Способ получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа

,78 дет пер ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИ ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕ НЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ ВИРУСА ГРИППА путем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентом цетнлпиридинийхлоридом, отделения полученных гликопротеинов и удаления из раствора катионного де тергента, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, обработку концентрата проводят при массовом соотношении детергента к белку вирусного концентрата, равном 1,0:1-1,5: 1, а отделениеергента осуществляют при тематуре 1-4 фС.111857Изобретение относится к микробиологической промышленности, преимущественно к технологии полученияпротивогриппоэной вакцины и касается получения иммуногенных субь 5единиц вируса гриппа - нейтрамини-,даэы и гемагглютиннна.Известные способы получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа путем обработки вируса неионным 1 Одетергентом1 3.Однако известные способы не позволяют получить высокий выход целевого продукта и предусматриваютприменение сложного и дорогостоящего оборудования.Известен способ получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппапутем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентом -цетилпиридинийхлоридом, отделенияполученных гликопротеинов и удаленияиз раствора катйонного детергента Г 23Известный способ является сложным 2и длительным при исполнении, поскольку применяется высокоскоростноецентрифугирование и длительная про=цедура удаления детергента в процессе диалиэа.Цель изобретения - упрощение способаУказанная цель достигается тем,чтосогласно способу получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппа путем обработки очищенного концентрата вируса катионным детергентом - цетилниридинийхлоридом, отделения полученных гликопротеинов иудаления из раствора катионногодетергента тем, обработку концентрата проводят при массовом соотношении детергента к белку вирусногоконцентрата, равном. 1,0:1-1,5: 1, аотделение детергента осуществляютпри температуре 1-4 С.Способ выполняется следующим образом,В суспенэию вируса гриппа в фосфатно-солевом буфере с концентрациейпо белку 0,4-1,2 мг/мл добавляют опри перемешивании при комнатнойтемпературе раствор цетилпиридинийхлорида (1/50-1/120 от исходногооЪъема суспенэии вируса) так, чтобыконечное весовое соотношение катионный детергент - белок быпо 1: 11,5:1. После перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре 3 3смесь центрифугируют при 6000 8 в течение 1 О мин прн комнатной температуре или пропускают под избыточным давлением 1,0-0,3 атм через мембрану с диаметром пор 52+2 нм или 420+20 нм, супернатант нли фильтрат охлаждают при 1-4 С в те" чение 16 ч и раствор гликопротеинов отделяют от осадка детергента при 1-4 С центрифугированием при 15000 я в течение 15 мин, или декантацией, или микрофильтрацией через фильтр с диаметром пор 420 + 20 нм. Работу проводят в асептических условиях, а в случае необходимости стерилизацию раствора гликопротеинов осуществляют пропусканием через каскад фильтров с диаметром пор 0,8-1,4 мкм и 0,22 мкм. Определение остаточного количества детергента в растворе гликопротеинов проводят быстро и с высокой чувствительностью йо разности оптических плотностей при 260 и 280 нм в отличие от обычно применяемых менее чувствительных цветных реакций.В табл. 2 приведены данные выделения гликопротеинов сочетанием ультрафильтрации и декантации или чнкрофильтрации и декантации.П р и м е р 1. Получение гликопротеинов вируса гриппа сочетанием ультра- и микрофильтрации.В 40 мл взвеси концентрированного и очищенного вируса гриппа штамм А, /Ленинград/385/80 (НЗЮ 2) в 0,01 М натрий-фосфатном буфере с О, 15 М хлористого натрия рН 7,2, титр вируса в РГА 1:16384, весовое содержание гемагглютинина в реакции одиночной радиальной иммунодиффуэии (ОРИД) 200 мкг/мл, общее содержание белка 430 мкг/мл, добавляют при перемешивании 0,34 мп 5 Х-ного водного раствора цетилпиридинийхлорида ( соотношение катионныйдетергент:белок равно 1:1) и перемешивают в течениеч при комнатной температуре. Смесь пропускают при 22 фС со скоростью 0,7 мп/мин под давлением 0,4 атм через полнядерную мембрану .