Способ получения полипептида, обладающего иммуногенными свойствами нв а

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНРЕСПУБЛИК А ц)5 С 15 51 ПИ НИЕ ОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕН(71) Энститю Пастер, Энститю Насьональ де ля Санте э де ля Решерш Медикаль, Сантр Насьональ де ля Решерш Сьянтифик (РК)(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДА, ОБЛАДАЮЩЕГО ИММУНОГЕННЫМИ СВОЙСТВАМИ НВБ Ая ес,э (Р Изобретение относится к области едицины и может быть использованодля получения вакцин против гепатита В.Композиция, используемая для приготовления вакцин, отвечающая изобретению, содержит почти сферические полипептидные частицы (или образована из этих частиц), которые обладают иммуногенными и иммунологическими свойствами, характерными для антигена НВЗ Ая и имеют размеры 18-25 нм, особенно 20-22 мм, и плотности, позволяющие их выделение в интервале плотности 1,20-1,22 г/мм в градиенте плотности на основе СзС 1, и такую степень полной чистоты, что отсутствуют частиОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТО изоБРетениям и отнРытиямРИ ГННТ СССР 80162533(57) Изобретение относится к областимедицины и может быть использованодля получения вакцин, Изобретениекасается композиции, содержащей частицы, имеющие иммунологические свойства, характерные для антигена НВЗА 8.Эти частицы отличаются тем, что содержат также рецептор полимеризованного альбумина человека. Их получаютпутем трансформации человеческих илиживотных клеток вектором, содержащимпоследовательность ДНК, кодирующуюБ- и пред-участки генома вирусногогепатита В, причем данная последовательность ДНК находится под контролем промотора, обеспечивающего эффек- Ятинную транскрипцию данной последовательности в человеческие или животныеклетки, трансформируемые данным вектором. цы Папесса и антигены НВЯ, включая НВС, Предлагаемая композиция отличается тем, что указанные сферические частицы содержат также рецептор полимеризованного человеческого альбумина. В частности, полипептидные частицы, отвечающие изобретению, могут содержать значительные пропорции , поаипептидов, имеющих моп.вес порядка 34000 дальтон, и такие полипептиды составляют по количествуболее 103, предпочтительно более 203 от общего количестваполипептидов указанных частиц.П р и м е р 1. Построение векторов.А, Построение плаэмиды р 873.Плазмида рБЧБ позволяет выразитьБ участок (пред-Б участок и Б ген)под контролем раннего промотора вируса 87 40,Фрагмент Вц 111 2,3 кв выделяют изрСР 10. Плазмида рСР 10 содержит двухзвенный полимер (димер) от головнойдо хвостовой части генома НВЧ. Этотфрагмент начинается с десяти нуклеотидов перед АТС пред-Б участка и завершается 1, 1 кв после стоп кодонаТАА гена 8, Он содержит путативнуюточку полиаденилирования информационной рибонуклеазы (пЫНА) рецептораНВБ Ая, и инициируемую точку транс)крипции гена Б,Используют ранний промотор 87 40,содержащийся в плазмиде РБЧ 2 дрт(АТСС 37145), в котором ген дрт20Е. со 1 слит с РЧцП НпйП 1 фрагмента размером 348 п.о. раннего участка87 40. Этот Фрагмент включает раннийи поздний промоторы иного происхождения, чем репликацйя ЯЧ 40 точку инициирования транскрипции ранних вест-,ников, и 72 основные пары, которыеповторяются последовательно.Фрагмент Вя 111 размером 2,3 квпар оснований от рСР 10 вставляют вединственную точку Нпй 111 плазмидырБЧ посредством связывания концовФрагмента ДНК, которые имеют тенденцию к раскрытию посредством ДНК полимеразы Кленова. После изучения рекомбинантных плазмнд отбирают клон(р 87 Н 44), в котором участок, кодирующий НВБ, ориентирован относительнопромотора БЧ 40 таким образом, чтообеспечивает его выражение. Такоепостроение подтверждается ограничи"тельными картами. Была определенануклеотидная последовательно на стыке двух фрагментов 87 40 и НР 7.Плазмида рБЧБ построена из трехфрагментов, полученных от трех плазмид: Фрагмент 2,5 кв Р 7 ц 1 - Х 1.о 1, полученный от рБ 7 Н 4; фрагмент 1,9 квХЬо 1 Вя 1111, полученный от рСР 10;фрагмент 1,0 ВашН 1, Р 7 ц 1 от рВК 322.