Способ конструирования рекомбинатной плазмидной днк и штамм продуцент эндонуклеазы рестрикции

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 3(59 С 12 И 15/00 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ М АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт биохимии и физиологиимикроорганизмов АН СССР и НИИ эпи, демиологии и микробиологииим. Н.ф, Гамалеи(56) 1. Авторское свидетельство СССРпо заявке :" 3330201/30-15 (120492),кл. С 12 Я 15/00, 30.07,81.(54) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК И ШТАММПРОДУЦЕНТ ЭНДОНУКЛЕАЗВ РЕСТРИКЦИИ,(57) 1. Способ конструирования рекомбинантной плазиидной ДНК р 1 Ь КЧ 8,заключающийся в том, что среди клоновЕзсЬег 1 сЬха со 11 ВКМ ВД с плаз 801074139 А мидной ДНК р 1 ЬНЧ отбирают клоны, содержащие укороченную на 500-600 пар оснований плазмидную ДНК рХЬКЧ йобладающую генами рестрикции и модификации Есо КЧ и имеющую уникальный сайт эндонуклеазы рестрикции Вд 8 ТЕ, затем выделенную плазмидную ДНК р 1 ЬНЧ д и ДНК фага 3 с 1 875 обрабатывают зндонуклеазой рестрикции Вя 1 11, образующиеся фрагменты сшивают ДНК-лигазой фага Т 4, полученной смесью рекомбинантных молекул ДНК трансформируют клетки ЕзсЬегсМа со 1 х Х С 5183.и из клонов, устойчивых к ампициллину и обладающих иммуните-том к фагу А вь 1 целяют целевую рекомбинантную плазмидную ДНК.2. Штамм ЕзсЬегсЫа со 1 ВКМ ВЯ (Всесоюзная коллекция , Микроорганизмов при ИБФИ АН СССР) , процент эндонуклеазы рестрикции ЕСОИ.ЭеМЮюЬМайМ25 1 1074Изобретение относится к микробио- логической промышленности и генетической инженерии,Фермент К. Есор используют в генетической инженерии, как в экспериментах по конструированию рекомбинантных ДНК, так и при изучении первичной структуры ДНК.Известен способ конструированиярекомбинатной плазмидной ДНК, который основан на обработке двухплазмид эндонуклеазами рестрикции,лигировании .с помощью ДНК-лигазыфага Т 4., трансформации клетокЕ, со 1 смесью образующихся Фрагмен 15тов плазмид, отборе среди трансформантов, устойчивых к ампициллинуклонов, обеспечивающих рестрикциюи модификацию Фага 1 с последующим выделением соответствующей плазмидной ДНК 1.20Известна плазмидная ДНК, коди, рующая синтез эндонуклеазы рестрикции К. ЕсоКЧ, известен соответствующий штамм Е, со 11 - продуцент К, Есор и способ полученияуказанного Фермента,Недостатком известной рекомбинатной ДНК является относительнонизкий уровень синтеза фермента,30относительная нестабильность рекомбинантной ДНК р 1 ЬЕЧ 7 й в клеткахбактерий, что ограничивает возможность ее использования в промышленных условиях.Целью изобретения является способ конструирования рекомбинатнойплазмидной ДНК р 1 ЬКЧ 8, а такжеполучение штамма-продуцента ЕсоКЧи увеличение выхода целевого продукта-фермента эндонуклеазы рестрикции Есор.Для достижения цели в способеконструирования рекомбинатной плазмидной ДНК р 1 ЬКЧ 8,заключающемся втом, что среди клонов ЕясЬег 1 сЬ 1 а 45соя ВКМ ВОД с плазмицной ДНКр 1 ЬНЧ 7 отбирают клоны, содержащиеукороченную на 500-600 пар оснований плазмидную ДНК р 1 ЬКЧ 7 д, обладающую генами рестрикции и модификации Есор и имеющую уникальныйсайт эндонуклеазы рестрикции Вя11,.