Способ получения s-аденозилметиониновых (сам) солей

ССЮОЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН Сй(:Яс) цЕТЕНИ ИЗ ИЛМЕТИроцик полу- олей Нс 2 ил ным ы- ре ти) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР Г 10 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИИ(56) БгашепСхпо 1 С., Регго 1 С,апд Кхеп 1 е М.С. РгоСес 1 дче го 1 е оГБ-адепогу 1-Ь-МеЬ.опдпе а 8 ахпз асеевашпорЬдп дпдпсед шогСа 11 су апд Ьераойох 1 сСу дп пЯсе. - ВдосЬешса 1РЬаппасо 1 оду, 1979, ч. 22, р. 35673571Патент США В 2969353,кл, С 07 Н 19/04, опублик. 1961.Заявка ФРГ У 1803978,кл. С 07 Н 19/04, опублик. 1970.Авторское свидетельство СССРИ 676169, кл, С 07 Н 19/04, 1975.(57) Изобретение касается гетлических веществ, в частностичения 8-аденозилметиониновыхминеральных сильных кислот с(количество молей последних 4или 6), обладающих защитным ивающим действием при гепатичезии 16 04 С 07 Н 19/16, Аб К 31 стеатозе. Цель - создание нового способа синтеза новых солей указанного класса. Процесс ведут из концентрированного водного раствора технической Б-аденозилметиониновой соли, рН которого доводят до 6-7, затем очищают пропусканием через слабокислотную . ионообменную смолу, элюируют разбавленным раствором (0,1 н.) сильной минеральной кислоты с последующим титрованием до строго стехиометрического количества к присутствующей Б-аденознлметиониновой соли концентрированной неорганической кислоты. В другом случае титрование ведут сильно основной ионообменной смолой в ОН-форме с последующими упариванием злюата до достижения концентрации целевой соли 50-100 г/л и лиофилизированием преимущественно в присутствии инертного вещества (лучше маннита или порошкообразной кремниевой кислоты). Новые соли обладают лучшей активностью, чем соответствующий дисульфат ди-пара-толуолсульфонат Я-аденозилметионина, и наряду с гепатозащитдействием оказывает еще антидепссантную и противоревматоидную аквность. 1 з.п. ф-лы, 8 табл.18 1433 41 бТаблица 8 Смертность животных, 7 Соль для защиты САМ ф 2 Н БОСАМ.2,5 Н,80,САМ 3 М,80,САМф 4 НС 1САМ 5 НС 1САМ ебНС 1 6,5 7 3з САМ-Дисульфат-дн-и-толуол-сульфонат структурныйаналог) Контрольная группа 43,0 Составитель Г. КонноваТехред Л.Олийнык Корректор Л Пилипенко Редактор Е. Папп Заказ 5471/59 Тираж 348 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб, д, 4/5 Производственно-полиграФическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 41433416 солей общей формулы Изобретение относится к способу получения Б-аденозилметиониновых (САМ)15где Х - кислотный эквивалент сильнойминеральной кислоты с рН меньше 2,.5,и равно 4, 5 или 6, обладающих защитным и рассасывающим действием при гепатическом стеатозе20Цель изобретения - разработкаспособа синтеза новых солей Б-аденозилметионина, обладающих большей стаобильностью при 45 С по сравнению соными аналогами - известнымисолями САМ пХ, где Х - кислотный эквивалент сильной кислоты, а и = 1, 2и 3, а также большей активностью вотношении защиты печени по сравнениюс ближайшим структурным аналогом дисульфатом-ди-и-толуолсульфонатомБ-аденоэилметионина,П р и м е р 1. 110 л этилацетатаи 110 л воды добавляют при температу"ре окружающей среды к 900 кг дрожжей, 5обогащенных САМ (6,88 г/кг) в соответствии с методом Нленка.После энергичного перемешиванияв течение 0,5 ч добавляют 500 л )0,35 н. серной кислоты и продолжают 401 перемешивание в течение 1,5 чСмесь фильтруют и остаток промывают водой, получая 1400 л раствора,содержащего 4,40 г/л САМ, что соответствует 99,57. от присутствующего висходном материале.При перемешивании добавляют 23 кгпикролоновой кислоты. Реакционную массу оставляют на ночь и затем осадокотделяют центрифугированием и промывают водой.Осадок при перемешивании растворяют при окружающей температуре в 62 л1 н, раствора серной кислоты в метаноле. Затем после отфильтровыванияследов нерастворенного вещества краствору добавляют 500 л ацетона.