(эффективная поверхность 12,5 см) с диаметром пор 52+2 нм, мембрану промывают 10 мл 0,01 М фосфатно-солевого буфера рН 7,2. Ультрафильтрат (50 мп, 300 мкг/мл белка, 130 мкг/мп гемагглютинина, титр РГА 1:2048) охлаждают прн 3 С в тече50 55 П р и м е р 3. Получение гликопротеинов вируса гриппа микрофильтрацией с последующей декантацией.Этот пример отличается от приме 5 О 15 20 25 ЗО 35 40 45 ра 1 тем, что после обработки очищенного концентрата вируса гриппа А/Киев/59/79 Н 101 5 -ным водным раствором цетилниридинийхлорида (0,23 мл, соотношение детергент:белок равно 1,5;1) при 18"С,смесь пропускают со скоростью 200 мл/ч под избыточныи давлением 0,3 атм через попиядерный фильтр (эффективная поверхность 3,6 смф) с диаметром пор 420+20 ни, фильтрат дополнительно промывают 1 О мп 0,01 М фосфатно-соленого буфера с рН 7,2Дальнейшую обработку фильтрата после охлаждения (2 С, 16 ч) проводят, как описано в примере 2 (табл.2). Степень чистоты полученного раствора гликопротеинов по данным злектрофореза в полиакрилаиидном геле аналогична описанным в примерахи 2П р и м е р. 4, Получение гликопротеинов вируса гриппа А, /Ленинград/ /385/80 низкоскоростным центрнфугированиеи.К 41 мл очищенного концентрата вируса гриппа А, /Ленинград/385/80 (Н 302), содерзащего в 1 ил 1270 мкг белка, 599 мкг геиагглютинина, с титром РГА 1: 10240, добавляют 1,04 ил 5 Х-ного водного раствора цетилпиридинийхлорида (соотношение детергент;белок равно 1:1), перемешивают в течение 1 ч при 20 С и центрнфугируют при 6000 8 в течение 1 О мин. Суцернатант (41 мл, белок - 020 мкг/мл, 80 Х;гемагглютинин - 470 мкг/мп, 783; РГА - 1:8192, нейраминндазная активность - 75 от исходного) охлаждают при 4 С в течение 16 ч и центрифугируют при 4 С в течение 15 мин при 15000.,я. Супернатант (41 мл, белок - 890 мкг/мл, 703; геиагглютинин - 424 икг/мл, 713; РГА - 1:10240нейраминндазная активность - 723, цетилпиридинийхлорид - 0,0043) стерилизуют пропусканием через мембрану СЗЯР (0,22 мкм, Ииллипор, СБА) н вфильтрат добавляют 13 мл стерйльногэ 0,01 М .фосфатно-солевого буфера срН 7,2 для снижения концентрации гликонротеинов. Стерильный раствор гликопротекнов (54 мл) содержит в .1 ип 520 икг белка, 543; 300 мкг геиагглютинина, 663; 30 мкг цетилпиридинийхлорцда; имеет титр РГА1:8192 и 633 нейраююнидазной актив15 20 25 ЗО 35 40 45 50 ности от активности исходного виру. са. Степень чистоты полученногопрепарата аналогична описанной впримере 1, при хранении в растворепри 4 С в течение 1 года активностьгемагглютинина и нейраминидазыснижается на 20%.При разведении до 15 мкг гемагглютинина в дозе препарат оказалсяапирогенным.П р и м е р 5. Получение гликопротеинов вируса гриппа А/Техас/77низкоскоростным центрифугированием.К 10 мл очищенного концентратавируса гриппа А/Техас/77 (НЗИ 2),содержащего в 1 мл 980 мкг белка,390 мкг гемагглютинина с титром РГА1:81920, добавляют 0,2 мп 5 Х-ноговодного раствора цетилпиридинийхлорида (соотношение детергент:белок равно 1:1), перемешивают втечение" 1 ч при 20 С и центрифугируют при 6000 я в течение 10 мин.Супернатант (10 мл, белок 620 мкг/мл,63%; гемагглютинин - 270 мкг/мл,69%; титр РГА - 1:24576, нейраминидазная активность 65% от исходного)охлаждают при 3 С в течение 16 ч ицентрифугируют при 3 С при 15000в течение 15 ьщн. Супернатант (10 мл,белок 570 мкг/мл, 58%; гемагглютинин 250 мкг/мл, 65%, титр РГА1:81920; нейраминидазная активность6 1%, цетилпиридинийхлорид 0,003%)стерилизуют пропусканием черезмембрану СЯЯР (0,22 мкм, Миллипор,США) и получают стерильный растворгликопротеинов (10 мл, белок440 мкг/мл, 45%; гемагглютинин220 мкг/мл 57%; титр РГА 1:65536,нейраминидазная активность 54% отактивности исходного вируса). Степень