Рекомбинантная плазмидная днк рук11, кодирующая рестриктазу и метилазу е corii, способ ее конструирования и штамм бактерий еsснеriснiа coli продуцент рестриктазы и метилазы е corii

.2(048)(088.8 Изоброгни, в женерии,бин ан тную аю Есо К 11)ной рекомштамм, с плазмиду метнлаэы. ВКИ С СУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТ ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ(56) Авторское свидетельство СССРВ 1026407, кл, С 120 15/00, опублик.1983,(54) РЕК 01 БИНАНТНАЯ ПЛАЗГИДНАЯ ДНКрУК 11, КОДИРУКЗЦАЯ РЕСТРИКТАЗУ И ИЕТИЛАЗУ Есо К 11, СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИЙ ЕБСНЕК 1 СНФАСОЫ - ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ И ИЕТИЛАЗЫ Есо К 11 1тение относится к биотехночастности к генетической ин и представляет собой рекомплазмидную ДНК, обуславлиинтез рестриктазы и метилазы спрсрб конструирования данбинатной плазмидной ДНК и, держащий эту рекомбинантную - продуцент рестриктазы и Есо К 11. Рестрикционная эндонуклеаза (рестриктаза) Есо К 11 и ДНК-метилтрансфераза (метилаза) Есо К 11 широко ис" пользуются в научно-исследовательской практике (генетическая инженерия, структурно-.шункциональный анализ ДНК(57) Изобретение относится к микробиологии, в частности к технологии рекомбинантных ДНК, и позволяет получить рестриктазу и метилазу Есо К 11 ферментов, используемых. в научно-исследовательской практике. Целью изобретения является повышение содержания рестриктаэы и метилаэы Есо К 11 в клетках бактерий. С этой целью сконструирована рекомбинантная ДНК р 7 К 11, содержащая фрагмент ДНК с полными генами рестриктаэы и метипаэы Есо КП и левый промотор фага лямбда, обеспечивающий эффективную экспрессию генов Есо К 11. Плазмида р 7 К 1 транс- формирована в клетки ЕзсЬег 1 сМа Есо фЯ К 11 не менее 50000 ед. каждого фермента на 1 г сырой биомассы клеток, 3 с.п. ф"лы.С: изучение белок-нуклеинового взаимо- фф действия и др.).Целью изобретения является увеличение содержания рестриктазы и мети- ОО лазы Есо К 11 в клетках бактерий.1. Получена рекомбинантная плаэми-.3да р 9 К, обеспечивающая повышейный синтез рестриктазы и метилазы Есо К 11.:2. Разработан способ хонструирова" ния рекомбинантной плазмиды р 7 К 11, ь в которой гены рестриктазы и метилазы Есо К 11 находятся под левым промотором фага лямбда (Р), что обеспечивает эффективную экспрессию генов рестриктаэы и метилазы Есо КП,3Получен штамм ЕэсЬегсЬ 1 а со 11К, имеющий более высокий.Клетки, прямые, палочковндной формы (1,2-1,6)х(2,0"6,0) мкм, подвиж" грамотрицательные, неспороносные,Культуральные признаки.Клетки хорошо, растут на простых питательных средах.При росте на мясо"пептоином ага-. ре, питательном агаре "Дифко" колонии гладкие, круглые, прижатые, бле" стящие, серые, с ровнычи краями.При росте в жидких средах " мясо-пептонном бульоне, питательном бульоне "Дифко" образует ровную интенсивную мутье Физиолого-биохимические признаки.Клетки растут в пределах 4 - 45 С при оптимуме рН 6,8-7,5. В качестве источника углерода используют многие углеводы, спирты, органичес" кие кислоты, в частности 1-глюкозу, 1-фруктозу, арабинозу, лактозу; трегалоэу. Не усваивает ацетат, аданит, галактоэу. