Рекомбинантная плазмидная днк, способ конструирования плазмидной днк и штамм-продуцент эндонуклеазы рестрикции

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛ ИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК 119 С 12 К 1/1СВИДЕТЕЛЬСТ К АВТОРЧИК А,С.Соло3 изиологии1 аучноэппдеми 1 очетного ство ССС71,рототип). ГОСУДАРСТВЕННЫИ НОМИТЕ ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И САНИЕ ИЗОБР(21) 3614966/28-13 (22) 25,04.83 (46) 23.12.84, Бюл. Кф 47 (72) А.А.Баев, А.Н.Края=ц, нин, Н.П.Кузь)пш, . А.Ф.Мор Л.И.Глатман и ВЛ.Таняши 11 (71) Институт. биохимии и ф микроорганизмов АН СССР и исследовательский институт ологии и микробиологии им, академика Н,Ф.Гамалеи(54) РГКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗЬПЩНАЯ ДНК р 1 ЖЧ 8 Ь, СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗГПЩНОЙ ДНК И ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ ЭНДОЧУКЛГАЗЫ РЕСТРИКЦИИ ЕСОГУ.(57) 1. Рекомбие 1 антная плазмидная ДНК рПЯ 118 д размером 8,4 тысяч пар оснований состоит из фрагментов ДНК фага лямбда размером 1,73 тысяч пар оснований и плазмидной ДНК рВК 322 размером 4,0 тысяч пар оснований и содержит ген бета-лактамазы, ген 1 ек фага иямбда и находяп)иеся под контролем правого промотора ранних генов фага лямбда Р гены системы рестрикции и модификации Есо КЧ, определяет синтез .эндонукле азы рестрикции Есо 1 Ю.1130602 трансформируют клетки Е.со 1, лизогенные по Фагу лямбда с 1+ и из клонов, устойчивых к ампициллину, выделяют целевую рекомбинантную плазмидную ДНК,2. Способ конструирования рекомбинантной ДНК р 1.ВЧЯа методом генетической инженерии, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что, с целью.увеличения выхода эндонуклеазы рестрикции Есор, рекомбинантную плазмидную ДНК р 1 . ВЧЯ расщепляют эндонуклеазой рестрикции Нпй 111, образующиеся Фрагменты лигируют ДНК-лигазой фага Т 4, полу.ченными кольцевыми молекулами ДНК 3. Штамм ЕзсЬегсЫа со 11 ВКМ ВД (Всесоюзная кол,екция микроорганизмов прн ИБФМ ЛН СССР) - продуцент эндонуклеазы рестрикции Есо ВЧ,Изобретение относится к молеку- точном экстракте белков этого продулярной биологии, биотехнологии и цента - 15 10" ед/г биомассы .13.микробиологической промышленности Недостатком сконструированногои представляет собой рекомбинаптную штамма является относительная его неплазмндную ДНК, способ конструирования стабильность, резко возрастающаярекомбинантной плазмидной ДНК,опреде" с повышением температуры культивичляющей повышенныи синтез эндонуклеаэы роваиия свыше 37 ОС, что сказываетсярестрикции Есо ВЧ (В.Есо ВЧ) и способ иа конечном выходе фермента. В свяконструирования стабильного штамма- зи с этим необходимо проводить кульпродуцента эндонуклеазы рестрикции О тнвирование штамма, содержащего плаз"есо Вч сохраняющего свои свойства при мидную днк, в диапазоне температурдлительном культивировании, 30-34 С. Однако максимальное увеФермент Р Есо ВЧ испоЛьзуется в личение синтеза Фермента достигаетсямолекулярной биологии как в экспери- повышением температуры до 43 С приментах по конструированию рекомби-15 достижении клетками средней логариф.наитных ДНК хп чхго, так и при изу- мической фазы роста. Уровень активчеиии первичной структуры ДНК; ,ности Р.