Векторная плазмидная днк polya15, предназначенная для клонирования чужеродных генов в клетках еsснеriснiа coli и bacillus spp., и способ его конструирования

,БО,(51)5 С 12 Я 0 ЕТЕН ВИДЕТЕПЬСТВУ ОРСК едователькробиолоФ-л Изоб назначеннных фрагмбактерий,данной пла д то логии, в женерии, ликонную щую спосоваться в ках ЕвсЬе змиды зобудобнове емого объекта создание болевектора на редлавляетс етенияого "чел очно ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ П 1 НТ СССРОПИСАНИЕ И(71) Всесоюзный научноисслский институт прикладной ми гии(54) ВЕКТОРНАЯ ПЛАЗИИЦНАЯ ДНК р 01 ЛА 15,ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯЧУЖЕРОДНЬ 1 Х ГЕНОВ В КЛЕТКАХ ЕЯСНЕР 1 СНХА СО 1,1 И ВАС 1 Ы,ЦБ ЯРР., И СПОСОБЕГО КОНСТРУИРГВАНИЯ(57) Изобретение относится к генетической инженерии и связано с цельюполучения нового бирепликонного вектора. Сконструирована бирепликоннаяплаэмида, предназначенная для клонирования Фрагментов чужеродной ДНК вклетках ЕясЬег 1 сЬ 1 а со 11 и 5 различных видов Вас 111 ця ярр. Для этогоплазмиду рИС 19 подвергают частичномугидролизу эндонуклеазой Нра 11, плазмиду рВС 16 расщепляют эндонуклеаэойЕсор 1, липкие концы фрагментов до 1тение относится к биотехночастности к генетической ини представляет собой биреп,. векторную плазмиду, обладаюбностью стабильно поддержи- автономном состоянии в клетгдсЬа со 11 и бацилл и пред . 7 896 А страивают до. тупых с помощью фрагмеита Кленова ДНК-нолимеразы 1, затемлигируют друг с другом, смесью молекул трансформируют штамм Е. со 1, И 483 и отбирают клоны с Фенотипом Тс 1,Ащр", 1.асЕ, содержащие бирепликоннуюплазмиду, Из трансформантов выделяютплазмидную ДНК, проводят рестрикционный анализ и отбирают плаэмиды минимального размера, Одна из отобранныхплазмид имеет мол, м. 4,2 т,п.о.,которую обозначают р 01,7 А 15. Она сос"тоит из участка плазмиды рИС 19 размером 1,7 т.п.о ограниченного Нра,11-Фрагментами размером 404 и 34 п.о,и содержащего последовательностього Ч, ген 1 ас Ес полилинкернойпоследовательностью, включающей сайты для 10 рестриктаз (ЕсоЕ 1, Бас 1,4Крн 1, Бша,. 1, Ваш Н.1, ХЬа 1, Ба 1 1,Ряг 1, ЯрЬ 1, Н 1 н 1 111), Вторым компонентом гибридной плазмиды являетсяЕсор 1-фрагмент плазмиды рВС 16, несущий ого Ч этой плазмиды и ген резистентности к тетрациклину Тс раэ-.мером 3,1 т,п.о. Полученная гибридная плазмида стабильно наследуетсякак в клетках ЕвсЬег 1 сЬ 1 а со 1, таки в клетках Вас 11 оя ярр. 2 с,п,клонирования чужерожНК в клетках этих особ конструированиякоторого может быть осуществлено клонирование чужеродных фрагментов ДНКкак в клетках Е,со 1 ь, для которойприемы генетического манипулированиянаиболее отработаны, так и в бактериях большинства видов р. Васг 11 цв,Удобство в работе с этим векторомсвязано с небольшим размером его(4,.8 т.п.о,), доступностью для клонирования 10 участков узнавания различных эндонуклеаэ, включая одновременное наличие Есо К 1 и Н 1 пй 111 " сай. 1тов, наличием маркеров резистентности к тетрациалину и воэможностьюиспользовать в качестве хозяев Е.со 1 х, В.гЬцг 1 пВгепвгв, В.сегецв. В,вцЬй 1 ав, и В.шееаСегьцш,.П р и м е р 1, ДНК плазмид рНС 19и рВС 16 выделяют следующим образом,.Культуры клеток Е.со 1 г ЧМ 83, содер 20жащих рИС 19 и .В. вцЬгг 1 гв, несущихрВС 16, выращивают в 15 ил среды 1.В(триптон 10 г, дрожжевой экстракт5 г, БаС 1 8 г, вода 1 л), дс концалогарифмической фазы роста. Клеткиосаждают центрифугированием (5000 я,5 мин, 2 С), ресуспендируют в 0,5 мллизирующего раствора (лизоцим 2 мг/мл,ЭДТА - Ва 10 мМ, глюкоза 50 мМ,трис-НС 1 25 мИ, рН 80), Через 5 мин30инкубации суспензии на ледяной банепри температуре 0-2 оС прибавляют1 мл раствора, содержащего 17. додецилсульфата натрия (БОБ),и 0,2 ц.