После полной седиментации осадкадекантируют всплывший раствор, и нерастворимый осадок промывают малым количеством ацетона. Осадок растворяют в 800 л дистиллированной воды, добавляют 2 кг обесцвеченного древесного угля и смесь фильтруют.Готовят колонку с 200 л Амберлита 1 КС 50 в Н форме и тщательно промывают дистиллированной водой.К ранее полученному водному раствору добавляют 4,8 кг ледяной уксусной кислоты при перемешивании и затем добавляют 2 н. едкий натр вплоть до получения рН 6,5.Раствор пропускают через колонку со смолой со скоростью 400 л/ч, которую поддерживают постоянной в течение всего процесса, Затем через колонку пропускают последовательно 200 л дистиллированной воды, 1600 л 0,1 М уксусной кислоты и затем 200 л дистиллированной воды.САМ элюируют 400 л 0,1 н, серной кислоты. Таким образом полученный элю- Рат содержит примерно 4 кг САМ и его концентрируют в вакууме до 60 л,Добавляют 0,5 кг древесного угля, и смесь фильтруют. Раствор титруют.Добавляют концентрированной серной кислоты до получения молярного отношения серной кислоты к САМ, равного 2,5: 1. Раствор затем лиофилизируют.Получают 6,5 кг продукта, имеющего следующий состав: САМ 617; Н БО 4.37,57 НО 1,5 Е. Соль имеет кристаллический вид и растворима в воде в количестве, большем 207., давая при этом бесцветный раствор. Однако соль нерастворима в обычных органических растворителях.Методом тонкослойной хроматографии установлено, что продукт не содержит каких-либо примесей.з 143341В табл. 1 приведены данные анализа, которые согласуются с элементнымсоставом для соединения формулы С НН О Б5 НС 1,Новое соединение также идентифифицировано энзиматическим методом,описанным в примере 1,Осуществляя процесс как в примере 1, возможно получить продукт, имеющий различную величину солеобразования, и в частности, следующие соли:САМ 4 НС 1 0,4 Н О; САМ 6 НС 1 ф 0,7 Н О.Аналитические данные для солейприведены в табл. 1.П р и и е р 3. Повторен процесс,описанный в примере 1, с той разницей, что перед лиофилизацией добавляют к раствору 4,75 кг апирогенногоманнита. Затем, раствор лиофилизируютобычным способом.Добавление маннита позволяет получить продукт с остаточным содержанием влаги 0,17.Полученный таким образом продуктпригоден для превращения в инъектиру-емую фармацевтическую форму.П р и м е р 4. Повторена процедура примера 1, Перед лиофилизациейдобавляют 4 кг Аэросиля (пыпевиднойкремниевой кислоты). Полученную коллоидальную суспензию лиофилизируют.Добавление Аэросиля позволяет получить продукт с остаточным содержа 1нием влаги 0,2 Ж. Этот продукт пригоден для превращения в таблетки дляперорального применения П р и м е р 5. Повторена процедура примера 2 с той разницей, что . САМ элюируют 0,1 М раствором фосфор" С Н В О 2,5 Н БО 0,5 Н О. Новое соединение также идентифицировано энзиматическим методом, основанным на энзиматическом метилирова нии никотинамида и гуанидинуксусной кислоты с помощью САМ.При повторении процесса аналогичным образом, но с добавлением перед лиофилизацией такого количества серной кислоты, чтобы поднять молярное . отношение к САМ до 3:1, получают САМ ЗН БО 0,7 НО. Данные элементного анализа приведены в табл. 1.Понижая молярное отношение Н БО/ щ /САМ перед лиофилизацией до 2:1, получают соль САМ 2 Н БО 0,4 Н О. Данные элементного анализа приведены в . табл. 1.П р и м е р 2. 11,5 кг пикроло новой кислоты, растворенной в 100 л изобутанола, добавляют к 700 л раствора, полученного лизированием дрожжевых клеток, используя те же исходные материал и способ, что и в приме- З 0 ре 1.После выдержки в течение ночи образующийся осадок отделяют центрифугированием. Осадок растворяют при окружающей температуре при перемешивании в 31 л однонормального раствора серной кислоты в этаноле.После отфильтровывания малых количеств нерастворенного вещества к раствору добавляют 250 л серного эфира. Смесь выдерживают, фильтруют, и твердый отфильтрованный остаток промывают малым количеством воды. Твердый остаток сушат в вакууме.Твердое вещество растворяют в 400 л воды, добавляют 1 кг обесцвеченного древесного угля, и смесь фильтруют. Добавляют ледяную уксусную кислоту, доводя рН до 6,5, и затем .