Есо ВЧ в этом штамме недоИзвестей способ получения реком" статочно высок,бииантной плазмидной ДНК р 1 ВЧЯ, Цепью изобретения является увекоторая содержит гены системы рест личение выхода Фермента Б.Есо ВЧ.рикции-модификации Есо ВЧ, находящи- Поставленная цель достигаетсяеся под контролем промотора фага, тем, что сконструирован делеционныйлямбда Р . Уровень транскрипции вариант рекомбинантной плаэмиднойс этого промотора регулируется тер- ДНК.р 1 ЦИЯ, названный р 1 ВЧЯд размочулствительным репрессором С 1, 25 мером 8,4 тысяч пар оснований, котогеи которого локализован в этой жерая состоит из Фрагментов ДНК Фагаплазмиде, Плазмидная ЛНК Р 1.Вч 8 лямбда размером 1,73 тысяч пар осносконструирована с использованием наций и нлазмидной ДНК рВВ 322 размефрагмента ДНК фага лямбда размером ром 4,0 тысяч пар оснований и содер 2,5 тысяч пар оснований (тпо) и 30 жит ген бета-лактамазы, ген гефагасодержащего область иммунитета это- лямбда и находящийся иод контролемго Фага правого проматора ранних генов Фагалямбда Р,. гены системы рестрикцииНедостатком сконструированной и модификации Есо РЧ, определяет синплазмиды рХВЧЯ является ее относи". , тез эндонуклеазы рестрикции Гсо БЧ,тельная нестабильность при индук- Поставленная цель достигается такции экспрессии Р,Есо ВЧ. же тем, что согласно способу конИзвестен штамм-продуцент Р,Есо ВЧ- струироваия рекомбинантной ДНКЕзсЬег 1 сЬа со 1 з ВКМ ВД. Уро- р 1 ВЧЯй методом генетической инженевень активности В.Есо ВЧ в бескле рни, рекомбинантную плазмидную ДНК1130602 10 3р 1 ЬГс 18 расщепляют,эндонуклеазцоц рестрикции Нл.пс 1 111, образующиеся фрагменты лигируют ДНК-лцгазой фага Т 4, полученными кольцевыми молекулами ДНК трансформируют клетки Е.со 1, лизогенцые по Фагу лямбда с 1+ и из клонов, устойчивых к ампициллину, выделяют целевую рекомбинантную плазмидную ДН 1(.Поставленная цель достигается также тем, что используют штамм Е.со 1 х ВКМ КД (Всесоюзная коллекция микроорганизмов при ИБФИ АН СССР), в котором плазмидная ДНК р 1 ВЧЗй максимально стабильна и обеспечивает наибольш)"о экспрессию Р,Есо Вl.Рекомбинантцая плазмцдная ДНК р 1 ЯЧЗд размером 84 тпо (схема плазмидной ДНК р 1 Ь 1 ИЗй представлена на стиг,1) содержит наряду с ге О ном рлактамазы, определяющцлс резистентность клеток к гл " циллину, находящиеся под контролем промотора Фага лямбда Р гены системы рестрикгции-модификации Есо Ю и представля ют собой ДНК р 1 ПЧЗ с делеццей п 9 Нз.пс 1 111 сайтам в области генов фага Л с 1 и гех гСущность способа конструирования ЭО предлагаемой плазмиды р 1 ЬНЧЗд состоит в том, что ДНК цлазмиды р 1 ЬРЧЗ расщепляют,эцдонуклеазой Н 1 пд 111 и после обработки ДНК-лигазой Фага Т 4, кольцевыми молекулами ДНК35 трансформируют кл е тки Е. со 1 х, лиэогенные по Фагу Л с 1 ц отбирают клоны по признаку устойчивости клеток к ампициллину.Отбор клетоксодержащих р 1 с.ссЧЗЬ 40 может быть осуществлен с помощью любого лабораторного штамма ЕэсйегхсЬа со 1, лцзогенного по Фагу Л например, Е.со 11 К 802 (Л); Е.со 11 С 600 (Л); Е.со 1 з. НВ 101 (Л); Е.со 13. ЪГ 3350 (Л), С 5183 (Л).Из отдельных клонов выделяют индивидуальную плазмидную ДНК.В качестве контроля используют трансформацию клеток Е. со 11 3 С 5183, целизогенных по Фагу лямбда, такие клетки делеццонными вариантами плазмид не трансформируются (Фиг,2).