Способ получения амида

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ- /ЯФ К ПАТЕНТУ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР 1(71) Нитто Кагаку Когио Кабусики Кайсяи Мицубиси Рэйон КО, Лтд (Л.)(72) Есиаки Сатох, Ясутака Накасима,Конехико Еномото, Ацуси фудзивараи Тосиаки Дой ( 1 Р)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИДА(57) Изобретение относится к биотех,нологии и может быть использовано в Изобретение относится к области биотехнологии и, может быть использовано в производстве амида микробиологическим способом.Цель изобретения - ускорение способа.П р и м е р 1. Промытые бактериальные клетки штамма И(СотупеЬасйегцв) получают аэробным культивированием штамма в среде (рН 7,2), состоящей иэ глюкозы 1 Ф, пептона 0,53, дрожжевого экстракта 0,3, экстракта сусла О, 34 и сульфата железа (111) 7 НО 0,05 ь, и промывкой полученных клеток Фосфатным буфером 0,05 М, Клетки диспергируют в фосфатном буфере к 0,05 М) рН 7,7 в темном месте с получением дисперсии клеток, имеющих(51) 4 С 12 Р 13/02 // С 12 Р 1/04 2 производстве амида микробиологическим способом. Цель изобретения - ускорение способа. Амид получают путем гидратации нитрильного соединения с помощью суспенэии грамположительных микроорганизмов при 0-20 С и рН среды 6-9, при этом суспензию предварительно облучают светом либо процесс гидратации ведут при освещении, либо осуществляют предварительную обработку светом суспенэии и производят таковую по ходу реакции. Для этого используют световую энергию в количестве не менее 1 10 2 мкЕ/г клеток в 1 с с длиной волны 200-800 нм. Реакцию гидратации проводят в сосуде, состоя- с щем по меньшей мере частично из матеЖриала, не пропускающего свет. 3 э,п. ф-лы, 6 табл,С: концентрацию 3,5 г высушенных клеток//л, Полученную суспенэию клеток делятна две части, Одну из них оставляютпри 0"С в течение 4 ч при облучениисветовой энергией 1,5 х 10мкЕ/г кл.в с, используя два комплекта люминесцентных ламп дневного света длинойволны 400-800 нм мощностью по 4 Вт,и этот образец обозначен в дальнейшемкак "выдержка на свету, Другую частьооставляют при С С в темном месте втечение 4 ч и этот образец в дальнейшем именуют как "выдержка в темноте",При использовании каждой иэ клеточной суспензии иэ акрилонитрила получают акриламид и изучают скоростьреакции с точки зрения количества получаемого таким путем акриламида.В случае бактерий, выдерживаемыхна свету, смесь 0,088 ч. клеток (здесьи ниже количество представляется массой сухих клеток), 1 ч. акрилонитрила и 98,9 12 ч, 005 М фосфатного буфера (рН 7,7) подвергают реагированиюпри 10 С в реакторе на 50 мл в течение 20 мин при перемешивании при описанных условиях, в дальнейшем эта реакция именуется ."реакция в условияхоблучения". В случае бактерий, выдерживаемых в темноте, эту реакцию повторяют, но не обеспечивают освещения,и в дальнейшем эта реакция именуется"реакцией в условиях темноты", Послезавершения реакции акриламид, содержащийся в каждом реакционном растворе, реакция в котором прекратилась,подвергают количественному анализус помощью газовой хроматографии, Врезультате количество акриламила (АА)на единицу количества бактериальных 2клеток составило 41,1 мкмоль АА/мгкл. мин в реакции в условиях облучения и бактерий, выдерживаемых на свету, и 0,34 мкмоль АА/мг кл. мин в реакции в условиях темноты и бактерий,выдерживаемых в темноте, Отношениемежду этими показателями (т.е. реакция в условиях облучения и бактерий,выдерживаемых на свету / реакция вусловиях темноты и бактерий, выдерживаемых в темноте) 121,В примерах значение 41,4 мкмоль/мгкл, мин, полученное для реакции в условиях облучения и бактерий, выдерживаемых на свету, согласно примеру 1указано относительным показателем100 Б. Таким образом, полученное впримере 1 значение для реакции вусловиях темноты и бактерий, выдерживаемых в темноте,0,83 Б.