоамилазы - 160 ед/мл, а М,= амилазы -45 ед/мл. Способ обеспечивает выходспирта 65,5 дал/т усл. крахмала 14 .Недостатком способа является неспособность штамма-продуцента синтезировать комплекс ферментов, содержащий помимо амилолитических ферментовцеллюлазы и протеазы, необходимыедля эффективного осахаривания крах 50малсодержащего сырья при производстве спирта, а также неустойчивостьпродуцента к повышенным температурам. Из известных способов наиболее близким к изобретению по технической 55 сущности и достигаемому эффекту является способ получения амилолитических Ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающий выращивание продуцента Азрегц 111 цз ачашог.на.питательной среде, содержащейкрахмал, азотнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий,сернокислое железо н солодовыеростки, приготовление производственной питательной среды путемгидролиза кукурузной муки солодом или бактериальной с -амилазой,разваривание, вакуум-охлаждение, посев культуры продуцента, ферментациюи введение диаммонийфосфата двумядозами соответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией посевного материала с последующей стерилизацией и повторно - впроцессе ферментации 5 .Известный способ, хотя и обеспечивает получение препарата с высокойглюкоамнлазной активностью, однакосодержит лишь следы- амилазы (до4 ед/мо), что требует при осахаривании введения дополнительных источников с-амилазы,Целью изобретения в части штамма является получение термостабильного штамма - продуцента амилолитических Ферментов, продуцирующего комплекс ферментов, необходимых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта. Цель достигается тем, что в качестве продуцента амилолитическихФерментов используется термостабильный штамм Азрегя 111 цз аюашог 1 ВУДТ. Штамм зарегистрирован в коллекции Музея промышленных культур микроорганизмов ВНИИ"Генетика", коллекционный номер Р 203.Штамм Азрегдх 11 из аюашогь. ВУД Т Р Г 203 получен в результате двухступенчатой селекции исходного штаммаТ, На первом этапе конидии обрабатывали химическим мутагеном-этиленимином в концентрации 1:1000 в течение 1 ч с последующим рассевом насреду Чапека с высокой концентрациейкрахмала (6-87). На втором этапе применен метод поддерживающей селекциис целью выбора и сохранения наиболееактивного продуцента Азрегд 111 изаюашог 1 ВУД ТИ-Р 203,Диаметр колонии на 5 сут 20-24 мм,зона гидролиза крахмала 10-15 мм.Конидии круглые с шипами.346 4рации водородных ионов от 2,8-8,0. Аэроб. Не обладает токсическими свойствами.Для проверки ферментативной активности предлагаемого штамма ВУД Т Р 203 проводят опыты по глубинномукультивированию его в качалочныхколбах вместимостью 750 мп со 100 млпитательной среды на качалке, делающей 200-230, об/мин. 1094 Для биосинтеза глюкоамилазы использовали питательную среду саедующего состава, мас,Е:15 Крахмал картофельный 6,0МаЮ 5 0,91КН 2 РО 4 0,1КС 1 0,05ИКОВО 0,05 20 ГеБО 0,001Солодовые ростки 3,0Вода Остальное,Выращивание осуществляют в течение 72 ч при 35-40 С. Глюкоамилазнуюо25 активность определяли по ГОСТ 20264.4-74. Штамм синтезировал наряду сглюкоамилазой протеазу, амилазу,целлюлазу и липоксигеназу.Сравнение активностей предлагаемого штамма и прототипа приведены втабл, 1. культура хорошо ассимилирует аммонийные соли органических кислот, нитраты. Потребляет мочевину, аспарагин, пептон, казеин, аминокислоты.Температурный оптимум роста штам- З 0ма 35-40 С. Развивается при концент- о Таблица 1 Штамм-продуцент Активность, ед/мп Сх ПС ГлА Пр ототипАзр. аюашогхПредлагаемыйАзр. аюатогдР 203 50-52 О, 1-0,2 1,5-3,0 Т0,5-1,0 2-4 20-25 125-130 ВУД Т50 На среде с мальтозой характеристика колонии аналогична предыдущей. Диаметр колонии 25-27 мм, конидиеобразование менее плотное.На сахарозе - колония круглая, слабо скаладчатая, с обильным образованием конидий по всей поверхности. Центр колонии плоскйй, темно-коричневый с оливковым оттенком. В среду выделяется коричнево-красный пигмент.10 Размер колоний 18-20 мм.. На лактозе - колония круглая, плоская с очень слабым конидиеобразованием по всей поверхности колонии, Споры светло-коричневые. В среду выделяется слабо розовый пигмент. Размер колонии 10-15 мм.Отношение к источникам углерода:культура гидролизует крахмал, дикстрины, мальтозу,паннозу, иэомальтозу, сахарозу с образованием глюкозы. Потребляет без выделения газа глюкозу, маннит, сорбит, Слабо растет на лактозе и ксилозе.