Способ получения клона бактерий еsснеriснiа coli, трансформированного плазмидой pbr322, содержащей вставку рsт 1, кодирующую интерферон или

04 1)4 С 1 00 РДРГ РР В ГОСУД ПО ДЕ ИСАНИ ТЕНИ ПАТЕНТ р)), МаркАдольФ,и Петер О,ген ну 1мулого,чересинтРНК а СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИН ВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССРИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ(71) Др. Карл Томэ ГмбХ ((72) Эва Дворкин Растл (АБрус Дворкин (11 Б), ГвнтерПетер Мейндл, Герхард БодСветлый (АТ)(56) БМиге, 284, 316-320Иа 1 иге, 285, 542-547,(54) С ЕБСНЕБ ГО ПЛА ВСТАВК РОН ф (57) И ти био рии. Ц новрем рекомб кодир времен ся на) ПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛОНА БАКТЕРИИ 1 СН 1 А СОЫ, ТРАЕ 1 СФОРМИРОВАННОВМИДОИ рВВ 322, СОДЕРЖАУЕЙ У Ря 1-1, КОДИРУЯЩУЮ ИНТЕРФЕИЛИ рзобретение относится к областехнологии и генной инженеелыо изобретения является оденный отбор клонов, несущих инантные молекулы ДНК с геном, ующим М- и-интерферон, Одноный отбор клонов обеспечиваетличием гомологии между (от 5 функциональными 11 Б-Ыи 1 РИ-Участок гомологии имеет длинуклеотидов со следунщей фор ССТТСТБААСТО, Кроме то- РНК из клеток Бага 1 ъа вьщеляит 9 ч после индукции вирусом, к ДНК осуществлявт на (А)+ величиной молекулы 6 и 18 8, ДНК получают размером 600 п.о.Изобретение относится к областибиотехнологии и генной инженерии.Целью изобретения является одновременный отбор клонов, несущихрекомбинатные молекулы ДНК с геном,кодирующим - ир -интерАерон,Одновременный отбор клонов обес-"печивается наличием гомологии между(от 5 до 7) функциональными 1 РИ-и 1 РИгенами. При этом участокгомологии имеет длину 13 нуклеотидовсо следующей Аормулой 5 ССТТСТООАА 1СТОЗ . Кроме того, и РНК из клетокМашана выделяют через 9 ч послеиндукции вирусом, синтез к ДНК осуществляют на (А)+ РНК с величиной молекулы 6 и 18 Я, а дн.ДНК получаютразмером 600 п.о.П р и м е р 1, Выбирают подходящие клетки для производства поли(Л)РНК, которые содержат человеческие1 РИ- м и 1 РИ-(3- иРНК.Различные человеческие клеткииндуцирувт сендайвирусом для производства интерАерона известными методами, Через 24-48 ч определяют содержание 1 ГИ-й,и 1 ГК- нейтрализацией специАической для типов антисыво"роткой.,Выявляют, что клетки намальвапродуцирувт более 50% П"Б-ы и до50% 1 РИ- после индукции сендаивирусом.Тест на нейтрализацию проводятследующим образом,Приблизительно 10 ед интерАеронаоинкубирувт при 37 С в течение 6080 мин:1) антисыворотка против 1 РИ-Ы;окончательное разбавление 1;100;2) антисыворотка против человеческого 1711-; конечное разбавление1:300;3) смесь первой и второй антисывороток.После инкубации определяют остаточную активность интерАерона методом определения стерильных пятен,+П р и м е р 2. Получают поли(А)РНК, которая содержит человеческие1 Щ .иРНК из клеток намальва,индуцированных сендаивирусом.Разводят клетки намальва и индуцируют сендаивирусом. иРНК выделяютчерез 9 ч после индукции сендаивирусом, так как после этого интервалаколичество интерферонспецифическихмРНКдостигает максимума. 