П р и м е р ы 2-13, Реакционный45раствор, имеющий состав, представленный в табл.1, получают с использованием бактериальных клеток, выдерживаемых на свету и отдельно - выдерживаемых в темноте, полученных в примере 1.Реакционный раствор подвергают реагированию по методике примера 1. Соответствующие амидные соединения, содержащиеся в растворе после завершения реакции, подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии с получением результатов,приведенных в табл,2,П р и м е р ы 14-18, Промытыебак 1 ериальные клетки получают приготовлением по методике примера 1 штаммов следующих родов: Бас 111 ив (СВЯ 494) в примере 14, ВасТег 1 дцщ (СВБ 496) в примере 15, Г 1 сгососсця (СВБ 497) в примере 16, Вгеч.Ьас егшщ(Г 1-775) в примере 18. Промытые клеткиобрабатывают по методике примера 1с получением клеток, выдерживаемыхна свету и соответственно в темноте,При использовании клеток в следующемсоставе акриламид получают из акрилонитрила и скорость реакции изучаютс 1 очки зрения количества получаемого таким путем акриламида,В случае штаммов, выдерживаемыхна свету, смесь 0,088 ч. клеток, 1 ч.акрилонитрила и 98,912 ч. 0,05 М фосФатного буфера )рН 7,7) подвергаютреагированию в течение 20 мин при10 С в условиях перемешивания (реакция в условиях облучения), В случаештаммов выдерживаемых в темноте, реакцию повторяют с тем отличием, чтоне производится освещения (реакцияв темноте). Акриламид, содержащийсяв каждом растворе после завершенияреакции, подвергают количественномуанализу с помощью газовой громатограФии с получением результатов, приведенных в табл.3 (сравнительные данныепо влиянию освещения на получениеамидов).П р и м е р ы 19-21 и сравнительные примеры 1 и 2, Промытые бактериальные клетки штамма Г 1-774 получаютаэробным культивированием штамма всреде (рН 7,2), содержащей глюкозу1, пептон 0,53, дрожжевой экстракт0,33, солодовый экстракт 0,3 и сульФат железа (111) 7 НО 0,054, и промыванием полученных клеток 0,05 мфосфатным буфером. Клетки диспергируют в 0,05 М Фосфатном буфере (рН 7,7)в темном месте с получением бактериального раствора концентрацией22,72 мг/мл.По 1 мл каждой клеточной суспензии загружают в стальные реакторына 50 мл и добавляют 24 мл 0,05 М ФосФатного буфера (рН 7,7). Результирующую клеточную суспензию облучают источником света, использованным в прио,мере 1 при О С в течение 1 или 20 ч,причем количество поступающей световой энергии регулируют показанным в15301табл.1 образом с помощью Фильтратаимеющего разные оптические участки ипомещенного в верхней части реактора.К каждой клеточной суспензии, об."лученной светом, добавляют 25 мл 5 Ф5раствора акрилонитрила (в 0,05 М растворе фосфатного буфера, рН 7,7).Смесь подвергают реагированию в течение 20 мин при тех же условиях светового облучения, Для сравнения реакциипроводят тем же путем, но с использованием клеточной суспензии без светового облучения или при облучении световой энергией, меньшей 1 х 10мкЕ/гкл, с.Количество акриламида, содержащееся в этих реакционных растворах,подвергают количественному анализу спомощью газовой хроматографии для 20определения скорости реакции. Результаты приведены в табл.1.(Влияния облучения на скорость реакции гидратации),25П р и м е р 22. Промытые бактериальные клетки штамма Г 1-774 получают аэробным культивированием штамма в среде(рН 7,2), содержащей глюкозу 14, пептон 0,5, дрожжевой экстракт 0,3-:, ЗО солодовый экстракт 0,31 и сульфат железа (111) 7 НО 0,054, и промывкой полученных клеток С,05 М фосфатным буфером. Затем 40 ч, полученных клеток (содержание воды 754) 4.5 ч. акриламида, 0,5 ц, МЬ-метиленбисакриламида и 40 ч. 