Отношение к источникам азота: Из табл 1 видно, что глюкоамилаз- ная активность предлагаемого штамма превышает активность прототипа на полусинтетической среде в 1,5-2 ра-за (60-1002). Кроме того, предлагае мый продуцент синтезирует другие.Ферменты:Ж -амилазу, протеазу, целлюлазу и липоксигеназу. Целью изобретения в части способа является сокращение сроков культивирования продуцента, повышение активности ферментов и получение наряду с амилолитическими ферментами целлюжзы и протеазы, необходимых для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта.Цель достигается тем, что при способе получения амилолитических ферментов для осахаривания крахмалсодержащего сырья при производстве спирта, предусматривающем выращивание посев ного материала продуцента Аяр, аюашог 1, приготовление производственной питательной среды путем гидролиза: кукурузной муки солодом или бактериальной О-амилазой, разваривание, вакуум-охлаждение, посев культуры - продуцента, ферментацию, а также введение диаммонийфосфата двумя дозамисоответственно в гидролизованную кукурузную муку перед инокуляцией по" 15 севным материалом с последующей стерилизацией и повторно - в процессе ферментации, в качестве продуцента используют штамм Азрегф 11 цз ашашогь ВУД Т 203, а в питательную сре ду двумя дозами в соотношении 3:1 вводят в качестве стабилизатора рН углекислый кальций или доломитовую муку в количестве от 1 до 10%, причем большую. дозу вносят на стадии получения посевного материала в инокулятор, а меньшую - на стадии ферментации по истечении 20-24 ч от начала процесса совместно с диаммонийфосфатом. 30 Согласно изобретению количество посевного материала, вводимого на ферментацию, устанавливают равным 3-107.Предлагаемый способ получения ами- З 5 лолитических ферментных препаратов для осахаривания крахмалсодержащего сырья заключается в следующем. Посевной материал в колбах готовят на жид 40 кой питательной среде, содержащеи картофельный крахмал, азотнокислый натрий, Фосфорнокислый калий, серно" кислый магний, хлористый калий, сернокислое железо и солодовые ростки. Выращивание осуществляют в течение45 20-24 ч при 28-30 С. ПодготовленнуюОжидкую посевную культуру передают на стадию культивирования в инокулятор, Для культивирования посевной культуры в инокуляторе используется0 среда следующего состава, мас.Ж:Мука 5-8Кукурузный экстракт 1Стабилизатор рН 0,75-7,5Для ферментации в производствен ных условиях жидкую питательную сре- . ду готовят следующим образом. Кукурузную муку смешивают с водой в, соотношении 1:3, разваривают при 148154 С в течение 30-50 мин охлаждаютОо ) до 60, С и осахаривают солодовым молоком или бактериальной М -амилазой втечение 30-40 мин при 58-60 С, ЗатемОвводят диаммонийфосфат в количестве0,2 мас.7, стерилизуют при 120-125 Св течение 30-40 мин и охлаждают доо35-40 С. После охлаждения в подготовленную ю питательную среду вводят посевной материал из инокулятора. Продолжительность кулитивирования посевного материала в инокуляторе составляет 20-24 ч при 28-30 С, непрео рывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом. На стадию фермента. -ции передают посевной материал в количестве 3-10% к объему среды.Ферментацию осуществляют при 35 о40 С, непрерывном перемешивании и аэрации стерильным воздухом (30- 40 м/м среды в 1 ч) . Через 20-24 чот начала процесса ферментации в среду вводят оставшуюся часть диам,монийфосфата (0,1 мас.% к объему среды) совместно с оставшейся частью стабилизатора рН (0,25-2,57). Продолжительность Ферментации 120-130 ч. Готовая культура имеет следующуюактивность: глюкоамнлаза 125 Ф130 ед/мл, -амилаза 20-25 едмл,протеаза 0,5-1,0 ед/мл целлюлаза 2-4 ед/мл. Выход спирта 65,8 дал/тусловного крахмала.П р и м е р 1. Посевной материал Азрег 8111 пз ачашог ВУД Т Р 203 в колбах выращивают на питательной" среде следующего состава, мас,%:Крахмал картофельный 6,0ЮаИО 0,910,1КС 1 0,05М 8804 0,05Ре 804 0,01Солодовые ростки .3,0Вода ОстальноерН устанавливают равным 4,8. Выращивание осуществляют в течение 20 ч при 30 С.Для культивирования в инокуляторе питательная среда содержит следующие компоненты мас.%:Кукурузная мука 6,0Кукурузный экстракт 1Углекислый кальций 0,75Производственную среду готовят следующим образом. Кукурузную муку смешивают с водой при 45 С в соотношении 1:3, полученную массу разваривают при 148 С в течение 30 мин,оРазваренную массу охлаждают до 60 С;О осахаривают солодовым молоком в течение 30 мин, вводят 0,2 мас.