затем выделенную плазмидную ДНКр 1 ЬКЧ 7. и ДНК фага 3 с 1 875 обрабатывают эндонуклеазой рестрикции 55ф Вя 1 11, образующиеся фрагменты сши-вают ДНК-лигаэой фага Т 4, полученнойсмесью рекомбинантных молекул ДНК 139 ( 2трансформируют клетки ЕясЬегдсЬа со 1 г ,1 С 5183 и цз клонов, устойчивых к ампициллину и обладающих иммунитетом к фагу выделяют целевую рекомбинатную плазмидную ДНК.Для получения штамма-продуцента используют штамм ЕясЬег 1 сЬ 1 а со 11 ВКМ ВД (Всесоюзная Коллекция Микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР) - продуцент эндонуклеазы рестрикции ЕсоКЧ.П р и м е р 1. Конструирование рекомбинатной плазмидной ДНК р 1 ЬКЧ 8 состоит из двух этапов.На первом этапе проводят поиск стабильных вариантов плазмидной рекомбинантной ДНК р 1 ЬЧ 7. Для этого штамм ЕясЬег 1 сЬда со 1 ВКМ ВД, содержащий плазмиду р 1 ЖЧ 7, подращивают в В бульоне в течение 15 ч, после чего высевают на селективную агаризованную среду с ампициллином (ЬВ - бульон содержит 10 г бактотриптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г ИаС 1 рН 7,4 на 1 л воды). Среди выросших клонов отбирают клон клеток, содержащий стабильную плазми. ду,названную р 1 ЬКЧ 7 и сохранивший фе-нотипические признаки штамма Е, со 11ВКМ ВД. Из клеток этого клонавыделяют плазмидную ДНК по методу(С 1 еюе 11 апй Не 11 пяЕу) 1969, РНАЯ62, 1159-1166).Рестрикционный анализ выделеннойплазмиды р 1 ЬКЧ 7 проводят. с помощьюэндонуклеаз Р 11,ВфИ,Есор .На втором этапе в полученную плазмиду Р 1 йЧ 74 вводят область иммуни-,тета фагас промотором ранних генов Рг и термочувствительным репрессором. Для этого выделяют ДНК фагас 1857 по методу (А,Р. Ка 1 яег,Нояпея 0.8. 1960, /, Мо 1 В 1 о 1392-415),мкг ДНК плазмиды р 1 ЬКЧ 7 и4 мкг ДНК фага 3 с 1 857 инкубируют вбуфере А (2 О мМ Трис-НС 0 рН 7,6,10 мМ МС 12,10 мМ дитиотреитола) сэндонуклеазной рестрикции Вд 1 11Гидролиз проводят в течение часапри 37 С, после чего гидролизат проверяют электрофорезом в О,97 агарозе в ацетатном буфере. ФрагментыДНК фага Л с 1857 (2 мкг) смешивают с линейной ДНК плазмидыр 1 РЧ 7 й (О, 2 мкг), добавляют дитиотреитол и АТФ до конечной концентра.ции 10 мМ и 100 мкМ соответственно,39 4по три сайта эндонуклеаз Ндпй 111 иРяг 1.П р и м е р 2. Для полученияштамма-продуцента эндонуклеазы ре.стрикции ЕсоКЧ рекомбинантную плазмидную ДНК р 1 ЬКЧ 8 трансформируютв штамм Е. со 1 С 5183.Клетки штамма Е. со 1 5 С 5183подращивают до титра 2-3 10 кл/мл,8после чего осаждают при 6000 815 мин при температуре ОфС. Клеткисуспендируют в равном объеме О, 1 Мраствора хлористого кальция и выдерживают при ОС 1 ч, после чегоповторно осаждают при 6000 8, ООСи ресуспендируют в 0,1 М растворахлористого кальция.К 50 мкл ДНК, полученной после.обработки ДНК лигазой Фага Т 4,добавляют 100 мкл компетентных клеток. Смесь выдерживают 20 мин прио0 С, затем 2 мин при 42 С и 10 минпри комнатной температуре, добавляют 1,3 мл среды ЬВ, инкубируют2 ч при 37 ОС с аэрацией. Суспензиювысевают на чашки с твердой средой,содержащей ампициллин (30 мкг/мл).Трансформанты отбирают по методу,описанному в примере 1.Сконструированный штамм Е.