Способ конструирования гена интерлейкина-2 человека

ментов с заранее запланировднными 11 11линк ими концамигН р и м е р 1, Химический гии- тЕЗ ПОЛИИУКЛЕпт 1 лЛОВ.5Синтез проводят тверЛофдзнл 1 м фосфотриэфирным методом, В качестве носителя используют модифицированное стекло пористое СР 1:-1000, Ндращивднис олигоцуклеотидной цепи проводят от 3 - к 5-концу с помощью линуклеозилдифосфатных производных (МеО) Тгйр (РЬС 1)йр(РЬСТ). Выделение целевого продукта после деблокирования реакционной смеси проводят путем последовательных хроматографий нд 1,1 сЬговдгЬ КР 18 сначала в 0,1 М тризтиламмопийдцетате в грдлиенте дцетонитрила 15-403, Затем раст-. вор выделенного триэтилполинуклеотидд упдривдют досуха, растворяют в 2,5 мл 803-ной водной уксусной кислоты и выдерживают при комнатной температуре 45 минРаствор упаривдют досуха, растворяют остаток в 25 1 мл дистиллированной воды и хроматогрдфируют на Ь 1 с Ьго вог Ь КР 18 в О, 05 М триэтилдммонийацетате в,градиенте дцетонитрила 5-207,30Дуплексы для клонирования Фрагмеитд 1 получают из полинуклеотидов(1-1 Ч) (таблица), Для этого реакционную смесь, содержащую по 00 пмольмеченного у-Р З АТР полинуклеотнда35(1) н фосфорйлированного холоднымАТР полинуклеотида (11) в 100 мкл буФера 1 (60 мМ трис-НС 1, рН 7,5,10 мМ МВС 111 10 мМ 2-мвркаптоэтанол),нагревают 10 мин прн 50 С, охлаждаютло 20 С, добавляют ИМАТР до концентрации 250 мкМ и 10 ед. ДНК-полимердзы1 (фрагмент Кленова). Реакционнуюосмесь инкубируют 30 мин при 20 С.ДНК-луплекс осаждают ацетоном, содержащим 2 Й Ь 1 С 10, промывают спиртом, сущат на воздухе, осалок раст"воряют в воде, Полученный дуплексрасщепляют 50 ед, эндонуклеазы рестрикции Раг 1 в 200 мкл буфера 2(20 мМ трис-НС 1, рН 7,8, 10 мМ МрС 1,501 О мМ 2-меркаптоэтанол), содержащегоо50 мМ ЮаС 1, в течение 3 ч при 37 С.Аналогично получают дуплекс из полинуклеотидов (111 и 1 Ч), которыйрасщепляют обработкой 60 ед, эндонуклеаэы рестрикции Вдщ Н 1 в 200 мклбуфера 2, содержащего 100 мМ НаС 1, во,течение 12 ч при 37 С, Оба рестрикгд оыяепл 111 т с 11 омощью гол - 1 лсктрофорезд в 87, НАД,Реакционную гмесь 1 содержащую по2 пигаль приготовленных дуплексов и0,25 пмоль векторной ЛНК, полученнойиз рР 124 совместным расщеплениемэнлонукледз рестрикции Ва 111 Н 1(50 мклраствора, содержащего буфер 2 и100 мМ М 1,С 1, при 37 С 1 ч) и Рог 1(50 л 1 кл буФера 2 и 50 мМ НдС 1 при37 ОГ 1 ч), обрабатывают 8 ел. ЛНК лигдзы 1 Ьдга-Т в 30 мкл буфера 3 (20 мМтрис-НС 1, рН 7,5, 10 мМ МцС 11 10 мМ2-меркаптоэтанол и 0,25 мМ Лтф) в течение 16 ч при 10 С, Реакционнуюсмесь используют лля трансформацииклеток Р.со 11 ЯМ 03, Суспензию клетокпосле трансформации высевают на 157 ный агар, содержащий 50 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл Х-ва 1. Из колонийимеющих 1 дс Е-Фенотип и гибридизую -щихся с Р .-меченными зондами, выде 31ляют щелочным метолом ДНК, которуюдополнительно анализируют с помощьюВар 1, Есо К 1 и Рзг 1-гидролиэа,Структуру рекомбинантной ДНК рРЬ 41подтверждают модифицированным методомМаксама-Гилберта.