ВаОН, и лизат осторожно перемешивают, 35Затем вносят 0,75 мп ЗМ БаСН СООН,лиэат перемешивают и вьдерживают 1 чпри 0-2 С. Клеточные остатки удаля"ют цеитрифугированием (10000 я,15 мин, 2 С), К супернатанту добав" 40ляют 2,5 объема охлажденного до-20 С этилового спирта и через 2 чинкубации при -20 С выпавший осадокДНК собирают центрифугированием5000, 5 мин), ДНК растворяют. в 450,9 мп воды, прибавляют О, 1 мл 3 МИаСН.,СООН, рН 7,0 и снова осаждаютэтиловым спиртом. Эту операцию повторяют еще раэ, осадок ДНК слегкадодсушивают потоком воздуха и раство"50ряют в 0,2 ил 10 мИ трис-НС 1, 1 мМЭДТА, рН 7,52 мкг ДНК плазмнды рВС 16 расщепляют рестриктазой Есо Й 1 (3 ед,), в40 мкл буфера следующего состава: 55100 мМ трис-НС 1, 50 мИ ИаС 1, 10 мИМцС 1 г, 1 мМ дитиотрептол (ДТТ), рН7,5. ДНК плазмиды рИС 19 (пять образ" цов - по 2 мкг) гидролизуют эндонуклеаэой Нра 11 (1 ед; 0,2 ед, 0,04 ед,0,008 ед. и О,ООО 16 ед, на образец)в 40 мкл 10 мМ трис-НС 1, 10,мМ.МЕС1 мМ ДТТ, рН 7,5. Реакции ведут 1 ч .при 37 С и останавливают прогреваниемоинкубационной смеси при 65" 70 С втечение 10 мин, Анализ полноты гидроолиза проводят с помощью электрофореза.Для достраивания ("затупления")липких концов Есо КТ - фрагментовДНК рВС 16 и Нра 11 - фрагментов ДНКрИС 19 фрагменты (пл 2 мкг) смешиваюти обрабатывают в 40 мкл инкубационнойсмеси, содержащей 50 мМ трис-НС 1,рН 7,2, 10 мИ МБО, 1 мИ ДТТ,50 мкг/мпбычьего сывороточного альбумина,4 нмоль каждого ИМАТР (ИМАТР, ЙСТР,ВСТР, дТТР и 2 ед. фрагмента КленоваДНК-полимеразы 1, Реакцию ведут втечение 1 ч при комнатной температуре и останавливают добавлением 2 мкл0,5 И ЭДТЛ, Затем проводят депротеи-,низацию смесью фенол - хлороформ иосаждают ДНК.2,5 объемами спирта(-20 С, 12 ч),Есо К 1 - фрагменты ДНК рВС 16(1,5 мкг) и фрагменты ДНК рИС 19(1,5 мкг), полученные в результатеее частичного гидролиза Нра (средняявеличина фрагментов 1-2 т.п,н,), сое"диняют с помощью ДНК-лигазы фага Т 4в среде, содержащей 50 мМ трис-НС 1,рН 7,5, 25 мМ ИаС 1, 10 мМ ИяС 1 г,10 мИ ДТТ, 0,5 мМ АТР, 20-40 мкг/млДНК, 1-2 ед/мл ДНК-лигазы фага Т 4,Смесь вьдерживают при температуре-4 С в течение 4-16 ч, затем снижаютконцентрацию ДНК в 5-10 раз и продолжают инкубацию в течение 12-24 ч,Эффективность соединения фрагментовДНК контролируют электрофаретическиманализом, оЛигированной ДНК трансформируютобработанные СаС 1клетки Е.со 1 г1 И 83 или клетки аналогичного штамма,имеющего такие генетические характерисипж, как В (1 ас рго), Ргга Р 36,рго АВ, 1 ас 1", 2 М 15. Са -клеткиЕ.со 1 г получают следующим образом:0,1 мл ночной культуры вносят в 10 млсреды 1 В и вырашивают при температуре 37 сС со встряхиванием на качалкедо титра 3 1 О кл/мл. После охлаждения культуры на ледяной бане (О С,10 мин) клетки центрифугируют (5000 я,10 мин, 00 С), суспендируют в 1 О млБ 1476896 60,1 М СаСи нь)акиваю) 1 ч. Клеткибуфер. Этот же буфер используют и приповторно центрифугируют (5000 последующей отмывке протопластов и10 мин, С) затем ресуспендируют приготовления разведений протопласв 05 мл О 1 ) СаС 0 С. На следую- тов, Зля трансформации берут в рабощнй день О, мл Са ф -клеток смешиваютту 0,5 мл суспензин полученных прото"с 0,05 мп ДНК (10 мкг/мп), инкубируют пластов, смешивают с ДНК, растворен-.1 ч при температуре ОС и 5 мин ной в ЯММР буфере,н добавляют 1,5 мппри