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной н нитратной формах, так и в органической в виде пептона, аминокислот. Нитраты восстанавливают до нитритов. Желатнну не разжижают. Индол не образуют. Уреазная актив-,ность не обнаруживается.Устойнивость к антибиотикам.Проявляют устойчивость к ампициллину, обусловленную наличием плазми",ды р 7 К 11, а также к канамнцину,обусловленную наличием плазмидырС 1857,Штамм Е. со 11 ВКИ СКпроявляет иммунитет к.фагу лямбда. Продуктивность штамма составляет 500000 ед. каждого фермента на 1 г сырой биомассы.Изобретение иллюстрируется следующими примерами.ПримерКлетки бактерий Е. со 1., содержащие плазмндную ДНК, выращивают в бульоне "Дифко" до титра 2 х 10кл/мл. Клетки .собирают центрнфугированнем н из них выделяют ДНК, Полученные пре" параты ДНК плазмиды рЬС 2833 и плазмиды рЧК ЗЭ используют для конструирования плаэмнды р 7 К 11. 2 мкг ДНКплазмиды рЬС 2833 инкубируют с зндо-.нуклеазой рестрикции Рвй 1 (0,5 е),Реакцию проводят при 37 С 1 ч. 3 мкгДК плазмнды р 7 К ЭЗ расщепляют эндонуклеаэой рестрикции Рве 1 (5 е). 3, 1453 М 6 4уровейь синтеза рестриктазы и метиаазы Есо КХХ по сравнению с иэвестныъе штаммами " продуцентами ферментов . ные, с перитрихиапьньии жгутиками,Есо 3.11.А. Плазмида рЩ 1, .кодирующая ре"5. стриктаэу и метиаазу Есо ВХХ состоитиэ ДНК вектра рЬС 2833 (размер кото. рого 2,8 ТПО), содержащего левый про-мотор. фага лямбда (Рь), Рай Х - фраг- Омента ДНК плазмиды рЖ 33, содержащего гены рестрнктазы и метилазы ЕсоВХХ (размер которого 5 ТПО), и имеет. уникальные участки рестрикции для эндонуклеаэ Есо КХ, Ва 1 1, ХЬа 1, расположенные на расстоянии 0,1 ТПО отпромотора Р селективные маркеры АрЙпш,; хозяин ЕвсЬегсЬ 1 а со 11.В Для достижения цели используютсйособ конструирования плазмидной 20ДНК кодирующей рестриктаэу и,метилаэу Есо ВХХ, заключающийся в том,что плазмидную ДНК рЬС 2833 и ДНКрЧК 33 подвергают совместному гидроПизу зндоиуклеаэой рестрикции Рвй 1, 25.Образовавшиеся фрагменты соединяютДНК лигаэой, затем полученной смесьюрекомбинантных молекул трансформируютклетки Е. со 11 С 600 (В+). Трансформанты высевают на среду с ампициллином ЭОи выросшие колонии проверяют на способность рестрнктировать и модифицировать фаглямбда 1 п ттЬо, Из отобраиных трансформантов выделяют плазмидную ДНК, обозначенную как р 7 К 11.В. Для достижения цели получентакже штамм бактерий Есйег.сна со 11ВКИ СК- продуцент рестриктазы .,и метилазы Есо БХХ. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при ИБФМ АН СССР под номером ВКИ СК,Штамм - продуцент рестриктаэы и. Йетилазы Есо 1 ПХ получен трансформацией клеток Е. со 11 3834/рС 1857 45плазмидной ДНК р 7 К 11. Выбор штаммаЕ, соН В 834(рС 857),обусловлен тем,что штамм не содержит интерферируюих с ферментами Есо КП примесей исодержит плаэмиду с геном термочувст Овительного репрессора с 1 фага ляйбда,Содержаний рестриктаэы и метилазцЕсо К 11 в сконструированном штаммеравно 500000 ед, каждого фермента наг сырой биомассы клеток,Штами ЕвсИехсЫа со 1. ВКИ СК 2889 характеризуется следующими признаками;Иорфологические признаки.6 6ную как р 7 К 11 и содержащую в своем . составе трк фрагмента, которые обра,зуются при гидролизе плазмидной ДНК эндокуклеаэой рестрикции Рве 1Выделенную .