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,7) смешивают с образованием однородной суспензии, К ней добавляют 5 ч. 54-ного водного раство ра диметиламинопропионитрила и 1 С ч254-ного водного раствора персульфата калия. Смесь подвергают полимеризации при 1 С С в течение 30 мин. Результирующий кусковой гель, содержа щий бактериальные клетки, дробят на мелкие частицы и частицы полностью промывают С,С 5 М Фосфатным буфером (рН 7,7) с получением 100 ч. иммобилизованных бактериальных клеток, Им мобилизованные клетки обрабатывают 0,05 М Фосфатным буфером (рН 7,7) с полуцением раствора концентрацией 3,5 г сухих клеток на литр. Раствор иммобилизованных клеток делят на две 55о порции. Одну оставляют при 0 С в течение 4 ц при тех же условиях свето-. вого облучения, что и в примере 1 (выдержка на .свету), а другую порцию 01 6оставляют при 0 С е темном местетечение 4 ч (выдержка в темноте).При использовании иммобилизованныхклеток в следующих составах иэ акрилонитрила получают соответственно акриламид, Скорость реакции изуцают сточки. зрения колицества получаемоготаким путем акриламида. В случае бактерий, выдерживавшихся на свету,смесь 0,5 ч. геля иммобилиэованныхклеток, 2,5 ч. акрилонитрила и 97 ч005 М фосфатного буфера (рН 7,7)облучают светом в указанных условияхои подвергают реагированию при С С вусловиях перемешивания в течение20 мин (реакция при освещении), Вслучае выдержки бактерий в темнотеэту реакцию проводят с тем исключением, что не ведут облучения светом(реакция в темноте).В каждом из растворов после завершения реакции акриламид подвергаютколичественному анализу с помощьюгазовой хроматографии, В результатескорость реакции при освещении ивыдержке на свету 20,0 Б, а в случаереакции в темноте и выдержке в темноте 0,4 Б так что отношение этих показателей 50,0,П р и м е р ы 23 и 24, Иммобилизованные клетки штамма Ипри выдержке на свету получают на методикепримера 22. 4 ч, результирующих иммобилиэованных клеток, 2,5 ч. акрилонитрила и 98,5 ч, 0,05 М фосфатногобуфера (рН 7,7) смешивают и помещаютв кубический сосуд из нержавеющейстали объемом 2,5 л, верхняя частькоторого открыта. Смесь облучают всосуде через открытую верхнюю поверхность (144 см) с помощью того же ис"точника света с длиной волны 400800 нм, что и в примере 1, при свето"вой энергии 2,48 х 10мкЕ/г кл, сили лампы холодного свечения мощностью 100 Вт при световой энергии1,86 х 10 мкЕ/г кл, с и подвергаютреагированию,при 0 С и перемешиеанииов течение 20 мин соответственно. Содержащийся в каждом из растворов позавершении реакции акриламид подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии, Результаты приведены в табл,5,(влияние интенсивности светового облучения наскорость реакции гидратации),П р и м е р 25 и сравнительныйпример 3. Иммобилизованные клеткиштамма Иполучают по методике 22,0,4 ч. полученных иммобилизованныхклеток, 84,6 ч. 0,0025 М водного раствора сульфата натрия и 1,8 ч, акрилонитрила смешивают и помещают вразъемную стеклянную колбу на 1 л,имеющую часть, выполненную светонепроницаемой. Смесь в колбе облучаютлампой типа Соо 1 11 дИ с длиной волны 1 О400-800 нм и мощностью 150 Вт с расстояния 20 см от реакционного раствора (световая энергия около 7 х 102 мкЕ//г кл. с) при одновременном регулировании рН равным 8,5 добавлением150,056 раствора гидроокиси натрия иподвергают реагированию при регулировании концентрации акрилонитрила вреакционной системе на уровне 23 постепенным добавлением 17,2 ч, акрилонитрила. Таким путем получают 10 ч,раствора по завершении реакции, который содержит 20 акриламида. Количество непрореагировавшего акрилонитрила100 млн" и менее спустя 25 ч после 25начала реакции,При проведении сопоставительногопримера реакцию повторяют при тех жеусловиях, но не используют облучениясветом, Реакционный раствор содержитне более 1/ акриламида спустя 25 чпосле начала реакции,Ссылочный пример 1. Штамм И культивируют по методике примера 1.