Бактерии Р.,со 11 ЛМ 03, содержащиеплдзмиды рРЬ 141 со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл ЬВ-среды, Для получения целевого субфрагмента 1, кодирующего часть геначеловеческого 1 Ьс заранее запланированными 1 липкими 11 концами, 60 мкгЛНК плдэмилы рРЬ 41 в 300 мкл буфера1 и 50 мМ НаС 1 обрабатывают ЗО ед,эндонуклеазы рестрикции Рай 1 1 ч при37 Г, а затем 30 ед. эндонуклеазырестрикции Ро 1 1 в тех же условияхЦелевой фрагменТ длиной 100 нуклео"тидных пар выделяют с помощью электрофореза в 5 Х ПААГ,П р и м е р 2, Получение ДНК субфрагментд 11, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствующую 32-60 аминокислотам человеческого 1 Ь.Аналогично примеру 1 иэ полинуклеотидов (Ч-Ч 111) фрагмента 11 получают дуплексы для клонирования, После репаративной достройки полинуклеоти" дов (Ч и ЧТ) в описанных вьпне условиях полученный дуплекс обрабатывают 50 ед, эндонуклеазы рестрикции Яа 1 С 1 в 200 мкл буФера 1, содерщвщего 150 мМ ЯдС 1 в течение 12 ч при 37 Г, 1554382Ввр 1, Есо К 1 и Рвй зндонуклеаз ре"стрнкцни. Структуру полученной рекомбинатной ДНК рРЬ 137 подтверждают методом Максама-Гилберта,Колонии,. имеющие плазмидц рРЬ 1375со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 ил .ЬВ-среды, Для получения целевого субфрагмента 1 У с заранее запланированными "липкими" концаин 60 мкг ДНК плаэмиды рР 1,137 в300 мкл буфера 1, содержащего 150 мИМаС 1, обрабатывают 60 ед, эндонуклеаэц рестрикции Ва 1 С 1 3 ч при 37 С.Реакционную смесь осаадают 23 нымраствором ЫСЩ , промывают этиловцмспиртои, сушат. Остаток растворяют в00 мкл буфера 1, содерзащего 50 иМЯаС 1 и гидролиэуют 40 ед. зндонуклеазц рестрикции РоМ 1 1 ч йри 37 С.Целевой фрагмент длиной 120 нуклеотнднцх пар выделяют. с помощью электрофораза в 5 Х ПААГ.П р и м е р 5. Получение гена человеческого 1 Ьв составе плаэмндц 25рРН 125.5 икг плазинды рГН 25 гидролизуют последовательно рестриктаэой Яа 1 С 1в 50 мкл буфера 2, содержащего 150 мМяас 1 В 1 ч прн 37 ОСФ затем рестриктаэой Рв 1 1.в 50 мкл буфера 2 и50 иИ йаС 1 в тех же условиях. Сиесьиэ 0,5 пмоль Рвй 1 - Яа 1, С 1 векторнойДНК и по 5 пиоль 1, 11, П 1, 1 Ч субфрагмента (примеры 23, 4, 5 соответственно), взятых в зквимолярнцх соотношениях, обрабатывают 15 ед. Т ДНКлигаэц в описанных выше условиях10 икл смеси используют для трансформации компетентных клеток Е.со 11 ЛИ 0340Иэ колоний, гибрндиэующихся с Рф-ме-ченными олнгонуклеотидамн 11 и 1 Чфрагментов, выделяют ДНК н анализируют ее с помощью Ввр 1, Рвг 1, ЕсоК 1 зндокуклеаэ рестрикции, Структурурекбибинантной ДНК, содержащей синтезированный ген 1 Ьи обозначеннойр 1 Ь, подтверждают модифицированнымметодом Максама-Гилберта.П р и м е р 6. Определение биоло гической активности синтезированного гена 1 Ь,1 икг ДНК плаэиидц р 1 Ьгидролизуют рестриктазой Рвг 1 в описанныхвыше условиях. ДНК осаждают ацетоном,содержашммф 27. Ь(С 1.0, высушенный осадок растворяют в 30 мкл буфера 1, добавляют 5 ед,.