Полученная в результате плазмидар 878 (5,4 кв) отличается от рБЧ Н 4отсутствием участка яр и от последовательностей БЧ 40 ДНК, следующихза данной последовательностью, наличием Фрагмента ЕсоК 1 - ВапН 1 плазмиды рВК 322.Б, Построение плазмиды р 878.Фрагмент, содержащий йМг. Плазмиду рНТЧ ЙМг после линейного выравнивания ферментом РЧц 1 частично расщепляют ферментом Нпй 111 с освобождением некоторых фрагментов, из которых один фрагмент 4400 Ьр. (пар оснований) содержит 1,ТК от ИИТЧ, с.ДНК от йЫт, интрон от Ад от БЧ 40, точку полиаденилирования в ранних генах 87 40, фрагмент ЕсоК 1- РЧц 1 плазмиды рВК 322.Фрагмент НВЧ ДНК.Плазмиду рБЧБ фрагментируют посредством РЧц 1, затем Нхпй 111 с высвобождением таким образом фрагмента 4676 п.о., содержащего РЧц 1-Р 7 ц 11 Фрагмент, содержащий источник репликации рВК 322; источник репликации и ранний промотор вируса 87 40; фрагмент Вя 111 размером 2,3 т,п.о. от НВЧ, содержащий участки, кодирующие пред-Б и Б ген, а также сигнал полиаденилирования этого гена; фрагмент ВашН 1 - Нпд 111 плазмиды рВК 322.Лигирование данных фрагментовПосле очистки данные две Фрагмента соединяют по сайтам РЧц 1 и. Нпс 1111 так что восстанавливается устойчивость рВК 322 к ампициллину.В рекомбинантном векторе зоны транскрипции Б участка и гена ЙМг ориентированы в одинаковом направлении и разделены примерно 300 п.о. плазмиды рВК 322.ДНК, кодирующую сМт, получают также от р 872 йМг (АТСС 337146), рБЧЗ ЙЫг (АТСС 37147) или р 875 йЬЕг (АТСС 3 1148) . Расположение гена йЬХг таким образом, что он находится под контролем слабого промотора (1.ТК от ИИТЧ) и гена НВЧ таким образом, что он находится под контролем сильного промотора (раннего промотора 87 40), повышает эффективность экспрессии гена.П р и м е р 2. Трансфекция животных клеток.Перенос и выражение плазмиды рБЧБ ЙЬгг в СНО. Трансформируют клетки СНО ЙЬКг плазмидой р 878 ЙИг, продукт. этих клеток испытывают методом радиоиммуноанализа (КТА) в поверхностном слое клеточных культур. 603 клоновйМг представляет собой НВБ Асф, Скорость синтеза НВЯ А 8 была относительно. низкой между 1 и 20 мг/10клеток в течение 24 ч.1625332 5 10 15 20 25 30 35 40 45 идентична иммунологической силе вак 50 55 Увеличение последовательностейНВБ.Культивирование клонов СНОНВБ Ая в присутствии метотриксате(МТХ), аналога фолиевой кислоты вингибиторе ЙЫт обуславливает увеличение числа воспроизведений генаЙМг, что приводит к увеличению количества Фермента ЙИг,Концентрации МТХ составляют 50,100 или 140 нМ на первом этапе и1,5, 10 или 25 мкмоль на втором этапе.Суммарно отбирают. примерно 150 стойких к МТХ клонов для продуцированияНВБ Ая, при этом увеличение синтезаНВБ Ае в значительной степени меняется от одного клона к другому какна первом, так и на втором этапе.Число копий последовательностиНВЧ на кпетку в различных клонах определяют путем гибридизации целлюлозного фильтра согласно методике сиспользованием в качестве пробы клонированной НВЧ - ДНК, меченой р .Для одинаковой дозы МТХ это числозначительно меняется от одного.клона к другому в пределах от 100 до500.Последовательности НВЧ присутствуют в интегрированной форме,рефоретические профили для разных клоновв основном сопоставимы.Количество специфических РНК последовательностей НВЧ анализируютпутем молекулярной гибридизации, онопропорционально скорости продуцирования НВБ Л. Более того, для одинаковой дозы МТХ (50 нм) количествоспецифических РНК постоянно в различных анализируемых клонах. Выявлено два класса РНК, Один основной2, 1 т.п.о. и другой неосновной2,5 т.п.о. Изучение этих РНК посредством карты Я нуклеазы показывает наличие основного участка инициирования на пред-Б в положении 3157,соответствующем РНК 2,1 т,п.о., идругого неосновного инициирования впромоторе БЧ 40, соответствующего РНК2,5 т.п.о.П р и м е р 3, Анализ частицНВБ АяАнализ осуществляют на частицах,полученных 37 БА 5. Поверхностные слои,соответствующие нескольким сборам встационарной фазе в течение 24 ч,соединяют вместе. Частицы НВЯ Ая.