Векторная плазмидная днк ртк 1285, предназначенная для интеграции чужеродного фрагмента в геном вируса осповакцины, и способ ее конструирования

(56) Авторское У 1354709, кл. Цел ыбо Бюл. Р 13 научно-иссле лекулярной б ко, И.Х.Урма Н. Н.Микрюков ов атель оло в, В.Е. Ч 7.2(088.8) СССР 1985. идетельств 12 И 15/00 к отехноосится инженерии бинатную рацию чуж ала в ген и предлаз миду, родного м виштамм рТК 1из:веЬрагм Рчп 11 -нн ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЭОВ%ТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ аССОф ОПИСАНИЕ ИЗ(54) ВЕКТОРНАЯ ПЛАЗМКЦНАЯ ДНК рТК1285, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ИНТЕГРАЦИИЧУЖЕРОДНОГО ФРАГМЕНТА В ГЕНОМ ВИРУСАОСПОВАКЦИНЫ, И СПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРО(57) Изобретение отлогии и генетическоиставляет собой рекомобеспечивающую интегенетического матерруса осповакцины (В Изобретение относится к генетиче с кой инженерии и биотехнологии, а именно к получению рекомбинантов вируса осповакцины (ВОВ).Целью изобретения является расширение выбора стратегии клонирования чузародного генетического материала в составе ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП.Сконструнрована рекомбинантйая плазмида рТК 1285, содержащая векторную часть, а также нуклеотидную последовательность. ТК-гена ВОВ штамма ЛИВП с полилинкером внутри него. ью изобретения является расширение в ра стратегии клонирования чужеродного генетического материала в составе вируса осповакцины штамма ЛИВП, Новая плазмидная ДНК рТК 1285 состоит из фрагментов генома ВОВ штамма ЛИВП, расположенных на расстоянии 142-736 н.п, и 769-1379 н.п.от Нпй 111-сайта рестрикции К-фрагмента генома ВОВ, полилинкера длиной 80 н.п., содержащего уникальные сайты рестрикции С 1 а 1, Нхпй 111, ХЬа 1, Ба 1 С 1, Вав Н 1, Рчц 11 и Есо К 1, векторной части, имеющей последовательности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2068-4357 н, п., плазмиды рВК 322. Полученная генно-инженерная плазмида характеризуется способностью интегрировать в геном ВОВ чужеродньй генетический материал, например.ген ЧР 1 вируса гепатита А штамма НАЗ 15 с поздним промотором ВОВ Р 11, 2 с,. ф лые Основное требование к выбору полилинкера - наличие уникальных участков узнавания рестриктаз типа 11. Причем участки гидролиза рестриктаз, содержащиеся в составе полнлинкерной области, удаляют из векторной;части и вирусспецифической последовательности.Сконструированная плазмидная ДНК285 размером 3598 н.п. состоит рной части в виде С 1 аа ДНКплазмиды рВК 3222313 н.п., которая является производной плазмиды рВК,322 и не содержит,участка узнавания рестриктаэы Есо К 1.(делеция нуклеотидной последовательности ААСААТТ, полученная в результа 4358 2те последовательной обработки ДНКрВК 322 ферментами Есо КХ и 8гдецифрами отмечены положения крайнихнуклеотидов, а также кодируют ген устойчивости к ампициллину в качествегенетического маркера;фрагмента генома ВОВ штамма ЛИВП,содержащего последовательность ТК-гена от 142 до 1379 н., имеющего только два сайта рестрикции (С 1 а 1 иЕсо КХ),и отличающегося в трех положениях (328 н, 6-ьС, 9 О н, А,1010 н. А-С) от первичной структурыНый 111-1 - фрагмента генома ВОВштамма ЫК с полилинкером плазмидырУК 278, содержащим участки узнаваниярестриктаз С 1 а 1, Н 3.