температуре 42 С и затем перено- полиэтиленгликоля (ПЭГ). После разсят в пробирку с 1,5 мп среды ЬВ. 1 О бавления в 5 мп БММР буфера клеткиПосле 2 ч инкубации в этой среде при центрифугируют и ресуспендируют в37 С со встряхиванием клетки высева мл ЯММР буфера. Через 1,5 ч суспенют на чашки с индикаторными (Ьас) зию высевают на чашки Петри со средойсредами, содержащими тетрациклин ДМЗ. Чашки инкубируют при температурео(15 мкг/мл). В качестве индикаторных 5 37 С в течение 2 сут, Колонии, обрасред используют среду Мак-Конки или зованные.регенерировавшими протоплассреду с Хца 1 (5-бром-хлор-индо-тами, перекалывают на ЬВ-агар, дополлил- -галактозид). Ьас -клетки форми- ненный тетрациклином (15 мкг/мл). руют на этих средах, темно-красные Частота трансформации составляет окои синие колонии соответственно. Коло" 20 ло,20%нии, имеющие такую окраску; перекалы" Получают протопласты В, СЬигпрдепвают последовательно на агаризованную з 1 з айаг. де 11 ег).а 69/б и трансформисреду ЬВ, содержащую тетрациклин руют их ДНК плазмиды рОЬ УА 15 следу(15 мкг/мл) и ампициллин (100 мкл/мл), ющим образом: ночную культуру развои агаризованную среду ЬВ с тетрацик дят в 20 раз в среде 0,15 (на 10 л линам (15 мкг/мп). Чашки инкубируют Н 10 трнс-основание 150 г,КС 1 430 .мг,ов течение 18 ч при 37 С. ИН.С 1 12,5 г, ИаС 1 725 мг, Ма 80Из клеток клонов с фенотипом ОН,О 3,75 г, РеС 1 4 НО 6,25 мг, Тс Ьас Ар выделяют плазмидную ДНК, сахароза 513-5 г, йосле автоклавироВыделенную ДНК и ДНК плазмид рИС 19 ЗО вания добавляют 100 .мл 1 ОЕ"ного дрож. и рВС 16 обрабатывают рестриктазами жевого экстракта, 100 мп О, 1 М Есо К 1 и Нра П и анализируют с по- КНРО 100 мп 2 М МеС 1 и 50 мл 402- мощью электрофореза в агарозном или ной глюкозы), Подращивают культуру полиакриламидном геле. В качестве при температуре 32 С до оптической маркеров размера ДНК используют плотности 0,7 ед (550 нм). Клетки Есо Е 1 Нпс 111 и Есо Е 1+Ндпс 111 - центрифугируют (3000 д 15 мин) и фрагменты ДНК фага и Есо В 1 - фраг-, ресуспендируют в 1/10 первоначально- менты ДНК плазмиды рВК 322, После го объема среды О,5, содержащей отбора кпонов с плазмидами, имеющими 5.мг/мп лизоцима,Культуру инкубируют минимальный размер (около 48 т,л.н.): в течение 60 мин при температуре40 0проводят также анализ структуры 37 С, затем протопласты собирают цен этих,плазмид с помощью других рест- трифугированием (3000 я 20 мин) и риктаз, в частности рестриктаз сайты ресуспендируют в 1/50 первоначального которых входят в полилинкерную пос- объема среды 0,15. К О, 1 мл плазмидледовательность рИС 19. ной ДНК, растворенной в среде О, 15П р и м е р 2. Проверку возможно- добавляют0,5 мп суспензии прото 45сти репликации плазмиды рОЬ УА 15 в пластов, а затем сразу же 1,5 мп клетках бацилл проводят следующим 40%-ного раствора 11 ЭГ. После тщаобразом, тельного перемешивания смесь разбавПолучают компонентные клетки ляют в 5 мл среды О, 15, Протопласты В.зиЬг 1 з и трансформируют их ДНК 50 собирают центрифугированием и ресус плазмнды рОЬ А 15. Отбор трансфор- пендируют в 2 мл среды 015. Образцы мантов проводят на чашках с агари- переносят на поверхность 1 -ной агазованной средой ЬВ, содержащей тет- ризованной среды 0,15 и инкубируют рацнклин (15 мкг/мл). Частота транс-3 ч при температуре 32 С. Для регеформации составляет 10 . 55 нерацни протопласты переносят вПолучают протопласты В.шеяаегмш. 04%-ную агаризованную среду О, 15 и КМ и трансформируют их ДНК плазмиды высевают на поверхность той же ореды, рОЬ УА 15. Для этого используют ЗММР содержащей .1 агара и тетрациклин1476896 Составитель С.