со 11ВКМ ВД и штамм Е. со 1ВКМ ВД проверяют на продукцию рестриктазы ЕсоКЧ. Для этогообе культуры подращивают в 1 лсреды ЬВ до титра 5 108 клеток1 мл при, 30 С и 3 фС. Клетки осаж-/дают центрифугированием при 6000 я15 мин., после чего по 0,9 г (сырой вес) биомассы каждого штаммасуспендируют в 6 мл буфера 50 мМтрис-НС 8, рН 7,6, 0,2 М БаСТ,3 мМ-меркаптоэтанола, 100 мкг/мплизоцима и выдерживают 40 мин при0 С. Клетки разрушают ультразвуком.Полученный экстракт центрифугируютпри 48000 я, 2 С. Супернатант используют для определения активности Фермента. С этой целью делаютсерийные разведения эКстракта:1/100, 7/500, 1/1000, 1/5000,1/25.000, 1/50000.По 1 мкл каждого разведения инкубируют 1 ч при 37 С с 1 мкг ДНКфага й в 30,мкл инкубационнойсмеси с 50 мМ трис-НС 1 рН 7,6,50,мМ АСС, 10 мМ Мя СР 6 мМ р-мер.каптоэтанолом.Уровень активности ферментаэнцонуклеазы рестрикции Е. со 1 КЧ 40 3 10741и 5 ед. лигазы фага Т 4. Общий объемлигируемой смеси - 30 мкл. Лигирование проводят в течение 1 ч при12 С, после чего добавляют 210 мклНО, дитиотреитол и АТФ до конечнойконцентрации 10 мМ и 100 мкМ соответственно, а также 10 ед. лигазы.Общий объем лигируемой реакционнойсмеси доводят до 300 мкл. Лигирование продолжают при 12 С 48 ч. Черезшестнадцатичасовые интервалы отбирают аликвоту (100 мкл) и трансфор"мируют Са+-клети Е. со 1 х 3 С 5183.Получение компетентных клеток итрансформацию проводят по методу(Совдеп А.И.а.с. У СЬап 8 1972,РЕБАБ БЯА 69: 2110-2114).Трансформанты высевают на селективную среду с ампициллином(30 мкг/мп), предварительно проинкубировав 10 мин с Фагомс 126 израсчета 108 Фаговых частиц на чашку.Выросшие трансформанты проверяютна наличие иммунитета к фагу 1 с1 857. Для этого сравнивают эффективность посевов фагас 1 857 ифага Л 1 (ипш) 21 на клетках Е. со Т ЗС 5183, а также на клетках этого же штамма, не, содержащих рекомби"нантных ДНК.1Из отобранных трансформантывыделяют рекомбинантную плазмидную ДНК РЭЬРМ 8 методом (КТеп Э,Ь.,ЯсЫеяп 8 Е, ИеТТо К.П. 1980РТаяшдй 3,88-93). Полученную ДНК 35анализируют с помощью рестриктазВя 8 1 Т, Ря 1, Нпй 111.На основе данных рестрикционногоанализа построена схема рекомбинатной плазмидной ДНК РЗ.РЧ 8.Полученная рекомбинантная плазмидная ДНК Р 1( ЯЧЗ содержит генысистемы рестрикции-модификацииЕсоКЧ, ген бета-лактамазы, определяющий резистентность клеток к ампициллину, область иммунитета фага Дс термочувствительным репрессоромс 1, ген гех, а также промотор ранних генов Рг. Рекомбинантная -плазмидная ДНК рЭ Рч 8 состоит из 50плазмидной ДНК р 31. РчТй; расщепленной по В 88 11-сайту (размер ДНКплазмиды 5.8 т,п.о.) и Вр 1 11-Фрагмента ДНК фага 3 С 1 85 с размером2.4 т.п.о. Общий размер рекомбинантной плазмидной ДНК рсйч 8 равен 8.2 т.п.о, В ДНК плазмиды имеются два сайта эндонуклеазы Вд111074139 Редактор Л. Письман Техред С,Мигунова Корректор М. Демчик Заказ 9246/4 Тираж 521 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4 в бесклеточном экстракте сконструированного Е.со 1 ВКМ ВД при вьгращивании при 37 С более чем в 5 развцще уровня активности этого же фермента в штамме ВКМ ВД и состанлнет в пересчете на 1 г биомассы сырой вес) более чем 15.000.000 ед. акти 1 ности фермента ЕсоКЧ. При 30 С уровни активности фермента в5 обоих штаммах одинаковы,