пй 111, ХЬа 1,За 1 61, Ваш НХ, Рчц 11 и Есо КХ.Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рТК 1285 включаетв себягидролиэ Я - нуклеазой Есо КХ -ханеаризованной плазмвды рВК 322 с30целью удаления Есо К 1-сайта рестрикции в векторной части;клонирование Ньп 6111 - К- и .Нхпй 111 - Рчц 11-фрагментов ДНК ВОВштамма ЛИВП; 35гидролиз 8 - нуклеазой НЫй 111- ХЬа 1-линеаризованной плазмиды рТК1708, с целью удалении участков расщепления рестриктаз СХаХ, Нхпй 111и ХЬаХ в векторной и вирусспецифичес". 40кой частях;,лигирование С 1 а 1-Кп 11- и СХаХВзрХ-фрагментов ДНК плазмиды рТК1567 с целью удаления Ртш 11-сайтарестрикции;, клонирование СХаХ-Есо К 1-полилинкера плазмиды рБК 278 в плазмидерТК 1238.Предлагаежй способ конструирования существенно отличается от извес 50ных тем, что с помощью обработкиДНК Я -нуклеазой удаляют природныесайты рестрикции Есо К 1, Нпй 111,ХЬа 1 и Рчи 11 и получают последова. тельность ДНК с метилированным аденином в участке узнавания СХа 1+(27 н,) для штаммов Еесо 11 Ваш -фенотипа, что позволяет ввести полилинкер с уникальными сайтами раацеплениярестриктаз, узнающих гексануклеотид"ные последовательности ДНК, внутрьТК-гена.Сущность изобретения заключаетсяв том, что для интеграции чужеродно"го генетического материала в геномВОВ конструируют плазмидный вектор,содержащий ТК-ген и прилегающие районы Нхпй 111- К-Фрагмента ДНК ВОВштамма ЛИВП, отличающийся тремя нуклеотидами от первичной структурыНпй 111 - Х-фрагмента генома ВОВ штамма 1 И и имеющий только два сайтакрупнощепящих рестриктаэ в вирусспецифической последовательности ДНК,но которым клонируют полилинкер. Искусственно введенные 7 уникальныхсайтов рестрикции используют для кло-.нирования чужеродных генов, которыеметодом контрансфекции интегрируют вДНК ВОВ.Й р и м е р 1,Способ конструированиярекомбинантной плазмидной ДНК рВК 322 ц5 мкг плазмидной ДНК рВК 322 расщепляют эндонуклеазой рестрикцииЕсо К 1 (5 е.а.) в 10 мМ трис-НС 1,рН 7,5; 10 мМ 2"иеркаптоэтанола,0,1 мЖ ЯаС 1; 10 мМ ИеС 1 при 3 С60 мин, как описано. Проводят осаждение ДИК зтанолом и обрабатывают нуклеазой 81 (1 е.а,) и 0,2 мМ ВаС 1;50 мИ ацетата Иа (рН 4,5); 1 мИЕпЗО; 0,5%-ного глицерина при 37 Си 30 мин. Реакцию останавливают добавлением до 50 мМ ЗДТА. После осаждения препарата ДНК спиртом проводятлигирование. Реакционная смесь содержит 5 мкг ДНК 30 е,а. ДНК-лигазы фага Т 4; 50 мМ тряс-НСХ, рН 7,5; 0,5 мИАТР; 10 мМ 2-меркаптоэтанола; 5 мИИ,С 1 . Инкубация проходит от 1 до18 ч при .8 С. После тепловой денатурации белков добавляют до 0,1 мМ БаСХи 5 е.а. Фермента Есо КХ и выдерживают 60 мин при 3 С. ДНК осаждаютспиртом, Далее проводят трансформациюкомпетентных клеток штамма Е.