Способ определения активности полинуклеотидкиназы

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 51) а 01 Н ЗЗУ УДАРСТ 8 ЕН ДЕЛАМ ИЗ НОНИТЕТ ССТЕНИЙ И ОЧН РЕТЕН ИС АВТОРСКОМУ ТЕЛ 3432731/28-1327.04.8230.11,83. Бюл.И.О.Петрусева,(56) 1. 01 с)со ЯСейюадеп Е р 1 а рцг 1 т 1 саС ае )с 1 паве цв 1 сЬгощаСодгарЬ АсСаф, 1978,2. Н 1 сЬага )с 1 паве Югом Е ю 1 СЬ ЬасСег 1 о Ас.йев,1972,ину, а измеря йв В.Р., ШпаеЕ Г.О.,Роппейвоп Т.Е. А га 1 оп от С 4 роЕ 1 пцсЕеоС 1 пд ЬцеаехСтап верЬюовеу - фв 1 осйеа.В 1 орЬув.526, р.410-417,воп С.С. РоЕупцсЕеоС 1 аеввЬег 1 сЬ 1 а соЕ 1. 1 пйесСеа,рЬаде С 4. - Ргос.нцсй.2, р.815-828. ЯО 1057867 А(54)(.57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НОСТИ ПОЛИНжлЕОтИДКИНАЗЫ, в щий взаимодействие дефосфори ного олигонуклеотида с адено трифосфатом в .присутствии ис пробы.с последуюшим измерени личества образуницегося 5 -фо рованного олигонуклеотида, о ч а ю щ и й. с я тем, что, с обеспечения, ускорения и упр способа, аденозин-трифосф вергают взаимодействию с 5-6 олигонуклеотидом, полученный рилированный олигонуклеотид хроматографией на диэтиламин целлюлозе, уравновешенной б раствором хлористого натрия рН .7,5+0,1, содержащим мочев количество продукта реакции ют спектрофотометрически. рованзин- пытуемой ем ко- сфорилит л и .целью ощения ат цод-звеннымфосфовыделяют оэтил- уфернымИзобретение относится к энзимологии и может быть использовано дляопределения активности полинуклеотидкинаэы.Известен способ определения.активности полинуклеотидкиназы, заключающийся в измерении количестваадсбрбированного на стеклянном фильтре радиоактивного кислотонерастворимого продукта, образующегося путемвзаимодействия ГР МАТФ с фрагментированной ДНК тимуса теленка(со средней длиной цепи 150 нуклеотитов) в присутствии полинуклеотидкиназы Г 1 3Недостатком этого метода является высокий уровень Фоновой радиоактивности, обусловленный неспецифической сорбцией на фильтрах избытка. - 32 Р МАТФ,Наиболее близким к предлагаемомупо технической сущности и достигаемому эффектуявляется способ определения активности полинуклеотидкиназы, заключающийся в измерении количества адсорбированного на стеклянном фильтре радиоактивного кислотонерастворимого продукта, образующегося путем взаимодействия в присутствии полинуклеотидкиназыРЗАТФ с ДНК молока лосося, выполняющей роль акцептора ортофосфата. При этом с целью уменьшениянеспецифической сорбции - 2 РАТФна стеклянных фильтрах образовавшийся в киназной реакции радиоактивныйпродукт подвергают последовательно 35кислотному осаждению-центрифугирова-.нию, переосаждению (вновь кислотой),фильтрованию и отмывке кислотонерастворимого радиоактивного продукта отизбытка уРАТФ на стеклянных 40фильтрах 2 ).Этот способ определения активностиполинуклеотидкиназы достаточно надежен, но имеет существенный недоста. ток - он многостадиен и потому трудоемок. Кроме того, способ осуществляется на основе использования радиоактивного препаратау Р 3 АТФ,усложняющего обеспечение безопасностиработы в процессе его выполнения.Цель изобретения - обеспечениебезопасности, ускорение и упрощениеспособа.Поставленная цель достигается тем,что согласно способу определения активности полинуклеотидкиназы, включающему взаимодействие дефосфорилированного олигонуклеотида с адено"эин-трифосфатом в присутствии испытуемой пробы с последующим измерением количества образующегося 5 - 60фосфорилированногоалигонуклеотида,аденозин-трифосфат подвергаютвзаимодействию с 5-б-звенным олигонуклеотидом, полученный фосфорили. -рованный олигонуклеотид выделяют 65 хроматографией на диэтиламинозтилцеллюлозе, уравновешенной буферным раствором хлористого натрия при рН 7,5+0,1, содержащим мочевину, а количество продукта реакции измеряют спектрофбтометрически.