5 10 1 Б 20 2 г ЭО ЗБ 40 45 Клетки отделяют центриАугированием и течение 20 мин при 1000 я, одинраз промывают буАером 11 Р(0,14 мольИаС 1, 1,5 ммоль МяС 1, 10 ммоль трисНС 1, рН 7,4) и ресуспендирувт в ИР40 (БЬе 11)-буфере с 0,57. неионногодетергента БР(Шелл) и 2 мг/мольбентонита. Через 5 мин в ледянойбане клеточное ядро центриАугируют,пеллетирувт, как описано вьппе, экст."рагирувт содержащую РНК цитоплазмическув Аракцив добавлением 27. натрийдодецилсульфата, 5 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты и50 ммоль трис-НС 1, рН 9, затем трижды смесью Аенол - хлороАорм и оцинраз хлороАормом и непосредственнопосле этого осаждают РНК спиртом.Поли(А) РНК очищают с помощью олиго(ЙТ)-целлюлозной хроматографии, врезультате центриАугирования в 520%-ном градиенте сахарозы в 10 ммольбуАера ацетата натрия, рН 5,5,1 ммоль этилендинитрилотетрауксуснойкислоты(20 ч при скорости 25000 об/минс ротором ЯрЫсо Б 11 27) разделяют повеличине молекулы и собирают молекулы величиной порядка 6 Б (единицаУседиментации и 18 Б для простотыназванная поли 12 Б-РНК),Содержание интерАеронспециАической иРНК (1 И 1-и 1 РК-р мРНК) определяют в результате микроинъекции12 Б-РНК в ооциты херононуса, измеряют активность интерАерона в ооцитах,При этом получают 1г инъецированной(12 Б-РНК среднего титра интерАерона около 1000 1 Е интернациональная единица интерАерона , считая настандарт интерферона 69/19,При этом около 807 активности нейтрализуется антисывороткой противМ-типа интерАерона, в то время какобщая активность нейтрализуется только смесьв, состоящей из анти-М- .иантиинтерферона антисыворотки. П р и м е р 3. Поли(А) РНК, которая имеет величину молекулы 6-18 Я (12 Б-РНК), применяют в качестве матрицы для получения однониточной кДНК, причем 40г/мл поли(А) РНК инкубируют в 50 ммоль трис-НС 1, рН 8,3, 10 ммоль МяС 1 100 моль КСХ, 1 ммоль дЛТРЯ, 0,4 ммоль дитиотрейтола, 4 ммоль пироАосфата натрия, 20 р г/мл олиго(деокси 7 тимидина 12-18 (Р 1 "биохимия), 25 р г/мл актиномицина Р со 100 ед/мл АМУ обратной транскрипта 1346048зы в течение 45 мин при 44-45 С, Непосредственно после этого РНК гибрида РНК-ДНК удаляют путем одночасовой инкубации в 0,3 моль ИаОН при50 С, после чего однониточную кДНКнейтрализуют и осаждают этанолом,Вторая нитка ДНК, комплементарнаяк однониточной ДНК, синтезируетсяпрн следующих условиях: 30г/мл оцнониточной кДНК инкубируют в0,12 моль буйера Аосйата калия, рН6,9, 1 О ммоль МдС 1, 10 ммоль дитиотрейтола, 1 ммоль ЙИТРБ с 300 ед/млДНК полимеразы 1 (Во 11 тпег МаппЬе.л), 6 ч 15 С. Затем экстрагируютфе олом и осаждают этанолом.Полученную таким образом двуниточну.с смесъ кДНК у обоих концов ниткимодийицируют, удаляют выступающиеконцы отдельных нитей, Для этого ДНКинкубируют в 0,3 моль ИаС 1, 30 ммольацетата натрия, рН 4,5, 1 ммольЕпС 1 с 1250 ед/мл Б 1 нуклеазы(Мх 1 ея ТаЬогаЬогея) в течение30 мин при 37 С, после чего экстрагирунт йенолом и осаждают этанолом.