Штамм-продуцент эндоцуклеазы рестрикции Есо ВЧ получают трансфор. маццей плазмидной Д 111( р 1 ЬКУЗь штамм Е.со 1,1 С 5183/(рЬС 3, рЬС 14) . В этом штамме плазмидная ДНК р 1 ЬЕЧ 8 Ь максимально стабильна ц обеспечивает повышенный синтез Фермента припостоянной температуре культивирования (Фцг.2),Шталсм Е.со 1 3 С 5183, содержащий плазмцды р 1 ЬНЧЗд, рЬС 13 и рЬС 14депонирован во Всес,оюзной коллекциимикроорганизмов при ИБФИ АН СССРпод номером ВКИ Р=4 Д.Штамм Е,со 1 ВКИ НД характеризуется следующими признаками,Морфологические признаки. Клеткипрямые, палочковидной формы 1,2-1,6;2,0;,6,0 мк, подвижные, с перитрихцальньыц жгутиками, грамм-отрицательные, неспороносные.Культуральные признаки, Хорошорастут на простых питательных средах. При росте на мясо-пептонцомагаре, питательном агаре "Дцфкоколонии гладкие, круглые, прижатые,блестящие, серые, край ровный, мутные, Прц росте в жидких средах:мясо-пептонном бульоне, в ЬВ-бульонеобразуют ровную интенсивную муть.Физиолого-бцохцмцческие признакиРастут в пределах 4-45 С при оптимуме рН 6,8-7,5, В качестве источника углерода используют многие угле-.воды, спирты, органические кислоты,в частности: д.-глюкозу,-фруктоэу,галактозу, арабцнозу, лактозу, трегалактозу, не усваивающцй ацетат,аданцт.В качестве источника азота используют как лгццеральные соли в аммоццйцой ц нцтратной форме, так ц в органической форме ц в виде пентона,аминокислот. Нитраты восстанавливаютдо цитритов. Желатцну не разжижают.Уреаэцая активность не обнаруживается. Ицдол не образуют.Устойчивость к антибиотикам. Проявляет устойчивость к ампициллину.Генетические признаки штамма:1 фЕсо НФ спи Есо цугес ВСэЪсВ,Г , гпу 1, 1 еп 6, рго А 2, Ьз 4,ГМ 1, агд Е, 1 ас 41, да 1 К 2, ага 14ху 1 5, шег, еэх.П р и м е р 1. Конструированиерекомбцнантной плаэмидцой ДНК р 1 ЬНЧ 86.Плазмцдную ДНК рЬКч 8 вьсцеляютиз штамма ВКИ ВД по методу(С 1 еюе 11, Не 1 пе 1 су, 1969, РНАЯ, 62,1159-1163) .2 мкг выделенной ДНК гидролиэуютрестриктазой Нжд 111 в 100 мкл раствора, содержащего 50 мИ трис-НС 1,рН 7,8, 10 мМ МИКСТ , 2 мМ 2-меркаптоэтанола, 20 мИ ИаС 1 при 37 ОС 1 ч.После прогревания реакционной смесипри 65 ОС в течение 10 мин проводятчкольцевание" фрагментов ДНК-ДНКлигазой фага Т 4 в присутствии АТФ(100 мкМ) при концентрации ДНК0,5 мкг/мл (+ 1 ООС, 14 ч) . Смесью образовавшихся модекул трансформируютклетки Е.со 11 .1 С 5183 (Лс 1 ). Получение компетентных клеток штамма итрансформацию проводят по методу(Совдеп Я.М., СЬапр А.С.Х., Нац К.,Ргос. Ба 1. Асад. Бс 1., 118 А 69,2110-2114, 1972). Селекцию клонов,содержащих плаэмиды, проводят на.твердой агаризованной среде в присутствии 30 мкг/мл ампициллина при37 С.Иэ выросших колоний выделяютиндивидуальную плазмидную ДН 1 ускоренным методом щелочного ливиса(В 1.гпЬон Н.С , По 1 у Л. 11 цс 1. АсЫ .Кея., 7, 1513-1523, 1979) и выделенной пйазмидной ДНК трансформируютклетки штаммов Е.со 1 .1 С 5183 иГ.со 1 х 1 С 5183 (ЪсТ+). ПлазмидныеДНК, способные трансформироватьлизогенные штаммы Е.со 1 д,1 С 5183(с 1+) с частотой не менее 10 колоний/мкг плазмидной ДНК, не трансформирующие клетки штамма Е.со 1,1 С 5 183, используют для дальнейшегоанализа, 1130602 бмазы, определяющий резистентностьклеток к ампициллнну, правый промо.тор ранних генов фага .лямбда Р иген этого фага Л (Ма 1-г К.,БсЬнапд М., Сцввхп С.