чистоты полученного препарата аналогична описанной в примере 1,П р и м е р 6 (прототип). К10 мл очищенного концентрата вируса гриппа А /Ленинград/385/80(НЗМ 2), содержащего в 1 мл 700 мкгбелка, 310 мкг гемагглютинина, ститром РГА 1:16384 добавляют0,7 мл 0,5%-ного водного растворацетилпиридинийбромида (соотношение детергент:белок равно 1:2),овыдерживают в течение 1 ч при 20 Си смесь ультрацентрифугируют(ультрацентрифуга Бекман Ь 65,Бротор 60 Тд) при 105000 я в течение 1,5 ч. Супернатант, фракция солюбилнзированньж нммуногенных гликопротеинов, (10 мл) содерямт в 1 мл : белка - 230 мкг, 33%;гемагглютинина 93 мкг, 30%, имеет титр 1:2048 и 26% нейраминидазной активности.Подобные результаты получены при использовании цетилпиридиний- хлорида вместо цетилпиридинийбромида в аналогичных условиях. П р и м е р 7 (прототип). Этот пример отличается от примера 6 тем, что соотношение цетнлпиридинийбромида к белку равно 1:5. Полученный раствор гликопротеинов содержит в 1 мл; белка - 70 мкг, 10%,гемагглютинина 25 мкг, 8%1 титр РГА 1:512 и 8%,нейраминидазной активности.Таким образом, из сравнительных примеров, следует, что как в случае цетилпиридинийбромида, так и цетилпиридинийхлорида при максимальном соотношении детергент:белок равном 1:2, как указано в известном способе, выход солюбилизированных гликопротеинов составляет 26-33%. Основными преимуществами предполагаемого способа получения иммуногенных гликопротеинов вируса гриппас катионным детергентом - цетилпиридинийхлоридом являются: использование при выделении иммуногенных гликопротеинов ультрафильтрации илинизкоскоростного центрнфугирования,что позволяет упростить способ, который не требует дорогостоящего оборудования (ультрацентрифуги) и высококвалифицированного техническогообслуживания использование соотношения цетилпиридинийхлорид:белок1,0:1-1,5: 1 позволяет повысить выходыгемагглютинина и нейраминидазы с26-30%,до 59-80%," простота удалениявыпавшего осадка цетилпиридинийхлорида декантацией или микрофильтрацией, наряду с небольшими потерями(5-10%) гликопротеинов, в отличиеот обычно применяемого для удаления детергента продолжительного и связанного с потерями диализа, использование кассет тангенциального потока(для ультра- и микрофильтрации) идешевых отечественных полиядерныхмембран упрощает технологическийпроцесс получения гликопротеинов,1118573 Таблица Микрофильтрат фф Ультрафильтрат фИсходныйконцентрат вируса Единицаизмерения Показатели 20 20 10 Объем мл 256 мкг/мл 230 760 Белок 60 100 67 мкг/мл 60 240 Гемагглютинин 50 100 условнаяединицаактивности фаей 165 620 171 50 100 НейраминидазаРГА титр в пробе 1024 5120 16768 ф,Препарат, полученный после обработки ( ч, 22 С) концентрата вируса гриппа цетилпиридинийхлоридом -57;ным водным раствором(0,15 мл), .и последующего пропускания смеси через мембрану с диаметром пор 52+2 нм.ф Препарат, полученный после охлаждения (3 С, 16 ч) ультрафильтратаи отделения осадка детергента на полиядерном фильтре с диаметромпор 420+20 нм.ф количество (мкг) н-ацетилнейраминовой. кислоты, отщепившейся отовомуцина в расчете на 1 мл раствора гликопротеинов. Т а б л и ц а 2Пример 3А,/Киев/59/79Ультра- фильткон- рацияцент- рат Пример 2 Показате- Единицали измерения А, /Ленинград/385/80 Декантация Исходный Декантация УльтраФильтрация Исходный концентрат вируса 20 20 50 10256 760 74 100 104 240 40 50 Объем 243 мкг/мл 430 300 64 72 100 Белок Гемагглю- тинин 71 80 мкг/мл 200 1201118573 10 Продолжение табп, 2 Прим Пример ОВЭВ Единиц змере А 1/Киев/59/7 А /Ленинград/385/8 Декант ка нцент" ция Гемаг"глютинин 7. 65 10 0 7 6 86 8 7 9 100 0 8 044 6384 63 102 Составитель П. ВонарцевТехред Л,Кощобняк . Коррект едактор Т. Парфенова впуск аказ 7351/14 Тираж 507 ВНИИПИ Государственног по делам изобретений 113035, Москва, ЖРаушПодписноекомитета СССРоткрытийкая наб., д. 4/5 тент Проектная,4 Ужгород ал ейрамиидазаГА титр пробе словнаднннцактивнои Исход- Ультрный филь нта- Исхный кон цен рат Ультрафильтрация