Полученную таким образом двуниточнуюкДНК разделяют на 5-20 Х-ном градиенте сахарозы в 10 ммоль буйера ацетатанатрия при рН 5,5, вммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты и выделяют те йракции, которые имеют покрайней мере 600 о,п. кДНК (0,5 ( г)удлиняют приблизительно на 15 нуклеотидов путем наложения олигодезоксицитидина у 3 -конца обеих в результате инкубации в 140 ммоль калийкакозилата, рН 6,9, 30 ммоль трис-НС 1,рН 6,9, 2 ммоль СоС 1, 0,1 ммоль дитиотрейтола, , мг/мл ВБА, 5"мольЙСТРя с помощью 500 ед, терминальнойтрансйеразы в течение 4 мин при 3 С,Аликвоту 2г рВВ 322 линеаризуют спомощью, рестрикционной эндокуклеазыРя 1 1, смесь кДНК удлиняют путем наложения олигодезоксигуанидина у конца 3 молекулы и модийицируют, получая выступающие концы олигодезоксигуанидина, Получают стабильные днДНКпутем основного спаривания концоволигодеоксигуанидина со свободнымиконцами олигодеэоксицитидина молекулыкДНК. Для этого оба компонента этойреакции инкубируют в 0,1 ммоль ИаС 1,1 ммоль этилендинитрилотетрауксуснойкислоты, 20 ммоль тряс-НС 1, рН 8, вотечение 10 мин при 65 С, затем в теочение 2,5 ч при 45 С и затем в течение ночи при 37 С,С помощью этого метода регенерируется место расщепления рестрикционной эндонуклеазой Ря 1 1 и в последствии это можно испольэовать для того, чтобы вырезать из векторного гибрида кДНК-вставку,Полученные этим методом гибридплазмиды из гВВ 322 и намальва-кДНКприменяют для трансйормации Еясйег- сМа со 1 НВ 101, Этим методом получают 30000 клонов трансйормированныхклеток Е. со 1 ь, которые разделяют намикротитропластинах.П р и м е р 3. Тридекануклеотидметят в 50 ммоль трис-НС 1, рН 7,5,10 ммоль М.:С 1,ммоль дитиотрейтола, ( ммоль спермидина, 1(м Рз-гденозинтриФосйата с 60 ед./мл Т 4полинуклеотидкиназы (ВеЬЬеяйа Веяеагс .ь,аЬога+.огея) в течениео30 мин при 37 С до специйическойактивности около 500 Ки/ммольу5 -конца молекулы.26 Этот меченый тридекануклеотидпрчменяют в качестве праймера я- , пея) для синтеза однониточной кДНК,при этом в качестве матрицы служитполиА) ДНК из кндуцированных сендаивиру"ом клеток намальва, Реакцию проводят при 5-10-кратном мопярном избытке праймера по отнолению к РНК в50 ммоль трис-НС 1, рН 8,3, 60 ммольКС 1, 5 ммоль дитиотрейтола, 50г/млактиномицина 1, 4 ммоль МдС 14 ммоль натрийпиройосйата, 0,5 ммольйИТРБ со 100 ед,/мл ЛМУ обратнойтранскриптазы в течение 90 мин при37 С, После удаления РНК гибрид РНКДНК инкубируют 1 ч в 0,3 моль БаОН40опри 50 С с поспедующей нейтрализацией 0,3 моль уксусной кислоты и кДНКприменяют в качестве пробы гибридизации. Полученная таким образомкДНК несет радиоактивную метку линьв молекулах, которые были синтезиро: ваны из интерйеронспецийического тридекануклеотида в качестве праймераи, следовательно, обладает высокойспецийичностью для опознания интерО АеронДНК-последовательности в гибридизации.П р и м е р 4. Клетки отдельныхклонированных трансйормантов переводят на нитроцеллюлозный йильтр (2215 см, величина пор 0,45 )м,МЫ 1 хроге ойея БсЫ 1 с)ея), выращивают до величины колонии 2 мм диаметром и подготавливают к гибриди 1346048зации. Гибридизацию нуклеиновой кислоты меченой на концах кДНК проводят в смеси, содержащей 50 формамида, 4 хБЕТ (1 хБЕТ:0,15 моль БаС 1,5 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, 50 ммоль трис-НС 1, рН8), 1 храствора Денхардта (0,02 ВБА,0,02% фиколла, 0,02% поливинилпирролидона), 0,5 мг/мл денатурированнойспермы лосося ДНК, 0,1% натрийпирофосфата и 0,1% натрийдодецилсульфата, в течение 48 ч при 37 С. Фильтрпромывают в растворе, состоящем из50 формамида и 0,2 хББС (1 х ББС==0,15 моль ИаС 1, 0,015 моль нитратанатрия) при 20-25 С в течение 6-8 чи затем опрыскивают раствором 1 кББС.