Способ осуществляют следующим образом.К раствору динатриевой соли аденозин-трифосфата в буФере трис- НСМ (рН 8,0+0,1), содержащем ионы Мф+ф добавляют раствор олигонуклеотида с длиной цепи в 5-б нуклеотидов, К этой смеси добавляют аликвоту из раствора, в котором необходимо измерить активность фермента, Реакцию ведут при 37 С в течение 10-15 мин и останавливают кипячением 3-5 мин. При разделении продукта реакции применяют хроматографическую микроколонну с ДЭАЭ-целлюлозой, которая представляет собой капилляр со следующими характеристиками:И=40+5 мм, д = 1+0,2 мм, Уравновешинание колонки и градиентную злюцию с заданной скоростью пронодят с помощью микрошпри" ца МШ,а детекцию с помощью микроспектрофотометра МСФП. По площади пиков на хроматограмме определяют количество образовавшегося н процессе киназной реакции фосфорилированного олигонуклеотида и используют его как меру активности. Фермента. За 1 ед, активности полинуклеотидкиназы принято считать такое его количество, которое за 30 мин дает 1 нмоль Фосфорилированного продукта.П р и м е р. Активность фермента измеряют при 37 фС. Измерение производят в следующем порядке.В коническую пробиркувносят 10 Ф 1 мкл 51 мкм раствора динатриевой соли аденоэин-трифосфата (опт. плотность б+1 опт,ед.) в 50+1 мМ буфере трис-НСР, рН 8,0+0,1, содержащем 30+1 мМ МССР. Туда же добавляют 10+1 мкл 6,3 ФО,2 мкм раствора гексарибоаденилата (Ар)б А. Затем вносят аликвоту 5 мкл, отобранную из раствора, в котором необходимо измерить активность Фермента. Реакционную смесь тщательно перемешивают. Пробирку с реакционной смесью помещают в водяной термостат с- 37 вС на 10-15 мин. Реакцию остананливают выдерживанием пробирки с реакционной смесью 3-5 мин при 100 С н кипящей водяной бане. Для анализа реакционной смеси хроматографическую микроколонку с 30-40 мкл ДЭАЭ-целлюлозы уравновешивают 0,00-0,04 М НаСР н 0,01-0,005 М трис-НС 0, рН 7,5 ф 0,1, содержащим 710,5 М мочевину пропусканием через колонку 712 объемов этого раствора. На уравновешенную колонку наносят пробу иэ реакционной смеси объемом 4105 мкл проводят хроматографию вЗаказ 9577/47 Тираж 873 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП Патентф, г. ужгород, ул. Проектная, 4 градиенте БаСФ 0,00 г 0,04-0,26:0,30 М в буферном растворе того же состава что н раньше (при уравновешивании), Суммарный объем элюата 400 ф 20 мкл, скорбсть элюции 15+5 мкл/мин. За ходом хроматографии следят с помощью микроспектрофотометра, измеряющего оптическую плотность при 260 нм. Определяют по площади пиков на хроматограмме количество образовавшегося в процессе киназной реакции Фосфорилированного гексарибоаденилата (рА)6, и это количество используют как меру активности фермента.Активность препарата измеряется в единицах Ричардсона, наиболее широко употребительных для данного фермента (1 ед. активности фермента это:такое его количество, которое за 30 мин дает 1 нмоль фосфорилированного продукта).Прн измерении активности препаратапредлагаемым способом оказалосьчто 1 мкл препарата полинуклеотид киназы способен катализировать образование 33 нмоль 5 -фосфорилированного гексарнбонуклеотида за30 минТаким образом, использование предлагаемого изобретения позволяет значительно упростить процесс определения активности полинуклеотидкиназы, так как исключается необходимость работы с радиоактивными препаратами. Способ позволяет снизить время определения активности фермента примерно в 3 раза.