ДИК-полимеразы(Фрагмент Кленова) н выдерживают 15 мин при 20 Г, Реэкпионную смесь прог,овают 2 мин при 70 Г, добавляют АТФдо концентрации 100 мкМ, 5 ед, ЛНКлнгаэы и инкубируют 12 ч при 5 Г,2 мкл реакционной смеси используютдля трансформации клеток Е.со 11 ЗМ 83.Иэ колоний, имеющих 1 ас 7. -Фенотип и гибридиэующихся с Рф-меченнымизондами на 11.-2, выделяют ДНК, обозначенную рЕХ 1 Ькоторую анализируют с помощью Ввр 1, Рв 1-гидролиза,Активность рекомбннанткого 1 Ь была оценена по количеству включенного .зН )-тимндииа в ДНК первичнойкультуры клеток иьаинкых лиифоцитов.в соответствии с иэвестмьоч методом.Клетки Е.со 11 ЗМ 83, содержащиерВХ 1 Ь"2,выращивают в 5 ил ЬВ-среды при 37 С до В1, 5. Клетки собирают центрифугированием, затеи ресуспендируют в 7 ил среды ХЕНКС, содержащей 1.мгlмл лизоцниа, и выдерживают 30 мин при 5 Г,. Смесь трикдцэамораживают, озвучивают и цеитриФугируют, Супернатант фильтруют через "М 111 дроге" фильтр (0,2 мкм)00 икл клеточного супернатанта 2-горазведения, добавляют к 100 мкл индуцированной клеточной культуры (посевая концентрация 5-8 0 клеток;,тиосфере 5 Х СО 0,25 мкКи зН-тииидина вводят в реакционную смесь н тер.мостатируют еще 4 ч в тех ае услови"ях. Клетки собираются на фильтре"М 1111 роге" (0,45 икм), промывают0,01 М КБРО (рН 7,5) с О, М йаС 1Количество включенного ЗН-тимидинаизмеряют по Черенкову, используютсчетчик МагЫ 1 П.Лизаты клеток Е.со 11 ЮИ 83, содераащие рРХ 1 Ь, достоверно вызывают пролиферацию мышиных лимфоцнтов, т,е, обладают активностью 1 Ь, Полученныеданные свидетельствуют о биологической полноценности синтезированногогена человеческого 1 Ь,Предлоаеннцй способ получения гена1 Ьимеет существенные преимущества, Вследствие применения на.стадииполучения субфрагиектов длинных частичнб коиплеиентарнцх полинуклеотидови использования репаративной дострой,ки их до полных дуплексов, удаетсязначительно сократить работу по химическому синтезу и выделению нуклео- .тидного материала. Разбивка гена насубфрагменты дает,воэиошкость отдель 5 1554Дуплекс, полученный из полинуклеотидов (Ч 11 и Ч 111), расщепляют обработкой 50 ед, эндонуклеаэы рестрикцииВе 1 11 в 200 мял буфера 1содержащего50 мМ ЯаС 1, в течение 12 ч при 37 С,Оба рестрикта выделяют с помощью гельэлектрофореэа в 8 И ПААГ,Реакционную смесь, содержвщую по2 пмоль приготовленных дуплексов и0,25 пмоль векторной ДНК, полученнойиэ рРН 24 совместным расщеплением эндонуклеаэами рестрикции Ваш 1 и Ба 1 С 1(условия приведены выше) обрабатывают 8 ед, ДНК-лиэагы в описанных вьппеусловиях, Лигазной смесью трансформируют клетки Е.со 11 ЗМ 103. Из коло 4ний, имеющих 1 ас 7. -фенотип, гибридиэующихся с З Р-меченными зондами,выделяют ДНК и дополнительно анализи 20руют ее с помощью Вар 1, Есо К 1 иРэ 1 1-гидролиза. Структуру рекомбинантной ДНК рРЬ подтверждают модифицированиым методом Максама-Гилберта,Бактерии Е.