Фильтры высушивают при 20-25 С ипри -70 С экспонируют с рентгеновской пленкой (кодак ХБ). Всего в результате скрининга получают приблизительно 13000 трансформированных колоний бактерий и выделяют 190 клонов.В соответствии с этим около 1 . всех 25клонов клонбанка содержат специфическую последовательность йССТТСТООААСТО.П р и м е р 5. Тридекануклеотидпозитивные клоны (микротитропластиныР 1 и Р 2) и произвольно выбранныеклоны микротитровой пластины (Е 52)переносят на нитроцеллюлозный фильтр,разводят, подготавливают для гибридизации бактерий и гибридизуют раззличными Р-меченными кДНК-вставками.Гибридиэацив проводят, добавляя враствор гибридизации 50 р г/мл поли(11)и 10 ц г/мл поли (1) : поли( С),фильтр промывают после гибридизациив 50%-ном формамиде и 1 х ББС. Оказа 40лось, что клон Р 1 Н гибридизируетболее чем 90% всех тридекануклеотидпозитивных клонов пластины Р 1 и Р 2,а также некоторые клоны пластины Е 52.Идентичность многих этих клонированныхпоследовательностей подтверждают рестрикционным анализом. Клон Р 2 Н 10гибридизируется не только сам с собой, а также с клоном позиции 1 С 12,1 Р 12, Е 52 Е 1. Кпоны Р 1 А 6 и Р 2310 анализируют таким же методом,П р и м е р 6. Поли(А) РНК отделяют от индуцированных и неиндуцированных клеток намальва, денатурируют в результате инкубации в течение 1 ч при 50 С в 1 моль глиоксаля, 50 .-ном диметилсульфоксиде, 10 ммоль буфера фосфата натрия, рН , разделяют на 1,4 -ном плавающем агаре, переносят на нитроцеллюлозный фильтр и гибридизируют с плазмидной ДНК, Р-меченной с помощьв никтрансляции. Плазмидную ДНК, которая произошла от индуцированного гена, гибридизируют вэтой серии опытов только РНК из индуцированных клеток, но не РНК иэ неиндуцированных клеток. Применяемые для гибридизации плазмиды-ДНК являются Р 1 Н 1 (А), Р 1 У 12 (В,1), Р 2 Н 10(С), Р 1 А 6 (Е), Р 2 В 10 (Г), Из испытанных плазмид гибридизировались только Р 1 Р 12, Р 2 Н 10 и Р 1 А 6 только с РНК изиндуцированных клеток, в то время какР 1 Н 1 и Р 2 В 10 гибридизуются также сРНК из неиндуцированных клеток. Величина молекулы РНК, гибридизирующейся с Р 1 Р 12 и Р 2 Н 10, 11-12 Б, величина РНК, гибридизирующейся с Р 1 АН,12-14 Б (эти величины молекул известны для ТРИ-или ТРИ-р-иРНК, Плазми,цы Р 1 Р 12, Р 2 Н 10 и Р 1 А 6 исследуют,цополнительно, чтобы однозначно установить их содержание в интерферонДНКпоследовательности. П р и м е р 7, Плазмидную ДНК фиксируют на нитроцеллюлозном фильтре и инкубируют при условиях гибридизации с поли(А) РНК из индуцированных клеток намальва, Получают связанную ДНК-последовательность интерферона.Негибридизированнув РНК смывают, гибридизированную РНК выплавляют из ДНКи инъецируют в ооциты Хепорцз 1 аечз.