Полученные клетки Бразрушают35при низкой температуре с помощьюпресса френча с получением клеточнойсуспенэии, Суспенэию подвергают обработке с целью удаления аминокислоти диализу для получения неочищенного 40ферментного раствора в виде фракции,насыщенной 504 сульфата аммония,которая содержит белок в концентрации3,9 белка/мл, Раствор делят на 2 порции ОДну порцию выдерживают при 1 0 С 45в течение 4 ч в тех же условиях облучения светом, что и в примере 1 (выдержка на свету). Другую порцию выдерживают при 1 О С в течение 4 ч в темномместе (выдержка в темноте). При ис 50пользовании неочищенного ферментногораствора в следующих составах из акрилонитрила получают соответственноакриламид, Скорость реакции изучаютс точки зрения количества получаемого55таким путем акриламида.В случае бактерий после выдержкина свету смесь 2,5 ч. неочищенногоферментного раствора,2,5 ч, акрилонитрила и 95,0 ч. 0,05 М фосфатного буфера облучают светом в описанных условиях и подвергают реагированию при 10 С и перемешивании в течение 20 мин, В случае выдержки бактерий в темноте реакцию повторяют в тех же условиях, но с тем исключением, что освещение не используют, Содержащийся в каждом из растворов после завершения реакции акриламид подвергают количественному анализу с помощью газовой хроматографии, В результате количество акриламида (АА), полученного таким путем, составляет 103 мкмоль АА/мг белка мин, в случае выдержки на свету и реакции с облучением и 102 мкмоль АА/мг белка мин в случае выдержки в темноте и реакции без облучения, Отношение этих показателей 1.01Таким образом, эфФект светового облучения не наблюдается.Ссылочный пример 2, Этот эксперимент показывает, что бактерии, не проявляющие нитрилаэной активности, но обладающие другой ферментной активностью, не испытывают изменения ферментной активности под действием светового облучения. Промытые клетки Бгеъ 1 Ьас ег 1 ывапнпоп 1 адепез (1 А 11 1645) получаютаэробным культивированием штамма всреде (рН 7,2), содержащейглюкозы, 0,5/ фумарата натрия, 0,21, мочевины, 0,2 двуэамещеннокислого фосфата калия, 0,051, сульфата магния 7 НОи 1 раствора после замачивания кукурузы. Клетки диспергируют в 0,05 М.Фосфатном буфере (рН 7,7) в темнотедля получения суспензии клеток, имеющей концентрацию 30,0 ОД, мкм, Бактериальный раствор делят на две порции. Одну оставляют при 30 С в течение 1 ч на расстоянии 20 см от лампыСоо 1 Беар мощностью 150 Вт при световойй энергии 7 х 102 мкЕ/г кл. с (выдержка на свету), Другую порцию оставляют при 30 С в течение 1 ч в темноте (выдержка в темноте), При исполь"зовании этих бактериальных растворовв следующих составах из фумаровойкислоты получают яблочную кислоту,Скорость реакции изучают в сопоставлении с количеством получаемой такимпутем яблочной кислоты,В случае бактериального растворапосле выдержки на свету смесь 50 ч,полученного бактериального раствора)5308 ч. Фумара 1 а натрия и 42 ч, 0,05 МФосфатного буфера (рН 7,7) реагируютпри 30"С и перемешивании в течение1 ч в описанных условиях облучения,В случае бактериального растворапосле выдержки в темноте реакцию проводят в тех же условиях, но при отсутствии освещения. Фумаровую кислотуосаждают добавлением 2 И НС 1 и удаляют Оиз раствора после завершении реакции,после чего содержание яблочной кислоты в каждом из растворов после завершения реакции определяют цветопроявительным методом с использованием 2,7- 15нафталиндиола. В результате количествояблочной кислоты 3,40 мкмоль/ОД ч вслучае реакции и выдержки на свету,и 3,36 мкмоль/ОД в случае реакции ивыдержки в темноте. Отношение показа"телей 0,95. Таким образом, эффектсветового облучения не наблюдается,П р и м е р ы 26-28, Осуществляютспособ согласно примерам 2-13 за темисключением, что применяют другой типнитрилов и количество используемыхнитрилов составляет 2,5 ч.