соИНВ 101 и анализ на наличие в плазмидахДНК сайта рестрикции Есо КХ. Одна изколоний, содержащая устойчивую к эндонуклеаэе рестрикции Есо К 1 плазмид"ную ДНК(рВК 322 4, наращивается всреде ЬВ с ампициллином (100 мкг(мл)и тетрациклином (20 мкг(мл). Нлаэмид"ную ДНК выделяют щелочным методом исеквенируют методом Максама-Гилбертаот С 1 а 1-сайта рестрикции, 16401П р и м е р 2. КлонированиеНхпс 1111 - К-Фрагмента генома ВОВштамма ЛИВП.ВОВ штамма ЛИВП растят на культуре клеток ВНКи выделяют по из 5вестному методу. Полученный препарат,. вируса разбавляют четырьмя объемами, ТЕ-буфера и осаждают вирус центрифугированием (40 000 Е, 30 мин, ООС),Осадок ресуспендируют в ТЕ-буфере доконцентрации 10 вирусных частиц на1 мл и проводят депротеинизацню в0,1 мМ ЭДТА; 0,5 Х-ной И-лаурилсаркозината Яа; 100 мкг/мл протеиназы Кпри 4 фС 3 ч. Затем повьппают концентрацию детергента до 4 Е и инкубируют2 ч при 50 фС, Полученный лизат центрифугируют (250 000 8, 15 ч, 18 ОС) вступенчатом градиенте концентраций 20СЗС 1, приготовленном из равных объемов растворов СаС 1 в 1 х ЗЗС, имеющих плотность 1,8 и 1,7 г/см., ЗонуДНК извлекают и диализуют против ТЕбуфера. 25200 мкг вирусной ДНК расщепляютэндонуклеаэой рестрикции НЫЙ 1 П(5 е.а.) в 10 мИ трис-НС 1, рН 7,5;10 мМ 2-меркаптоэтанола; 50 мМ ЖаС 1;1 О мМ МяС 1 при 37 С 60 мин. Электроэлюцией выделяют Н 1 пд 111 - К-фрагментДНК из 0,8 Ж-ного агарозного геля илигируют с Нхпд 111-линеаризованнойплазмидой рВК 322 Ь. После трансформации лигазной смесью компетентныхклеток штамма Е.со 1 х НВ 101 проводятотбор колоний фенотипа "Ар Тс и рестрикционный анализ плазмидных ДНК(рВКНК)П р и м е р 3. Рекомбинантныеплазмидные ДНК рТК 108, рТК 1567,рТК 1238 и РТК 1285Плазмидную ДНК рВКНК подвергаютгидролизу эндонуклеазой рестрикцииРчц 11 в стандартных Условиях и сшивают ДНК-лигазой фага Т 4 по примеруЛигаэной смесью трансформируют компетентные клетки штавща Е.со 1 НВ 101и отбирают колонии, содержащие рекомбинантные плазмиды с Нпй 111 - Рсщ 1150фрагментом ДНК длиной 1708 н.п,(рТК 1708).Плазмидную ДНК рТК 1708 расщепляют последовательно рестриктазамиНЫЙ 111 и ХЬа 1, выделяют большийфрагмент ДНК, который инкубируют снуклеаэой З 1 по примеру 1. Затем пре парат ДНК сшивают ДНК-лигазой фагаТ 4 и проводят трансформацию компе 64 6тентных клеток штамма Е.со 1 НВ 101, Колонии, содержащие плазмидные ДНК, устойчивы к эндонуклеазам рестрикции Ндпс 1111 и ХЬа 1, имеют одну точку разрыва для рестриктазы С 1 а 1 и нарабатывают в среде 1 В, Плазмидные ДНК выделяют щелочньи методом н секвенируют район соединения векторной части и вврусспецифической последовательности ДНК. Плаэмидную ДНК, которую называют рТК 1567, нарабатывают в препаративном количестве и используют на следующем этапе.Плазмидную ДНК рТК 156 расщепляют совместно рестриктазами С 1 а 1 и Рчц 11. Выделяют больший Фрагмент ДНК и сшивают с С 1 а 1-Взр 1-фрагментом ДНК длиной 634 н.п. плазмиды рТК 1567. Лигазной смесью транспортируют компетентные клетки штамма Е,со 1 д НВ 101 и отбирают колонии, содержащие плазмиды, устойчивые к гидролизу рестриктазы, Рц 11 (рТК 1238), а вирусспецифическую нуклеотидную последовательность ДНК определяют методом МаксамаГилберта и проводят сравнительный анализ с первичной структурой Нпй 111- 1-фрагмента генома ВОВ штамма ИК.