очищают путем двух последовательных ультрацентрифугирований в градиентеплотности СзС 1 с последующим скоростным ультрацентрифугированием,в сахарозном градиенте. Частицы НВЯ Аримеют плотность 1,20. В электронноммикроскопе обнаруживают, что они представляют собой сферические частицысредним диаметром 22 нм, морфологически аналогичные частицам человеческого происхождения . Частиц трубчатойформы не обнаруживают.После диссоциации частиц при100 С в течение 5,мин в присутствииоДТТ полипептиды анализируют методомэлектрофореза на полиакриламидномгеле в,присутствии БРЯ. Гель окрааивают солями серебра. Наблюдают триполосы, соответствующие полипептидам 22 300, 26 100 и 34000 дальтон,Относительная интенсивность скрашивания этих трех полос позволяет определять пропорции трех белков, составляющие 54, 19 и 27 Х, После мечения35 Я метионином в условиях п чтоочищенные частицы подвергают иммунооса:кдению посредством анти-НВЯ сыворотки, а затем белки анализируют посредством электрофореза. На авторадиограмме обнаруживают три описанныеполипептида в тех же пропорциях.Наличие рецептора для рНЯА на поверхности частиц обнаруживают методом радиоиммуноанализа в твердой фазе. Рецепторы обнаружены в поверхностном слое, а также на очищенныхчастицах.П р и м е р 4. Определение иммунизации,После ввода в препарат частиц гидрата окиси алюминия до концентрацииО, 17 этот препарат используют дляиммунизации мьппей Ва 1 Ь/с. Иммунологическая сила клеточных частиц цины от гепатита В, выпускаемого подторговой маркой НВН АСВ (и получаемого из сыворотки люден - доноров ссодержанием естественного НВЗ АВ). 503-ная эффективная доза составляет 0,04 мкг для клеточных частиц и 0,03 мкг для НВНАС (торговая марка института Пастера) .Таким образом, вектор рЯЧБ после интеграции в клеточную ДНК позволяет осуществить синтез и выцеление пустых оболочек вируса НВЧ в форме час тиц 22 нм. Удаление большей части . генома НВЧ и, в частности гена, коди.1625332 ности этих частиц является дополнительным аргументом,для использованияэтой системы при получении вакциныпротив гепатита В. Формула изобретения Составитель Т. ЗабойкинаТехред М,Моргентал Корректор Л. Патай Редактор О. Спесивых Заказ 205 Тираж ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 рующего белок капсид, исключает продуцирование полностью инфекционных вирусных частиц. Этот вектор несет также звено транскрипции гена бурой водоросли йМг, которое после ввода в ЙМг обеспечивает их увеличение в присутствии МТХ за счет увеличения гена.Синтез НВЯ Ая за счет блоков СНО является очень стабильным даже при отсутствии МТХ. И эта стабильность сохраняется в течение шести месяцев, что составляет примерно 300 генераций. В некоторых случаях наблюдается. еще небольшое . самопроизвольное увеличение продуцИруемой НВЯ АяКроме того, изобретение позволяет получить клоны, которые образуют иммуногенные частицы со значительной генетической стабильностью. Частицы НВЯ Ая 22 мм, синтезированные клетками СНО, имеют такую 25 же иммуногенность, как и НВЧ АСВ, .который является препаратом частиц сывороточного происхождения. Скорости продуцирования НВЯ Ая сопоста- вимы со скоростями продуцирования при промышленном использовании.Присутствие рНЯА рецептора на поверхСпособ получения попипептида, обладающего иммуногенными свойствами 11 ВЫ Ая,предусматривающий констру ирование рекомбинантной плазмидной ДНК со вставной части ДНК вируса гепатита В под контролем вирусного промотора, трансформацию полученной ДНК штаммов культивируемых клеток животного, отбор штаммов продуцентов, культивирование, выделение и очистку целевого продукта, о т л и ч а ю - щ и й с я тем, что конструируют рекомбинантную плазмидную ДНК рЯЧЯ ЙМг со вставкой Вя 111 фрагмента вируса гепатита В размером 23 кв под контролем раннего промотора ЯЧ 40, трансформируют полученной ДНК штамм СНО ЙМг, а отбор штамма-продуцента осуществляют в присутствии МТХ в концентрации 50, 100, или 150 нмоль, затем в концентрации 5, 10 или 20 ммоль и блот-гибридизацией с используемой в качестве ДНК - зонда; НВК - ДНК, меченной р.