Если в ооцитах синтезируется интерферон-протеин, антивирусные свойства которого могут быть доказаны методомподсчета стерильных бляшек, 10г линеаризованной плазмидной ДНК денатурируют в 200 шл 0,5 н, ИаОН, нейтрализуют 200 р л 0,5 н. уксусной кислоты и 20 х БЕТ и фильтруют связыванием на нитроцеллюлозном фильтре диаметром 2,5 мм. Фильтр высушивавт при комнатнои температуре, выдерживают 2 ч при 80 С и затем в течение 1 ч при 53 С или также при 37 С в смеси, содержащей 50 формамида, 20 ммоль пиперазин-И,Б -бис-(2-этансульфокислоты), рН 6,5, 0,4 моль ИаС 1, 5 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, 10 декстрансульфата, 1 . натрийдодецилсульфата,204 г/мл Е. со 1 п 1 РНК, 50 рг/мл поли(А)прегибридизированной, и в самом буфере после добавления 14-40г индуцированной намальва-поли(А) РНК гибриди"1346048 35 13 "5 8 0 Р 2 Н 10 1 Н 1 2 2 В 10 2 т вставки помощью ы, причем рестрикции Есо В 1 равнивают и Р 2 Н 10 геном для Ртги 1, Пример 9.ственный РБ-к-тип цируют иэ коллекци клеотидпозитивных эуют 1800 клонов Клон Р 1 А 6 - еди клона индентифи 190 тридеканулонов. Гибриди- ервоначального зировали в течение 5 ч. После этого фильтр промывают Зх 20 мин при 25 С в смеси, содержащей 0,2-1 БЕТ, 0,2 Х натрийдодецилсульфата 1 Х декстран 05 сульфата, 5 рг/мл т-РНК, затем 2 10 мин при 25 С в смеси, содержащей 2 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2 Х натрийдодецилсульфата, 1 Х декстрансульфата, 10 5 рг/мп т-РНК, затем 5 мин 60 С в смеси 2 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2 Х натрийдодецилсульфата, 1 Х декстрансульфата, 5 ц г/мл т-РНК, затем 5 мин при 60 С в 2 ммоль этилендинитрилотетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2 Х натрийдодецилсульфата, 5 р г/мл т-РНК. Гибридизированную РНК в течение 4 мин элюируют при 100 С в 1 мл Н О с 10 рг т-РНК, После хроматографии на олиго-(йТ)-целлюлозной колонке РНК осаждают этанолом, вносят в 5 мп Н О и инъецируют в ооциты Хепория З.аетз.я. Ооциты после инкубации 25 в течение 2 дней при комнатной температуре испытывают методом подсчета стерильных бляшек на активность интерферона.Подтвердилось, что клоны Р 1 У 12 и Р 2 Н 10 несут вставку интерферонДНК.В таблице приведены результаты испытаний. П р и м е р 7. ИсследуюкДНК клона Р 1712 и Р 2 Н 10рестрикционной эндонуклеаопределяют наличие сайтовэндонуклеаз ВЬлН, Вц 1 11НЫй 111, Ея 11 и Рю 11,рестрикционные карты Р 1 Ис известным из литературы1 РБ. Все три клона имею РяС 1 и В 7 11 сайты рестрикции. Кроме того, последовательность ДНКвставки клонов Р 1 Е 12 и Р 2 Н 10 с 1 Щгеном определяют по методу Максамаи Гилберта (правый 3Рл 11 - иВд 1 11 Фрагмент) и сравнивают с опубликованной 171 Тпоследовательностью. Последовательности Р 1 Е 12 иР 2 Н 10 идентичны с 1 РМгеном.Выяснилось, оба клона на 5 конце не имеют полной ТРИпоследовательности, у них отсутствуют приблизительно 60 куклеотидов региона, кодируюшего для зрелого протеина, У3-конца Р 1 Е 12 является полным РХН 107также содержит весь 3 -регион "ГЛ-(3 -Р-кДНК, включая поли(алпоследовательность, происходящую от поли(А)РНК,Р 2 Н 10 простирается однако еще заметнее ,1400 п.