раствор пропускают через колонку с Амберлитом 1 КС 50 аналогично тому, как это осуществляют в примере 1.САМ элюируют из колонки 200 л 0,1 н. соляной кислоты. Элюат концентрируют в вакууме до 30 л. Добав" ляют 0,25 кг активированного древесного угля и смесь фильтруют. Раствор титруют и добавляют концентрированной соляной кислоты в количестве,Ф достаточном для получения молярногоотношения НС 1/САМ равным 5:1. Раствор лиофилизируют,Получают 2,8 кг продукта, имеющего следующий состав: САМф 67,6 Х;НС 1 30,97; Н О 1,5%,Соль имеет кристаллический вид,и растворима в воде в количестве большем 203, давая при этом бесцветныйраствор. Соль слабо растворима в обыч"ных органических растворителях.Методом тонкослойной хроматографии показано, что соединение не содержит каких"либо примесей. Хроматографию проводят способом, аналогичньвпримеруДанные элементного анализа приведены в табл. 1 и согласуются с продуктом формулы1433416 10 5ной кислоты, а не О, 1 н. раствором соляной кислоты, как в примере 2,Лиофилиэации предшествовало добав" ление концентрированной Фосфорной кислоты в количестве, достаточном для получения молярного отношения кислоты к САМ, равным 5:1.Получено 4,26 кг продукта, имеющего следующий состав: САМ 44,4%; НРО 4 54,6%; НО 1%.Данные элементного анализа приве дены в табл. 1 и согласуются с сое, динением, имеющим формулу: 15ф 160 В 5 Н РОМетодом тонкослойной хроматогра-фии, аналогичной описанной в приме ,ре 1, показано, что продукт не содер , жит каких-либо примесей.Новое соединение также идентифици, ровано описанным в примере 1 энзима-тическим методом.Повторяя операции примера 1, мож но получить соединения, имеющие раз"личные степени солеобраэования, и вчастности соли САМ 4 НРО 4 0,4 Н О,САМ 5 НРО 4 0,7 Н О, данные элементного анализа для которых приведены в 30 табл. 1. Кислоты, которые используются дляполучения новых солей по предлагае"мому изобретению, имеют следующие значения рН: НС 1 - рК меньше 0,5; Н 04рК меньше 0,5 (первая стадия),рК = 1,92 (вторая стадия); НРО 4 -рК = 2,12 (1 стадия).Испытания на стабильность проведены на солях, полученных предлагаемым способом, выдерживанием продукта в термостатируемой печи при 45 Си определением процента остаточнойсоли в фиксированные моменты времени,Для сравнения эксперименты были повторены с известными САМ пНС 1 солями, вкоторых и = 1, 2 и 3, и е САМ пН 304,в которых и равно 0,5, 1 и 1,5.Табл. 2-5 иллюстрируют процент разложения соли в определенные моментывремени.В табл. 2 приводятся данные длясоли САМ пНС 1,В табл. 3 приводятся данные длясоли САМ пН ЯО, .55В табл. 4 приводятся данные длясоли САМ ф 1 5 НЯО 4 ПНС 1В табл. 5 приводятся данные длясоли САМ 2 НС 1 НБО 4 . Остаточный САМ-процент в указанные моменты времени определяют способом, описанным ниже, и который обеспечивает максимальную точность измерений за счет того, что позволяет полностью отделить САМ от всех возможных продуктов разложения.В связи с этим найдено, что используемый до настоящего времени способ, основанный на применении аналитической колонки ионообменной смолы Доуекс 50, не позволяет добиться полного отделения САМ от некоторых продуктов разложения, и, в частности, от метилтиоаденозина, что приводит к ошибке в оценке стабильности САМ, которая была предполагаемой.Предлагаемый способ определения, САМ основан на использовании жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД). Использованы следующие условия: колонка Партисил 10 БСХ - 2,5 " 250 мм, элюирующий растворитель 0,1 М муравьинокислый аммоний с рН 4, содержащий 20% метанола для ЖХВД, поток 1 мл/мин; время удерживания САМ примерно 400 с.Из данных табл. 2-5 следует, что САМ-соли обладают максимальной ста" бильностью в том случае, когда они содержат пять кислотных эквивалентов, Соли с четырьмя и шестью эквивалентами обладают достаточно хорошей стабильностью, в то время как более низкое число кислотных эквивалентов не имеет практического значения в силу значительной нестабильности получаемых солей.