Полученные результаты показаны втабл,6 (получение амидов из нитрилов).Использование способа позволяет 30интенсифицировать процесс гидратациипри использовании его в промышленноммасштабе,Формула и зоб ретения 1. Способ получения амида путем гидратации исходного нитрильного сое" динения суспензией грамположительных микроорганизмов, обладающих нитрилаз ной активностью, при температуре 0- 20 С и рН 6-9 с последующим выделением целевого продукта, о т л и ч а ющ и й с я тем,. что, с целью ускорения способа, суспензию микроорганизмов подвергают воздействию световой энергии в количестве не менее 1 хх 10мкЕ/г кл.с с длиной волны 200- 800 нм до и/или после контактирования их с нитрильным соединением, при этом реакцию гидратации ведут в сосуде,состоящем по меньшей мере час 1 ичноиз материала, не пропускающего сне 1,2. Способ по и,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что воздействуют световой энергией в количестве не менее2 х 10мкЕ/г кл. с,3, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что используют суспензию штамма 1-774 рода СогупеЬасгег 1 цщ,штамма Нрода Мосагд 1 а, штаммаСВБрода 11 ас 111 цв, штамма СВБ рода ВасгегЫ 1 цтп, штамма СВБродаИсгососсця или штамма СВЯродаВгеч 1 Ъасгег 1 цтп,4, Способ по п,1, о т л и ч а ющ и й с я тем, что в качестве нитрильного соединения используют ацетонитрил, пропионитрил, н-бутиронитрил,п-бутиронитрил, н-валеронитрил акрилонитрил, метакрилонитрил, бензонитрил, цианопиридин, малононитрил,сукционитрил, фуранонитрил, хлорацетонитрил,-гидроксипропионитрил,аминоацетонитрил или -аминопропионитрил. Исходный нитрил,мас,ч,Ацетонитрил 1Метакрилонитрил Валеронитрил 0,25 Цианопиридин 1 Бензонитрил 0,125 Пропионитрил 1 н-Бутиронитрил 1Малононитрил 1Сукцинонитрил 1фумаронитрил 1Хлорацетонитрил 1 -Гидроксилпропионитрил 1 П р и м е ч а н и е. Количество бактериальных клеток С,088 мас,ч,рН 7,7,1530101 Таблица 2 ею вЮиш ат Выдержка на свету- реакция при облу чении (Ц) Отношениепоказателей длядвух режимов Выдержка в темноПолучаемые амидные соединения Примеры те-реакция втемноте 6,344,5 56,4289,0 9,0 6,5 Т а б л и ц а 3 При- Род используемых бактерий Штаммымеры Выдержка насвету - реакция приоблучении Отношение Выдержка в темнопокаэате"лей для те - реак" двух режимов ция в темноте. (ц) СВЯСВЯСВБСВВ11-775 2,6 1,8 2,2 62,8 12,0 21,8 59,6 27,51,7 2,7 15 16 17 18 57,0108,4 61,8106,8 33,0 Васг 11 цвВасгегЫгцвИгсгососсцвВгечгЬасгегыщКосагдда Т а б л и ц а 4 Примеры и сравнительные при- меры Подаваемаясветоваяэнергия,мкЕ/г кл, с Скорость реакции послеоблучения20 ч (ц) Скорость реакции после облучения в течение 1 ч 7,8 4 31,6 0,29 2,4Ацетонитрил Метакрилонитрил Валеронитрил Цианопиридин Бензонитрил Пропионитрил н-Бутиронитрил Малононитрил Сукцинонитрил фумаронитрил -ГидроксипропионитрилХлорацетонитрил АцетоамидМетакриламид ВалерамидНикотинамид БензамидПропиоамид н-Бутиламид МалонамидСукцинамид Фумарамид1530101 Т а б л и ц а 6 Полученныеамид. соединения свето ета зобутиронитри12,0 По Техред Л.Сердюкова Коррек О,Спесив Подписноезобретениям и открытиям при ГКНТ ССС Раушская наб д 1/5 Заказ 77 Ь 7/59 Тираж 501 ВНИИПИ Государственного комитета по 113035, Москва, ИУжгород, ул.Гагарина,1 оизводственно-издательский комбинат "Патент При- меры Исходное нитрилсоединение Изобуамид Реакции с облучениЧ Реакции Реакция с без