Описанное последовательное конструирование плазмиды ДНК позволяет получить рекомбинантную ДНК, не содержащую сайты рестрикции ферментов Нхпй 111, ХЬа 1 и Рчц 11, Наличие двух уникальных участков рестрикции в плазмидной ДНК, выделенной из штамма . Йаш -фенотипа, эндонуклеаз С 1 а 1 и Есо К 1 позволяет ввести в ТК-ген полилинкер.Плазмидную ДНК рПК 278 расщепляют ферментами рестрикции С 1 а 1 и Есо К 1 в стандартных условиях, выделяют С 1 а 1-Есо К 1-фрагмент ДНК длиной 80 н.п. и клонируют в плазмиде рТК 1238 по С 1 а 1 и ЕсоК 1-сайтам. Целевую рекомбинантную плазмидную ДНК рТК 1285 отбирают методом ДНК-ДНК-гибридизации и подвергают рестрикционному анализу эндонуклеазами рестрикции, имеющими участки узнавания в полилинкере.П р и м е р 4. Получение рекомби-нантного ВОВ, содержащего ген 7 Р 1 вируса гепатита А штамма НАЯ 15.Плазмидную ДНК рНА 7 23 расщепляют рестриктазами Нпй 11 и Ваш Н 1 в стандартных условиях и выделяют фрагмент ДНК длиной 141 н.п., содержащий Н- концевую часть гена 7 Р 1 ВГА, из 4 Е-но7 164016 го ПААГ после злектроФореза. НЫЙ 11- Ваш НХ-Фрагмент ДНК сшивают с синтетическими олигонуклеотидами П и 111 и Рзй 1-Ваш Н 1-линеаризованной ппаз. мидой рПС 18 с помощью ДНК"лигазы Фаза Т 4. Лигазной смесью трансформируют компетентные клетки штамма Е.со 1 х ХМ 103, Колонии Фенотипа 1 асЕ вырабатывают на среде ХВ. Выделяют, 1 О плазмидную ДНК, чувствительную к рестриктазам Рз 1 и Ваш НХ(рЮС 18- ИЧРХ-НАЧ), и секвенируют от Нхпй 111- сайта методом Иаксама-Гилберта.Плазмидную ДВК рПС 18-ВЧР 1-НА 7 расщепляют эндонуклеазами рестрикции РзСХ и Ваш НХ и выделяют меньший Фрагмент ДНК длиной 155 н.п. Парал- . лельно проводят гидролиз рестриктазами С 1 а 1 и Есо КХ плазмиды рИРЗ ивыделение С 1 а 1-Есо КХ-Фрагмента ДНК протяженностью 546 н.п содержащего поздний промотор Р 44 ВОВ. Фрагменты ДНК длиной 155 и 546 н.п. и синтети.ческий олигонуклеотид 1 лигируют с 25 С 1 а 1-Ваш Н 1-векторной частью плазми ды рТК 1285. Лигазной смесью трансФормируют компетентные клетки штамма Е.СоХх НВ 101 и отбирают колонии ДН:.- ДНК-гибридизацией, Рекомбинантные .мо лекулы ДНК (рТК 1285 - Р,-ЫЧР 1-НАЧ) анализируют рестриктазами С 1 а 1, Есо КХ, РзХ и Ваш ИХ.Плазмидную ДЙК РВАЧ 23 гидролизуют зндонуклеазами рестрикции Вап И 1 иРчи 11. С-концевую часть гена 7 Р 1 ВГА длиной 671 н.п. выделяют из 4 Х-ного ПААГ и сшивают с Ваш ИХ-Рчи 11-линеаризованной цлазмидой рТК 1285- Р -БЧР 1-НАЧ. Лигазной смесью трансФэрмируют компетентные клетки штка Е.со 1 НВ 101Отбирают колонии ДЗП- ДНК-гибридизацией и плазмидные ДНК (рТК 1285-Р-ЧР 1-НАЧ)подвергают реЪванной нлазмидной ДНК опр деляют первичную структуру состыкованных участков методрм Иаксама-Гилберта.ДНК плазмиды рТК 1285-Р -ЧР 1-НАЧ используют для трансФормации клеток почки зеленой мартьппки СЧ-Х, зараженных ВОВ штамма ЛИВП, Урожай вируса после трансФрмации высевают на мо" нослой перевиваемой линии клеток Н 143, В присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина отбирают вирусные ТК- клоны. Методом ДНК-ДНК-гибридизации проверяют наличие гена ЧВ 1 ВГА в кло- нах. Вирусную ДНК клона 809 выделяют по примеру 2 и подвергают анализу рестриктазой Нхпй 111.