со 1 д, содержащие плаэмиды рРЬ 581 со вставкой требуемогоразмера, выращивают в 100 мл ЬВ-среды. Для получения целевого субфрагмента 11 с заранее запланированными"липкими" концами 60 мкг ДНК плазмиды рГЬ 581 в 300 мкл буфера 1, содержащего 50 мМ ЯаС 1, обрабатывают40 ед, эндонуклеаэы рестрикции РО 1 с 1ч при 37 С. Целевой фрагмент дли- .,ной 87 нуклеотидных пар выделяютс помощью электрофореэа в 67 ПААГ,П р и м е р 3. Получение ДНК субфрагмента 111, кодирующего аминокислотную последовательность, соответствующую 60-98 аминокислотам челове" 4 Оческого 1 Ь.Аналогично примеру 2 из полинуклеотидов(1 Х-Х 11) субфрагмента 111получают дуплексы для клонирования,После репаративной достройки полинуклеотидов (1 Х и Х) в описанных вьппеусловиях полученный дуплекс обрабатывают 50 ед, эндонуклеазы В 81 11 в200 мкл буфера 1содержащего 50 мМЯаС 1, в течение 2 ч при 37 С, Дуплекс, полученный из полинуклеотидов(Х 1 и Х 11), расщепляют обработкой100 ед, эндонуклеаэы рестрикцииБа 1 СТ в 200.мкл буфера 1, содержащего 150 мМ ЯаС 1в течение 12 ч при37 С, Оба рестрнкта выделяют с помощью гель"электрофореза в 8 Х ПААГ.Реакционную смесь, содержащуюпо 2 пмоль приготовленных дуплексоп 382 6и 0,25 пмоль векторной ЛНл, полученной из рРН 123 совместным расщепле.нием эндонуклеазами рестрикции Ваш Н 1и Ба 1 С 1 (условия приведены вьппе),обрабатывают 10 ед. ДНК-лигазы в описанных выше условиях, Лигазнойсмесью трансформируют клетки Е,со 1,1 М 103, Из колоний, имеющих 1 ас7, -Фенотип, гибридиэующихся с фР-меченными зондами, выделяют ДНК н дополнительно аналиэируют ее с помощью;Вар 1, Есо К 1 и Рэй-гидролиза, Структуру рекомбннантной ДНК рРЬ 912 подтверждают модифицированным методомМаксама-Гилберта,Колонии, имеющие плазмиды рРЬ 912со вставкой требуемого размера, выращивают в 100 мл ЬВ-среды. Для получения целевого субфрагмента П 1 с заранее запланированнымн "липкимиконцами 60 мкг ДНК плазмиды рРЬ 912 в300 мкл буфера 1, содержащего 50 мМЯаС 1, обрабатывают 40 ед. эндонуклеаэы рестрикции Ро 1 1 1 ч при 37 С, Целевой фрагмент длиной 18 нуклеотндных пар выделяют с помощью электрофореэа в 57. ПААГ.П р и м е р 4, Получение ДНК субфрагмента 1 Ч, которая имеет аминокислотную последовательность, соответствующую 98-33 аминокислотам человеческого 1 Ь,Аналогично примеру 2 из полинуклеотидов (Х 111-ХЧТ) субфрагмента 1 Чполучают дуплексы для клонирования,После репаративной достройки полинуклеотидов (Х 111,и ХТЧ) в описанныхвыше условиях полученный дуплексобрабатывают 40 ед, эндонуклеазы рестрикции Бац ЗА в 200 мкл буфера 1содержащего 50 мМ ЯаС 1, в течениео12 ч при 37 С, Дуплекс, полученный иэполинуклеотидов (ХЧ и ХЧ 1), расщепляют эндонуклеазой рестрикции Ба 1 С 1в описанных выше условиях,Реакционную смесь, содержащую по2 пмоль приготовленных дуплексов и0,25 пмоль векторной ДНК, полученнойиэ рРН 123 совместным расщеплениемэндонуклеазами рестрикции Ваш Н 1и АБа 1 С 1 (условия приведены выше),обрабатывают 3 ед, Т 4 ДНК-лигазы вописанных вьве условиях. Лигаэнойсмесью трансформируют клетки, Е.