ди аммонийфосфата, стерилизуют при 120 С в течение 30 мин, охлаждают доо35 С и вводят посевной материал из инокулятора в количестве 10 . Ферменатацию проводят при 35 С, давлении10 0,03 ИПа и аэрации стерильным воздухом в количестве 30-40 м 3/мсреды в 1 ч при непрерывном перемешивании турбинной мешалкой с 150 об/мин.Через 24 ч после начала фермента ции в среду вводят вновь диаммонийфосфат в количестве 0,1 мас.7 и углекислый кальций СаСО вколичестве 0,28 мас. . Продолжительность ферментации составляет 130 ч. Активность 20 ферментов составляет: глюкоамилаза 120 ед/мл, Ж -амилаза 20 ед/мл, протеаза 1 ед/мп, целлюлаза 2 ед/мл. П р и м е р 2. Посевной материал готовят аналогично примеру 1 и производственную питательную среду .готовят аналогично примеру 1. Только на стадии приготовления посевного материала вводят стабилизатор рН. - доломито 30 ,вую муку в количестве 7,5 мас, -и диаммонийфосфат - 0,3%. Гидролиз.1 (осахаривание) кукурузной муки проводят бактериальной М-амилазой. Концентрацию сусла устанавливают 18 мас.% и проводят ферментацию. Ферментациюосуществляют на производственной среде следующего состава, мас.%:Кукурузная мука 25Вода Остальное.40По истечении 24 ч от начала процесса ферментации в среду вводят 0,27 диаммонийфосфата и 2,5% доломитовой муки. Ферментацию ведут в течение 120 ч. Культура имеет следующую активность (ед/мп):06 -амилаза 30, глюкоамилаза 130, протеза 0,5, целлюлаза 1,2.П р и м е р 3. Посевной материал Аврегя 111 пз аюашогд ВУД ТУ Р 203 50 в колбах выращивают на питательной среде следующего состава, мас.%:Крахмал картофельный 6,0ВаНО 0,91КНР 04 0,1 55КС 1 0,05М 880 0,05РеЯО. 0,01 СоЛодовые ростки 3,0 Вода Остальное.рН устанавливают равным 4,8. Выращивание осуществляют в течение 20 ч при 30 с,Для культивирования в инокуляторе питательная среда содержит следующие компоненты, мас.7:Кукурузная мука 6,0 Кукурузный экстракт 1,0 Углекислый кальций 3,75 Производственную среду готовят аналогично примеру 1 и вводят посевной материал из инокулятора в количестве б . Ферментацию проводят при .35 С, давлении 0,03 ИПа и аэрации стерильным воздухом в количестве 30- 40 м/м среды в,1 ч при непрерывном перемешивании турбинной мешалкой с 150 об/мин. Через 24 ч после начала фермента-, ции в среду вводят вновь диаммонийфосфат в количестве 0,1 мас. , углекислый кальций СаСО в количестве 1;25 мас.%. Продолжительность ферментации составляет 130 ч. Активность Ферментов составляет: глюкоамилаза . 126 ед/мл, М,-амилаза 22 ед/мп, протеаза 0,8 ед/мп, целлюлаза 3 ед/мл. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала.П р и м е р 4. Посевной материал и производственную питательную среду готовят аналогично примеру 1, только вводят в количестве 37. На стадии приготовления посевного материала вводят стабилизатор рН - доломитовую муку 5,257 и диаммонийфосфат 0,57. Гидролиз (.осахаривание) кукурузной муки проводят бактериальной М-амилазой. Концентрацию сусла устанавливают 18 мас.и проводят ферментацию,Ферментацию осуществляют на производственной среде следующего состава, мас.%: кукурузная мука 25, вода - остяльнор. По истечение 24 ч от начала процесса ферментации в среду вводят 0,27 диаммонийфосфата и 1,75% доломитовой муки. Ферментацию ведутв течение 120 ч, Культура имеет следующую активность, (ед/мл): М-амилаза 28, глюкоамилаза 128, протеаза 0,5, целлюлаэа 1,6. Выход спирта 65,8 дал/т условного крахмала.П р и м е. р 5. Способ осуществлякф,аналогично примеру 1, но стабилизатор вводят в соответствии со спосо9 ,1094346 10 и цеблюлазы не обнаруживает - СЯПреимущества способа по сравнению с прототипом представлены в табл.2. Та блица 2 Основные показатели Прототип штамм ТПр едлага емыйштамм Т50"52 2-4 0,5-1,0 То же 45:1 6:1 144 Время выращивания, ч ти амилолитических ферментов и получение наряду с амнлолитическими ферментами целлюлазы и протеазы. Редактор О.Юркова Техред О.Ващишииа Корректор О.Билак Заказ 122/3 Тираж 525 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5г Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 бом-прототипом - один раз в производственную среду перед стерилизацией в количестве 37. Активность глюкоамилазы 100 ед/мп. Активность протеазы5 Глюкоамилазная активность, ед/мл Амилолитическая активность, ед/мл Активность целлюлазы, ед/мпАктивность протеазы, ед/млСоотношение ферментов по амилазам Таким образом, изобретение обеспечивает сокращение сроков культивирования продуцента, повышение активнос 1,5-3 Следы 125-130 20-25