о, 3 полийА лежит вI (одной области с последовательностьюолиго(йС), следуя от последовательности неизвестного происхождения, анализ ДНК-последовательности различныхотрезков этого дополнительного региона Р 2 Н 10 не дает гомологии с 1 Р 11-угеном. Перекрестно гибридизированныес клоном Р 2 Н 10 клоны Р 1 С 12 и Е 52 Е 1гибридизируются и с дополнительнымрегионом Р 2 Н 10,. а не с частью 1 УБ-,"3,П р и м е р 8, Клон РАб гнбридизируют с вирус-индуцированной намальва-РНК в регионе 12-14 Я. Он содержит вставку кДНК приблизительно900 п.о., которая, как показал рестрикционныи анализ, не имеет сайтарестрикции для ВашН 1, Вц 1 Х 1, ЕсоН 1 Нпй 111 Ря 1;1 и Рттп 1,Доказательство того, что клонР 1 А 6 содержит 1 УЕ-последовательность получают путем анализа ДНКСпоследовательности. Последовательность кДНК-вставки Р 1 А 6 определяютсравнением с 1 РИ-Ы;последовательностью, Оказалось, что клон Р 1 А 6 содержит на 49 пар оснований более короткий варианте 1 Р 11 С. Наличие поли-(А)последовательности у 3 -конца Р 1 А 6указывает на то, что клон Р 2 А 6 произошел от более короткой иРНК, чемопубликованный клон Ье 1 УИ С.Регионкодирования е 1 РИ С, содержится вплазмидной ДНКЛИТЯРа.с РЫ НОБ ЗЯ СЛ, Дават сгни 1 Г"-, ДНК 13 ГТ 1.ткп)а кс -:., ) Г 7 в сб;),.Стк НУКЛЯО"Гт Б )тО:лис "-т Г т етт 1-) . Гттке р а 3. .1.чкяВ 1-,- ЗГ," я "),) 1 ); Г) соатвет, )вен то 1.11;кпе;тип,Р, з,":;ецн нуклеотидам С П р к ; е р О ВизатыбаКЕриг тс.г 1 С 1 О)")С; БНН1)77,.Гг и сБ;с гГИЧЕСКК,-.11.".ИБНС)Г)л ,)1 Зт;ЭТСГО ) "МЛ КЛьт 7Цивают;. .ВГО,г, - ,.ПЛ)1 ТНС,;"), О,-0 ;,;.1,:,гт КУЛЬ 1" 7ЬГГт"1 с 31 Е - стБ )а Р 1),1., т,.-")1 атт 1 УГГГЯК)г")Ю-ЖЕ СаМОтс буг,ЕВ)а цОСГГ.= в1 МГ /фС 1 ЛЬ 3 О 1 игабак)ертт 1 Г т, 1 ОЛЬДУ К,.З аквактсЗС;Гтз З-.:Ю 1 ЦЯН Р)Ь тУ БИРС)ВаККЕГпвк 40000 об/мкн Обломки кОСадОК СтЕрИЛЬНО Лтн)льтр"7 ГКтПОДСЧетс. ТЕриГ 1 ЬНЬ 1 Г Ц 7 с)Г)екБаЮТ На: - ;,КТИВН.СГЬ ,.Т - ,ОКЕПОЛт 7 ЧЯН НЬГК 1 сК,) Е.Гтп.ЛНа 1 З.т дскаЗЫВ;ЮТТСЛЬНО .а., Яд=.сл. . 1)К,.с1-,клон 1 А 6 в этом Яс.еактивности, ч то,) бьяг.н;Гесдругим аркен"Ираванке.: всторе плазвдь,13 р к и е )-1 1, Г,;г:гИНТЯРГ)Я) Сна КОДИР;.; БаГ Г 1ЧЯСТБЯ ПРОМОТОРНОЙ .гСГ 7 ати берут изве тный из литеМафаР ТтРИП.авс:;)даат тЕТшагсевсепБ а Б ка.ГЗстве П-) ттг Ку,.;ат и,ра турыг:- а кДНК- ба-ка со вставкой КД)1 К кГНа Р 1 А 6, Н)сводят рестрикикоГнь 1 анализ и частично огределякт ДНКпос.ттед звательность кДНК данногс клона,. Вьделяют клон П 7 Клон 1 Л СГ)дярткит 1 как 1 Я 1 Р 11 А к сайты рестрикции пя эндонуклеаз Яр 1 11 и нтг 11,Анализируют последоваяльност). чаСТИ ДНК 11- 1"1 КГ.с КЛОНс,)." / )Дпя ПОзипкй 120-".27 найдены с,Ге . д)уЮБге :.г .1 К Г)г" З)ГСг: а ГЕГ НОС )1СГг", Г), АГ д)Г .,7 ГЬг, -гсг Г - -)с- СС-СС3 .-1".СГАСС ,СО г)Гт Гг ) гРС,.)тг Г ( С. ССА ТСС",."Ьгс)ССС) 33;.,1)107 г С, )Г;-) гГгт)с)сАс-)тГ С Г; )Г 1)Г, г) гГс 1:., аБГНЯН)з 1 лоГ)Я 71,)ва 1 е 1;-- птью 1 Г.)Г -п)пс,ГттсзлдтГТ-.) Чс стную кз гктературы последовательность ДНК Т 1"7-кДНК-ГГоследовательность переваривают зкзакуклеазойВА 131, :.пециАичнз 1 для двукиточной ДНК, в результате чего получают смесь молекул различной длинь), Затем эти лолекуль Лигируют в плазмкду. 1)1 тамм 171 В 101 тр)ансАормГруют этими плазмида- тГ, ОтпЕЛЬ)сн т)раНСГООрМактЫ бЫЛИ ИСПЬКанм На 1 РСПКтКЮ ИНТЯРфЕРОНа,0,5-1 Г ХУ 7-вставки ннкубкруют в1.00 ,и. 20 ммоль трис-НС 3., рН 8,1,0 6 мотть 1 Р.