со 11ЗМ 103, Из колоний, имеющих 1 ас Е-фенотип, гибридиэующихся с РЭф-меченными эОидамн выделяют ДИК и Дополнительно анализируют ее с помощью1554382 ет возможность получения разцообраз"цых айалогов природного гена ТТ;2,цо очистить их методом молекулярного клонирования и плаэмидах рРН 123 и рРМ 124, наработать в достаточном количестве и после гцдролцза эндонуклеаэой рестрикции РоК 1 выделить суб 5 фрагменты с уникальными липкими концами, способными направленно собираться в целевой гец 11,-2. Такой прием позволяет избежать трудоемкого и ненадежного последовательного лцгировация коротких олигонуклеотидов в полный дуплекс гена 11,-2,Такой подход не накладывает ограничений на использование определецных 15 кодов аминокислот, Это является дополнительным преимуществом способа, позволяющим осуществить направленную замену кодонов аминокислот, редко используемых у прокаТЬот, Синтезирован ный ген может эффективно экспрессироваться как в прокариотических, так и в эукариотических векторах, Наличие промежуточных субфрагментов гена 11;2 с уникальными липкими концами 25 вано само, по себе, так как открываформула изобретения Рекомбинантцая плаэмидца Структура полинуклеотида Номер фраг- мента Номеролигонуклсотида СССТГСАСССССТАСТТСААССТСТАСАААСАААТАААТССТССАСТТГСАГСТСТСТТТТСТТТСТАСТГСТСГЛТТТАСЛСАТСАТТТ ТСАЛТССААТССССАТГСТТСТААТТЛТТААТТССАТТСАААСССТССАСААСААТСССАЛЛГТСАССАСААТАТСТААААСТТАААТСТГАС САТТСТССТСАССССЛАСААССССАСАСААСТСЛЛАСАТСТСССАГАТСТСТАААСЛСТСААСАТСТТТСАСССЛСАТСТАСААСААСААСТСАААССТСТССААСААСТССЛАААТТТТТССТТТСТССТАЛАТТСАССАСТТСТТССАСАСТТАССТССССТССАСТТААТСТССААТАТСААССТААТССТСТССАСССТТСАСТТССАСТАСАЛТТАССТТСАТАССТСАТСАСССТТСТСАААСААСАТТСАТСТСТСААТАТСТТСТАСААТССТТССТСТСТСАТСАССАТАТТСАСАСАТТТТСТСААСССТТССАТТАССТТТТСТСАААССАТТАТТССТГТССАСТСАТТААСТСАСТСТТСАААТААТССТТТС 1 Ч СоставительТ,Забойкииа Техред М.Ходанич Корректор О. Кравцова Редактор Л.Павлова Заказ 2298/Тираж 386 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Рауаская наб., д. ч/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул, Гагарина, 101 111111ТЧЧЧТЧТТЧ 1111 ХХХ 1Х 11Х 1 Т 1Х 1 ЧХЧХЧ 1 Способ конструирования гена интер- лейкиначеловека, предусматривающий синтез гена интерлейкицачеловека путем ферментативной свивки составляющих его фрагментов и субклонированце гена в составе плазмидной ДНК, о т л и ч я ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения способа, фрагменты получают иэ частично комплементариых полцнуклеотидов при попарцой их репаративцой достройке до полных дуплексов с помощью ДНК-полимеразы 1 Е,со 1-фрагмента Кленова с последующим клонированием полученных дуплексов в составе плаэмид рРН 123 и рР 11124 и выделением фрагментов с запланированными несимметричными липкими концами с помощью эндоцукМеаэы рестрикции Ро 1 1, а субклоцирование гена ведут в составе плазмиды рРН 125, я ЛНК р 11,-2