ДикаревРедактор Л.Павлова Техред А.Кравчук Корректор С.Черни Заказ 3331 Тираж 492ПодписноеВНИИПИ Государственного комитетапо изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Иосква, Ж, Раушская наб , д. 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,10(20 мкг/мл). Частота трансформации1 О -10Из клеток В,Ьцгщз.епвв чаг.Ва 11 ега 69/б (рОЬУА 15) в клеткиВ,тЬцгщепвв чаг, Кцгвг.а 1: Ю".враг " плазмиду рОЬУА 15 передают путемтрансцепции при совместном культивировании донорского и реципиентногоштамма, Для этого исходные. жидкиекультуры по 0,2 мп засевают на чашкиИПА и культивируют в течение 18 чпри температуре 37 С. Ресуспендируютполученную совместную культуру в1 мл среды до конечного титра 10 кл//мл. Эысевают полученную суспензиюдо 0,2 мл на чашки с ИПА, содержащие100 мкг/мл стрептомицина и 20 мкг/млтетрациклина. Аналогичным образомпоступают при передаче плаэмидырОЬУА 15 "нэ В.ЬцгпВепв 1 в чаг.КцгвгаИ Ю 1 В.сегсцв 968 ННЧастота переноса около 10 ,Для определения автономного состояния плазмнды рОЬ УА 15 в бациллах,иэ клеток трансформантов и трансципиентов выделяют плазмидную ДНК и проводят ее электрофоретический анализ,В качестве контроля используют ДНКплазмиды рОЬ УА 15.30Стабильность поддержания плаэмиды. рОЬУА 15 в клетках бацилл определяют;по величине процентного содержаниятетрациклинрезистентных клонов транс формантов и трансципиентов после ихвыращивания в неселективных условиях. 35Полученные штаммы не утрачивают плаз,миду рОЬ УА 15 в течение 60 генераций,П р и м е р 3, Для конструирова"ния гибридных плазмид на основерОЬ УА 15 ДНК этой плазмиды гидролизуют одной из рестриктаз, сайты которых находятся в полилинкерной последовательности, и объединяют путемлегирования с фрагментами. чужероднойДНК, Лигированной ДНК трансформируют 45Са -клетки Е,со 11 ЧМ 83 или аналогичного штамма, как описано в приме,ре 1. Отбор трансформантов с рекомбинантными плазмидамн ведут по Тс"Ьасффенотипу. Формула изобретения1, Вектор на я ли аз мил нля ЕШК р 01 ЛА 15,предназначенная для клонирования чужеродных генов .в клеткахЕвспег 1 спа со 11 и Вас 11 цв врр.,размером 4,8 т,п.о., содержащаяучасток плазмиды рИС 19 - 1,7 т,п,о.,фланкированный Нра 11-фрагментамчразмером 404 и 34 п.о с последова"тельностью ого Ч, необходиМой длярепликации плазмиды, геном 1 асЕи полилинкерной последовательностью,включающей сайты для 10 рестриктаз,пригодные для встраивания фрагментовчужеродной ДНК;Есо Н 1-фрагмент плаэмиды рВС 16,несущий ог Ч этой плаэмиды и генрезистентности к тетрациклину, размером 3, 1 т,п,о., емкостью до10 т.п.о.уникальные сайты рестрикции:ЕсоК 1,Бас 1, Крп 1, Бша 1, ВашН 1, ХЬа 1,Ба 1,1, Рз 1, Брй 1 и Н 1 пй 111;генетические маркеры: ген устойчивости к тетрациклину-Тс , ген устойчивости у ампициллину-Ашр ", генЬасЕ, емкостью до 10 т.п,н,2. Способ конструирования вектор- .ной плазмидной ДНК рОЬУА 15, заключающийся в том, что ДНК плазмиды рВС 16расщепляют эндонуклеазой ЕсоК 1, ДНКплазмиды рИС 19 подвергают частичномугидролизу эндонуклеазой Нра 11, лип"кие концы Есо К 1 и Нра 11-фрагментовзатупляют с помощью фрагмента КленоваДНК-полимеразы 1 и сшивают в результате обработки ДНК-лигазой, затемсмесью молекул трансформируют штаммЕ.со 13. ЧИ 83, проводят селекцию клонов с бирепликонными плазмидами пофенотипу иэ трансформантов с такимфенотипом, выделяют плазмиды, осуществляют их рестрикционный анализи отбирают плаэмиду с минимальныиразмером 4,8 т,п.о,