ДНК р 7 К 11 трансформируют в штамм Е. со 11 В 834/рС 1857 Трансформаиты отбирают на среде, содержащей ампицкплин (50 мкг/мл) и канамкцин (25 мкг/мл). Плаэмида РС 1857 несет термочувствителькую мутацию в гене репрессора С 1, Таким образом можно увеличить транскрипцию, эа счет температурных условий культивирования.Клетки Е. со 11 В 834/рС 1857/р 7 К 11 выращивают при 28 С до плотности 2- 4 10 кл/мл, резко повышают температуру до .42 С и проводят инкубацию в течение 4 ч. Клетки собирают центри" фугировакием, ресуспекдируют в буфере 0,01 М калий-фосфат (РН 7,0), 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанол;0,4 мГ 11 аС 1, разрушают ультразвуком. После разрушения центрифугируют (100000 е, 1 ч, 0 С). Бесклеточный экстракт используют для определения ферментативной активности. Активность .метклазы определяют в реакционной смеси общим объемом 150 мкл, содержащей 40 мМ калий-Фосфат (РН 7,8), 1 мМ ЭДТА, 7 мМ 2-меркаптозтанола, 20 мкг ДПК К. со 11 В 834, 4 мМ 8-аденозила (метил- Н) метконина и 50 мкл5фермента в различных разведениях. Реакцию проводятч прк 37 Сдобавляют равный объем 0,75 Г натркевой щелочи, инкубируют 30 мин прк 60 С. Затем к пробам добавляют 2 мл воды к 2 мл 10 Х трихлоруксусной кислоты. Осажденную ДНК наносят на стекловолокнистые фильтры, прбмывают 0,01 М НС 1 и спиртом. После просушки фильтРов считают радиоактивность. За еди нкцу активности метилазы Есо 211 . принимают то количество фермента, которое в указанных условиях включает 1 пкМ СН - групп в ДНК за 1 ч при 37 С. Активность рестриктазы Есо 1 П 1 определяют в смеси 20 мМ трис-НС 1 (РН 7,5), 1 О мГ ГяС 11, 50 мМ Г 1 аС 1, 1 мкг ДНК плазмщы РВЕ 322 (кз Е. со В 834/РВК 322) и различные разведе ния фермента. Реакцию ведут 15 мин прк 37 С. 1 Родукты гкдролиэа ДНК анализируют в 1 Я агаровом геле. За едкнкцу активности принимают,то количество Фермента рестриктазы Есо К 11, которое необходимо для полного рас 5 145389Пробы после иккубации прогревают прио65 С 10 мин. Продукты гидролиэа ака"лизируют электрофорезом в 13"ном ага- .роэком геле.Соединение фрагментов ДНК йлазиид5проводят в буфере для рестрикции едобавлением АТф и дитиотраитола доконечной концентрации и 5 мМ соответственно и ДНК-лигазы (10 е).Реакцию проаодят 10-,12 ч при 1416 С. Полученную смесь плазмкд используют для трансформации клетокЕ, со 1 д С 600 (Л ). Клетки Е. со 1С 600 (Л+) вносят в 10 мл питательного бульона и выращивают до титра 1 хх 10 кл 7 мл. Клетки собирают центриВфугированием (5000 8, 10 мин, 0"С),суспендируют в 10 мл 0,2 М р"ра СаС 1и выдерживают 1 ч при 00 С. Клетки 20повторно собирают центрифугированием,ресуспендируют в 0,5 мл 0,08 М СаС 1(ОфС) и испольэуют для трансформации.