М. СепеСев.,102:319-327, 1982). Лелеционнаяинактивация гена репрессора С 1 всоставе плазмидной ДНК рТЬЯЧЯд приводит к полной инактивации гена10 репрессора С 1,соответственно, к дерепрессии транскрипции с промотораР и увеличению уровня синтезаэндонуклеазы рестрикции Есо РЧ. 15911 Фрагмент р 1 ькч 8 р 1 ькч 8 аппо Вр 11-РяТ 1,3 1,3 20 В, Ря 1-РвС 1 3,8 С Рве 1-Ряе 1 1,6 25Б В 8111-Н 1 чд 111 1,2 Н 1 пд-Гв С 1 0,2 1,2 Ря 1-Нжд 111 0,36 Е30 С,Ндпд 111-Ндпд 111 О, 13 Н Нхпд 111-Вд 11 Е 0,52 0,52Рестрикционный анализ проводят 35 с помощью эндонуклеаз рестрикции Вр П 1, Ря 1, Нпд 111Среди трансформантов отбирают ДНК двух типов; содержащих по одному участку узна- дания для эндонуклеазы Ндпр 111 и по два участка узнавания для этой эндонуклеазы рестрикции. Размеры фрагментов ДНК, образующихся при рестрикционном анализе, представлены в таблице. Плазмидную ДНК с наи большей делецией (потеря обоихНдпд 111 фрагментов.0,560 тпо и 0,125 тпо), названную р 1 ЬВЧЯд, используют для получения штамма-продуцента эндонуклеазы рестрикции 50 Есо Кч.Плаэмидная ДНК рТЬКЧ 8 а, схема которой показана на фиг.1, имеет общий размер 8,4 тпо, состоит из участков ДНК лямбда (1,73 тпо), плазмидиой ДНК рВК 322 (4,000 тпо) и содержит гены системы рестрикции и модификации Есо Кч, ген беталакта 9,0 8,4- размер фрагментов в тпо.П р и м е р 2, Конструирование штамма ЕясЬегхсЬха со 1 д ВКИ КД.Клетки штамма Е.со 1 д,1 С 5183/ (рЬГ 13, рЬС 14) (СТанап Ь, е С а 1. Ч 11, 1 пСегпаЫопа 1 со 11 оцхцш оп ЬаЬогагогу нейодя аког ерЫендо 1 одса 1 яцгчеПапсе р.22, Иегпдротоде 00 К, 1981) подращивают до титра 2-310 фклеток/мл, затем собирают их центрифугированием при 6000 15 мин при 0 С, суспендируют в равном объеме О,1 М СаС 12,. выдерживают при 0 С не менее 1 ч, повторно осаждают клетки при б 0000 С и суспендируют в О, 1 И СаСГ 2 в десятой части исходного объема (компетентные клетки).1 мкг ДНК р 1 ЫЧЯй в 50 мкл раствора 10 мМ трис-НСИ, рН 8,0, 1 мМ ЗДТА смешивают с 100 мкл компетентных клеток, инкубируют 20 мин во130602 8льду, затем 2 мин при 40 фС и 10 минопределяется наличием в шталще - пропри комнатной температуре, добавляют дуценте плазмидной ДНК рЬС 13.1,3 мл 1.В-бульона и инкубируют 2 ч В штамме ВКМ ВД проэеряют уропри 37 С с интенсивной аэрацией. вень синтеза В.Есо Кн нри постоянСуспенэию высевают на агаризованную 5 ной температуре культивирования 37 С.среду с 30 мкг/мл ампициллина Культуру подращивают в 1 л среды(100 мкл/чашку Петри). Схема получе- до 5 10 клеток/мл. Клетки осаждаютния штамма представлена на фиг.2. центрифугированием при 6000 15 лан,Анализ штамма ЕзсЬегсИа со 1 и 0,9 г. (сырой вес) биомассы суспепВКМ-РД. 10 дируют в 6 мл буфера, содержащегоИз отдельных выросших колоний вы мМ трис-НС 1; рН 7,630,2 М ИаС 1,деляют индивидуальную плазмидную 3 мМ 2-меркаптоэтанола, 100 мкг/мл, ДНК и по 1 мкг используют для повтор лизоцима и выдерживают при ОС 40 мин,ной трансформации клеток Е.со 1 д Клетки разрушают ультразвукомЭ3 С 5183 ( Л с 1 ) и Е.со 11 ЭС 5183 15 экстракт получают центрифугированиемСелекцию клонов, содержащих рекомби- при 2 С (48000), Активность В.Есо ВКнантную плазмиду р 11,Вч 8 В, проводят определяют в серийных разведенияхпо резистентностн клеток к ампицил- супернатанта; 1/100; 1/500; 1/1000;лину (30 мкг/мг) . 