Также очевидно, что стабильность имеет одинаковый характер независимо от применяемой кислоты, при условии, что это есть кислота с рК меньше 2,5.Нельзя приготовить соли с кислотами, имеющими рК больше 2,5, содержащими 4-6 кислотных эквивалентов. Аналогичным способом также определена стабильность для солей, которые получают в присутствии лиофилиэирующего агента, указанного в примерах 3 и 4. Результаты приведены в табл, 6 и 7 (для солей САМ 5 НС 1 и САМ 2,5 Н ЯО 4 ). Отмечается резкое снижение содержания влаги при проведении лиофилизации в присутствии лиоФилизирующего агента и соответствующее повышение стабильности соли, получаемой таким путем.Испытания Фармакологических свойствсолей САМ 5 НС 1 и САМ 2,5 НБО показали высокую активность и их токсичность, не зависящую от аниона, связанного с САМ. Установлено, что активность новых солей существенно за+висит от способности САМ иона, выделяемого в организме, действующегокак донор метильных групп, как природное вещество с большим числомтрансметилазовых ферментов, которыекатализируют важнейшие реакции белкового, жирового и глюцидного обмена.Важность новых солей обуславливается тем, что они делают Б-аденозилметионин абсолютно стабильным приотемпературе вплоть до 45 С, тем самым позволяя полностью использоватьего трансметилирующую активность в 20человеческом организме без опасностиобразования токсичных продуктов разложения, которые отрицательно влияютна биологические процессы, активированные САМ+, 25Токсичность,Острую токсичность определяли намышах. Для обеих солей получены значения ЛД при пероральном приеме50больше 3 г/кг, при внутривенном введении - 1,1 г/кг.Переносимость и хроническую токсичность определяли на крысах породыВистар и Спрагью-Доули, давая им втечение 12 мес. в день по 20 мг/кг З 5продукта. После прекращения эксперимента не было обнаружено патологических изменений в различных органахи системах.На кроликах проведены тератогенные 40эксперименты. Не обнаружено никакоготератогенного действия или врожденных уродств у эмбрионов или утробного плода конечной стадии при введениисолей формулы (1) в дозах, в десятьраз превышающих максимальные терапевтические дозы.Внутривенное введение доз вплотьдо 200 мг/кг не вызывало у кроликов .никакого пирогенного проявления.Внутривенное введение 40 мг/кг у кроликов и крыс не приводило к изменениюдавления в сонной артерии, частотысокращения сердца или дыхания, ни кЮизменениям электрокардиограммы,Местная переносимость в случаевнутримышечных инъекций, даже послеповторения введения в течение 3060 дн, и в случае внутривенных инъекций в маргинальную вену внешнегоуха кролика была очень хорошей.Фармакологические свойства.Проведенная на крысах полная серияиспытаний показала, что новые солиФормулы (Е) оказывают очень значительное защитное и рассасывающее действие при гепатическом стеатозе, вызванном гиперлипидной-гиперпротеиновой диетой по Гандлеру, и стеатозе,вызванном острой алкогольной интоксикацией и другими токсическими веществами даже в том случае, когда вводится доза 10 мг/кг САМфПри экспериментальной гиперлипемии у крыс, например, вызванной Тритоном 8, новые соли демонстрируюточень значительную гиполипемическуюактивность, которая при используемыхдозировках (т,е. 10 мг/кг, выраженныхв САМ ) была намного выше, чем в случае других лекарственных препаратов,обладающих гиполипемической активностью,У цыплят, у которых вызван атеросклероз с помощью диеты, богатойхолестерином и фруктозой, парентеральное введение продуктов формулы (1)в дозах 10 мг/кг уменьшает холестеролемию и благоприятно изменяет поражения, которые обнаруживаются у контрольных птиц в отношении грудной ибрюшной аорт и малых сосудов основания мозга.Что касается фосфолипидного обмена, то было экспериментально установлено, что у крыс имеет место увеличение в тканях печени количества фосфатидилхопина при некомпенсированиомстеатозе. Был определен полный при-рост фосфатидилхолина при расходе альфапротеинов крови при экспериментальныхнарушениях, вызванных соотношениембета к альфа-липопротеинов.