Смесь лигированных фрагментов ДНКкнкубируют с клетками Е, со 11 25В 834/рС 1857, обработанными растворомСаС 1 ,ч при 0 Си 10 мин при комнатной температуре (18-20"С). После.десятикратного разбавления суспензиипитательным бульоном трансформированкые клетки подращивают 2 ч при 28 Си высевают на агаризованную среду самнициллкном (50 мкг/мл). Клетки,выросшие на среде с антибиотиками,проверяют на РестРикцию и модификацию 35фагаЛ системой Есо ЕП,Степень рестрикции фага Л чанг, выращенного на штамме Е, со 11 С 600, оп. Ределяют сравнением титра фага припосеве его на штаммы Е. со 1 С 600 40(Л) и Е. со 1 з. С 600/р 7 КЗЗ и клоны,содержащие рекомбинантные плазмиды.При высеве фага на клоны, содержащиерекомбинантные плазмиды, несущие гены рестриктазы и метилазы Есо ЕП, 45они ограничивают рост Фага по сравне"нию со штаммом,С 600 (Л+) на два порядка, как и на штамме С 600/р 7 КЗЗ. Фаги, выросшие на этих клонах, содержащихрекомбинантные ДНК, высевают на штаммы С 600 (Л+) и С 600/р 7 КЗЗ, фаги, выросшие на клонах, содержащих рекомбинантные плазмкды, несущие геныЕсо К 11, дают одинаковый титр как иаштамме С 600 (Л ), так и на штаммеС 600/р 7 КЗЗ.Из клеток клонов, обеспечивающихрестрикцию и модификацию фага Лчг,выделяют плазмидную ДНК, обозначенаб , 8ого репликацин плазмиды рВК 322 се" лектицные маркеры: Ар, 1 пцо";хозяин - ЕвсЬет 1 сМа се 1.,к1, Рекомбинантная плазмидная ДНК 1 В клФ 7 К 1, кодирующая рестриктазу и,ме- мтилнэу Есо К 11, размером 7,8 т.п.о, нсодержащая ДНК вектора рЬС 2833, раз- смерам 2,8 т,п,о, с левым промотором цифагалямбда (Р) Рвй 1 - фрагмент , 20 рДНК плазмиды р 7 К 33 с геном рестрик- фаТазы н метилазы Есо КП размером Е5,0 т.п.о.; уникальные участки ре- рстрикцик для эндонуклеаз Есо К 1,ХЬа 1, За 1 1, расположенные на рас 1,Редактор Т. Куркова Техред М.ХоданичКоРРектоР М.ПожбюааеюВ ЮЮФЮювэ т е1,Заказ 3335. Тираж 493 , ПодписноеВНИИПИ Государственногр коМитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР33035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно;полиграфическое предприятие, г. ужгород, ул. Проектная, 4 .4538 щепления,мкг ДНК рВК 322 за 5 мннпри 37 фс.Изобретение; позволяет подучить щтемм - продавит Рестриктазы иметипазы Есо. КП с уровнем синтеза в этих ферментов не менее ЬООООО ед.кщкдого на 1 г сырой биомассы клетбк., что в О раэ вьиие уровня синтеза этих ферментов в сравйении с лучппжн из О ,известных штаммов.ГФормулаиз об ре те ния 2. Способ конструирования плазмид- . ной ЛНК р 7 К 11, кодирующей рестриктазу и метилазу Есо Кп, заключающийся в том, что ДИК плаэмидыр С 2833 и, ДНК плазмиды рЧК 33. подвергают гидролиэу зндонуклеазой рестрикции Рвй 1, полученйые рагменты смешивают н соединяют ДНК-лигазой, затем смесью ре- омбинантных молекул трансформируютетки Е. с 1 ь С 600 (Л+), трансфоранты высевйот на среду с амницнлли-. ом и выросшие клоны проверяют на пособность рестриктировать и модифировать фаг лямбда из клонов, котоые рестриктировали и модифицировали.г лямбда со специФичностью системы со КП, выделяют плазмицную ДНК 7 К 11.3. Штамм бактерий ЕвсЬегхсМа соВКМ СК.- продуцент рестрикта" ы.и метилазы Есо К 11.