С 1 12 ммоль АяС 1м,ол Сс,С 1., 1 ммсль этилендиниты поте-Грнуксусной кислоты в теченияВ .И, Пт) 50 С ,. ,.; ) сд ВС)3 1, с-гь 11 Чтт-., гтз; с,ттитаЮт. ГЕНЫ щ,- : З Г)гЯРОК От 11 ЕЛИГКРОВ БННЫХ ЛЯВЫХИЗОтРО.акгЛОМ 11 от . ЭбЬЕМа 1. ОСаДОКзцеата. рН 7,.9 зо и;оль К-ацетата,0 ммоль .Г".-ацте 7 а).а 00 г/мл сыворотки альбумкн Вовкнаи и перевариВ,1 Ют 30-5 Г Ег)11-.О. 111 В ТЕЧЕНИЕ 2.3 -:, Реа;ци;. .1;,.какч)в.ют путем наГ):ре - акия в т-челке 10 мин до ос 5 С ипосле .побав.:ения 2 мохь )1 Н-ацетата.",:.н" ин ерЫрока сс.:.едаГт кзопропа;ГОЛ)ГЗ); ),0 б О)б"; т"Ма ), 1 С 1-)К т;аСТВОря"- ; )ль МгС 1 ., 11 110 л.ь цк кзт рейт ов 11 5;Ог а -)Я,-)з)тттТГ)к г)СДатапо)ощью 10ед. ):-1-лкгазы лигиру,.зт с 0,2 Г .-п)Л 111 - линеаризс:.:-: НЫ ООРабатаннь 1 ГГ)ОСЛсттсзай ЭКСсионкым плазмидам рЕР)ОЭ:3 тече1 БЯ НОЧИ Прн 1), С, Е.тг 1)33 яВЛНЕТСя " тттГ-ОКЗВОГИМ КатарОЕ ССдЕБ,ГГКТ.:,Оследовательность г)ромотора тркптоЮанотт-.Рана Б, ПаГСЕЗСЕПБ К ИЗВЕСТт;т 7 г ттз Гтитера Гстры 13 РК;. Яга Гарно ли); - Бткзова ь с Н:.и 111 вс 5 лизи ПРС,1346048 12 Составитель Н.КузенковаРедактор Л.Веселовская Техред И.Верес Корректор В.Бутяга Тираж 500ВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Заказ 5728 Подписное.производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Полученные таким образом плаэмнды применяют для трансформации Е. со 1 НВ 101 и испытывают продукцию интерферона отдельных трансформантов. Получают увеличение экспрессии интер 4 ферона приблизительно до 10 -кратного значения спонтанной экспрес сии,10Формула изобретения Способ получения клона бактерий ЕвсЬегсМа со 1, трансформированно- го плазмидой рВВ 322, содержащей15 вставку Рз 1-1, кодирующую интерферонили , включающий получение фрагментов кДНК, содержащих кодирующую последовательность для генов - иГ -интерферона путем выделения иРНК иэ индуцированных вирусом Сендай клеток В-лимфоцитов синтеза на матрице поли(А) РНК кДНК с помощью обратной+транскриптазы, получения на основе одн, кДНК дн. ДНК в присутствии ДНК полимеразы 1, которую далее обрабатывают Б-нуклеазой и присоединяют к 3 -концу этой ДНК олигодезоксицитидин для нуклеотиды с помощью концевой дезоксирибонуклеотидилтрансферазы, вставку полученного фрагмента в плаэмиду рВН 322, которую предваритепьно обрабатывают эндонуклеазой Рз 1-1, 8-1 нуклеазой, и к 5-концу которой присоединяют олигодеэоксигуанидин нуклеотиды и трансформацию полученными гибридными плазмидами щтамма Е. со 1 х НВ 101 с последующим отбором нужного клона, о т л и ч аю щ и й с я тем, что, с целью одновременного отбора клонов, несущих рекомбинантные молекулы ДНК с геном, кодирующими-интерферон, иРНК выделяют из клеток-лимфоцитов Бата 1 ъа по истечении 9 ч после индукции вирусом, синтез кДНК осуществляют на (А) РНК с величиной молекулы 6 и 18 8, получают дн. ДНК размером 600 п.о., а выбор клона, содержащего комплементарную последовательность к тридекануклеотиду, меченному радиоактивным фосфором, с формулойл5 ССРХСТОИАСТОосуществляют прямой гибридизацией с последующей идентификацией клона, содержащего рекомбинан ные молекулы ДНК с геном, кодирующим интерферон Ф, и