Таким образом, сконструирована новая рекомбинантная плазмидная ДНК рТК 1285 имеющая расширенный состав уникальных сайтов рестрикции внутри ТК-гена ВОВ (С 1 а 1, НЫд 111, ХЬа 1, За 1 СХ, Ваш НХ, Рчо 11 и Есо К 1), что существенно расширяет выбор стратегии клонирования чужеродных генов. Определена нуклеотидная последовательность ТК-гена и прилегающих районов генома ВОВ штамма ЛИВП, необходимая для рекомбинации с вирусной ДНК. Показаны отличия первичной структуры ТК-генов между штаммами ЛИВП и ИК, На примере гена ЧР 1 вируса гепатита А продемонстрирована возможность использования плазмида рТК 1285 для получения вирусных рекомбинатов. Формула изо бре тения1, Векторная плазмидная ДНК рТК 1285, предназначенная для интеграции чужеродного Фрагмента в геном вируса осповакцины размером 3598 н.п содержвщаяфФрагменты ДНК рВК 322, имеющие последовательности, соответствующие координатам 3-28 н.п. и 2068-4357 н.п. с геном устойчивости к ампнцнллину;Фрагменты ДНК осповакцины, расположенные на расстоянии 142-736 н,п и 769-1379 н.п. от Ный 111 сайта ре- . стрикции К-Фрагмента генома ВОЗ штамма ЛИВП, кодирующие Б- и С-концевые части ТК-гена соответственно:С 1 а 1 - Есо КХ - полилинкерный Фрагмент ДНК плазмиды рПК 278 длиной 80 н.п с участками узнавания рестриктаз С 1 а 1, Н 1 пй 111 ХЬа 1, Яа 1 01, Ваш НХ, Рп;11 и Есо КХ;уникальные сайты рестрикции: С 1 а 1, НЫЙ 111, ХЬаХ, Ва 1 И, Ваш НХ, РчиХХ и Есо КХ;генетические маркеры, ашр" - устойчивость к ампициллину;емкость от 100 до 1,4 тыс. н.п.;штащк-хозяева: штаммы Е.со 1 х Йаш фенотипае2, Способ конструирования векторной плазмидной ДНК рТК 1285, предназначенной для интеграции чужеродного Фрагмента в геном вируса осповакцины, заключающийся в том, что удалением Есо К 1-сайта в плазмиде рВК 322 с помощью нуклеазы 8, полу1640164 Составитель Е. КузнецоваРедактор И.Дербак Техред Л,Олийнык Корректор М,Самборская Заказ 997 Тираж 386 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР113035, Москва, Ж, Раушская наб., д, 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул, Гагарина,101 чают Векторную плазмидную ДНК рВК322, в которую по Бпо 111-сайту клонируют ТК-ген вируса осповакцины, штамма ЛИВП в составе Нхпй 111-К-фрагмента вирусного генома, в полученной5плазмиде рВВНК делетируют Рчи 11- фрагмент, содержащий часть Нпй 111-К- фрагмента ДНК вируса осповакцины ичасть ДНК плазмиды рВВ. 322 Ь, содержащий структурную часть гена устой.чивости к тетрациклину, после чего изполученной плазмиды рТК 1708 с помощью.нуклеазы Я удаляют.Нпй 111- и1ХЪа 1-сайты рестрикции в полученной плазмиде рТК 1567 делетируют ВзрХРчп 11-фрагмент ДНК длиной 328 н.п.,содержащий С-концевую часть вирусспецифической последовательности ДНК,с помощью лигирования линеаризованной С 1 а 1-Рчц 11-плазмидной ДНК сС 1 а 1-Взр 1"фрагментом вирусной ДНКразмером 643 н.п., по Ясо КХ-СХа 1сайтам полученной промежуточной плазмиды рТК 1238 встраивают Есо КХ-С 1 аХ"полилинкер ДНК р 11 К 278, и получают, целевую рекомбинантную плазмиднуюДНК рТК 1285.