Все эти эксперименты отчетливосвидетельствуют о лечебном эффектеновых солей формулы (1) при нарушенияхжирового обмена.Дополнительной серией экспериментовна крысах было показано, что введениедоз 1 мг/кг вызывает накопление запаса гликогена в крови и мышцах, чтодемонстрируется как гистохимическими методами, так и количественными оп"ределениями. При экспериментальномдиабете, вызванном аллоксаном, коли"чество инсулина, которое требуетсяввести для возвращения к норме вели1433416 10 чины гликемии, значительно уменьшается путем введения 0,5 мг/кг САМЭти серии экспериментов отчетливо иллюстрируют положительное действие новых соединений формулы (1) на глю" видный обмен.Крыс, у которых экспериментально ыла вызвана гиподиспротеинемия, обабатывали количествами 10 мг/кг САМ. 1 О становлено, что указанный продукт озвращает все показатели протеинемии о нормальных значений в основном пу. ем увеличения содержания альбуминатаким образом иллюстрируя значитель 15 ую протеиновую анаболическую актив- ость.Соединения формулы (1) проявляют собенную активность в части защиты ечени. Защитная активность была оп О еделена при внутримышечном введении ри дозе 20 мг/кг соли САМ за 5 мин о внутрибрюшинной инъекции 710 мг/кг цетаминофена мыши.Полученные результаты приведены в 25 абл. 8.Результаты показывают существеное увеличение защиты по сравнению с войными солями дисульфат-ди-и-толуол сульфонатов,1. Способ получения Я-аденозилме 30 тиониновых (САМ) солей формулы О е Х ент сильно" ты с рН ме 45 о т о лиолизацию ю гд - кислотныи эквивал иминеральной кислоныне 2,5;п=4, 5 или 6,о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоконцентрированный водный раствор технической Я-аденозилметиониновой соли, полученной путем лиэиса дрожжевых клеток, обогащенных Я-аденозилметиониновой солью по методу Шленка,очищают, после доведения рН растворадо 6-7 пропусканием через слабо кислотную ионообменную смолу, элюируютразбавленным раствором кислоты НХ,например О, 1 н. раствором кислоты,титруют элюат и доводят количество Эти и другие аналогичные эксперименты иллюстрируют лечебное действиеновых продуктов формулы (1) при нарушениях протеиодного обмена.Суммируя сказанное, можно утверждать, что на основе описанных фармакологических экспериментов и многихдругих данных, которые показывают активность новых соединений формулы (1),изученных на всех уровнях организма человека, активность новых продуктовклинически установлена в гепатологиив случае,острой и хронической гепатической интоксикации, в нейрологии в.качестве антидепрессантов и в остеологии в случае ревматоидных артритов.Новые соли формулы (1) могут вводиться перорально или путем внутримышечных инъекций, или путем внутривенных инъекций, Другими приемлемымиформами применения являются свечи,жидкости для глазных введений, аэрозоли или формы для местного употребления,Формула изобретения кислоты до строго стехиометрической. пропорции по отношению к присутствующей Я-аденозилметиониновой соли прибавлением промышленного концентрированного раствора данной кислоты или титрованием этого раствора сильно основной ионообменной смолой в ОН-форме, упаривают элюат до достижения концентрации Я-аденозилметиониновой соли формулы 1 50-100 г/л и лиофилизируют его.2. Способ по п. 1 лича -щ и й с я тем, чт фи проводят в присутствии инертного вещества, предпочтительно маннита илипорошкообразной кремневой кислоты.13 1433416 Таблица 2 оОстаточ" Разложение при 45 С, %, после периода ная влаж- времени, дни ность, %бО 120 180 240 ЗбО3 100 0 10 100 100 100 ОО 0,5 О 0 0 100,5 17 3 Табл сле периода бО 120 10 0 10 О 100 О 8 О О 8 0 5 0 5 5 17 4 Табл и 45 С, %, послремени, дни ерио зложени ность, % 120 18 0 5 Остаточная влажность, % Остаточная влаж азложение пр врем(100 г САИ + 120 г Аэросиля) 0,2 Таблица 7 РазложеПроцесс лиофилизации Оста- точная влажность Без лиофилиэирующегоагента С маннитом (100 г САМ + + 120 г маннита) 0,1 С Аэросилем (100 г САМ+