1/5000; 1/25000 1/50000, 1 мин ДНКСтабильность Фенотнпа, определяе Фагалямбда инкубируют в 30 мкл инкубамого р 11 ВнЯЬ, изучают в клонах, дНК ционной смеси (5 мМ трис-НС 1;, рН 7,6;которых трансформирует Е.со 1 50 мМ ИаС 1; 10 мМ МрС 1 ; 6 мМ 2-мерЛ С 5183 ( Л с 1 ) с частотой 0,5-1 10, каптоэтанола) с 2 мкл йз каждогоа штамм Е.со 11 Ю С 5183, нелизогенныйразведения. Уровень активности эндопо фагу лямбда с частотой 1-5.10, 25 нуклеазы рестрикции Есо ВН в бесклеКлетки отобранных клонов инокулиру- точном экстракте:штамма ВКМ ВД -ют в 10 мл бульона 1.В и растят при около 2010ед. в пересчете на 1 г37 С с усиленной аэрацией до ранней биомассы.стационарной Фазы (2-3 10 клеток/мл) Такии образом, плазмидная ДИК)50-тью мкл клеток заражают повторно Зц р 1 ЬВн 86, содержащая промотбр ранних10 мл 1.В. Процедуру повторяют еще генов Фага лямбда и гены рестрикципраз (всего 3 цикла). На завершающем модификации Есо Вн, определяют повыэтапе делают серийное разведение шенный синтез В.Есо Вн, не зависящийкультуры и высевают на чашки с ага- от температуры культивирования клетокризованпой 1.В-средой, не содержащей З 5 ВКМ 2-4 Д.антибиотика. При проверке 500 коло- Предлагаемый способ конструирований на наличие маркера резистентния рекомбинантпой плаэмидной ДНКности к.ампициллину и способности обеспечивает повьшенный синтез. еограничивать бактериофаг 1 нт, 0нтез рестриктазы Есо ВН за счет транскриппоказано, что утери сцепленных с 40 ции с промотора Р, под контролемплаэмлщой р 1 ЬВНЯ д генетических марЭкоторого находятся гены системы .ре- .керов не происходит, Частоты тран- стрикции-модификации Есо В" в состасформацией лизогенного и нелизогенного штаммов Е.со 1 Л С 5183 плазве плазмпдной ДНК. Эффективностьтранскрипции с последнего не завимидными ДНК, выделенных из десяти не-,5 сит от температуры культивирования.зависимых клонов этой серии частот, Ш амм Гобычно равно 20:1, что характерно4цент специфическои эндонуклеаэыдля передачи несцепленных признаков. Есо Вн бсо обеспечивает повышенный уроСледовательно, плазмидные ДНКр 11.Бн 8 а, РЬС 13, рЬС 14 ведут севень. содержания фермента не менеер и а, Р , р ведут се 20-25 10 ед па 1 г сырого веществабя как отдельные структурные едини- биомассы клеток, что в7 разацы.Впревосходит уровень синтеза К.Есо ВЧв клетках Е.со 1 ВКИ ВД . ЭтотСконструированный штамм Е.со 11 уровень достигается без температурВКМ ВД обе ис ечивает стабильное 55 нои индукции при культивировании.иподцержание плазмиды р 11.Внбь во вре- В штамме Е.со 1 ВКМ ВД наблюцаетсямя длительного культивирования в не- стабильное подцержание плазмидной.селективных условиях. Это свойство ЛНК рИ-ЮВЬ, что позволяет культиви9 1130602 О ровать его в больших обьемах (полупромышленные установки).Таким образом перечисленныесвойства штамма делают его. пригодным для использования как в лабораторных условиях, : так и на промышленных установках. УслФЛЛагаз ИпФШ ДВН ЩЗОДИОЦОЯ Е;ий ООСРЮОЕ гоп к хред,С.йовжий Корр ект тя Тираж 522 Подписноеарственного комитета СССРизобретений и открытййа, Ж, Раушская наб., д, 4/5 лнал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектна Редактор Н.ЯцолЗаказ 297 ВНИИПИ Госуд по делам 13035, МоскНси ВуЫ РюИ НьаВШ8 уЫ Оозащегия: 83 -Р 1 ИР 8 ю 13 -РИАЗ.7 Ф -рИЯ