Способ получения комплексного соединения платины (ii) с н днк, обладающего противоопухолевой активностью

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 175472 А 15/00; А 61 К 31/29 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯПРИ ГКНТ СССР ПИСАНИЕ ИЗОБ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ ТЕНИЯ 12(46) 15,08.92, Бюл. М 30:-(57) Изобретение касается комплексных со- (71) Институт физической химии им. Л.ВЛи- единений платины (2+), в частности получесаржевского и Киевскйй государственный ния комплекса соединейия платины (2+) с институт усовершенствований врачей - . н-ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислотой), (72) И;И.Волченскова, Н.Н.Майданевич, обладающего противоопухолевой активно- Л.И.Бударин, С.Н,Копытин, С.А.Шалимов, стьв, что может быть использовано в ФарЕ.П.Трохименко и Л.В.Кейсевич: . мацевтической промйаленности, Цель - (56) Блохин Н,Н., Переводчикова Н.И, Хими. повышение активности и снижение токсичноотерапия опухолевых заболеваний, М.; Ме- сти целевого продукта, Синтез последнего ведицина, 1984, с.95-100. . дут реакцией цис-дихлордиамминплатины сВестник АМН СССР, 1986, М 12, с.79- н-ДНК (выделенной из селезенки крупного 83., .рогатого скота. марки А) при их молярномАвторское свйдетельство СССРсоотношении 1,5:1 и 78 + 0,5 ОС в среде воды %2570960 кл. С,07 Р 15/00,1973,(15 мин), В этих условиях полученный компАвторское свидетельство СССР лекс в сравнении с йзвестным Р-ДНК имеетЬ 2581026, кл, С 07 Р 15/ОО, 1979.токсичность ЛДво 66 мг/мг и: ЛД 1 оо - 100Координацйонные соединения в меди-мг/кг против 31,8 и 84 мг/кг, при обеспечецине. Киев: Наукова Думка, 1986, с.120-174, нии 1 ООф-ной степени выживаемости на 10 Авторское свидетельство СССР:. ый день при дозе 17,1 мг/кг с большей М 1685944, кл. С 07 Г 15/00, 1987, степенью угнетенияроста опухоли (94 про- Я (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСНО- тив 84 Я 3 табл.ГО,СОЕДИНЕНИЯ ПЛАТИНЫ (И) С н-ДНК, . Изобретение относится к способу получения нового комплексного соединения платины, обладающего противоопухолевой активностью,Цель изобретения - получение нового йлатиноорганического комплексного соединения с более высокой активностью и более низкой токсичностью по сравнению с известными противоопухолевыми препаратами.Способ получения соединения РОН. ДН К заключается в том, что предварительно нагретые до температуры плавления н-ДНК водные растворы н-ДНК и цис-дихлордиамминплатины (П) (ДДП), гидролизованной до заданной степени превращения, смешивают при молярном соотношении Рт; Р = 1,5;1 и термостатируют при той же температуре дб окончания реакции.Температуру плавления н-ДНК определяют иэ спектрофотометрической кривой плавления.Нативную ДНК растворяют в воде при комнатной температуре и нагревают в термостате.Гидролиэ ДДП проводят в воде, соблюдая режим нагревания, обеспечивающий за5 10 Способы получения охарактеризованыследующими параметрами; выбором концентрации исходных растворов ДДП и н- ДНК, степенью гидролиза ДДП, молярным 15 соотношением РсР, временем и температурой проведения реакции.Из данных табл.1 (опыты 1 - 4) видно, чтовыбор исходной концентрации ДДП в интервале 2520-1200 мкг/мл позволяет пол учить продукт с параметрами,характерными для предлагаемого соединения Р 10 Н-ДНК, Снижение исходной концентрации ДДП приводит к отрицательному результату (опыты 5-7). Из зависимости 25 А макс растворов ДДП от концентрации препарата следует, что при концентрации меньшей, чем 1080 мкг/мл, резко изменяется степень гидролиза ДДП, что и не позволяет получить целевое. соединение платины с 40 соотношение РсР = 1,5;1, Отклонение от соотношения Рт:Р = 1,5:1 не позволяет пол 50 55 данную степень гидролиза, которую контролируют по электронному спектру в области250-350 нм, характеризуемому максимумомпоглощения, А макс, изменяющимся в интервале 273,5-276,7 нм, с ошибкой 0,5 нм ис максимальным моля рным коэффициентомэкстинкции Емас = 110 + 10 л моль смОкончание взаимодействия н-ДНК и гДДП контролируют спектрофотометрически по достижению параметров УФ-спектрапоглощений 1 макс = 265,7 + 0,1 нм и Езб 5,7= 10000 + 100 л моль смПредлагаемое вещество получают вводном растворе или в индивидуальном состоянии. В последнем случае образующийся в результате реакции аммонийхлористый и избыток воды удаляют лиофильной сушкой,П р и м е р 1; На спектрофотометреЯресогд М 40 с использованием держателякюветы, снабженного блоком управлениятемпературой, и программы измерений;обеспечивающей линейное возрастаниетемпературы, определяют Т 1 л н-ДНК. Регистрируют экстинкцию как функцию температуры в диапазоне 60-95 С при градиентетемпературы 1 С/мин. Применйемая дляполучения предлагаемого соединения нДНК имеет Тпл - 78,0 + 0,50 С,Растворы 405 мг цис-Р 1 О 2(МНз)2 в 250мл воды (концентрация 1620 мкг/мл) и 330мг н-ДНК в 250 мл воды концентрация 1200мкг/мл), приготовленные при комнатнойтемпературе, каждый в отдельности, помещают в термостат и равномерно повышают 3температуру до 78,0 + 0,50 Ссо скоростью .1 С/мин как при плавлении н-ДНК. Реагенты смешивают в молярном соотношенииРсР = 1,5;1, тщательно перемешивают итермостатируют при той же температуре в .,течение 15 мин,П р и м е р 2, Опыт проводят как впримере 1, только реакционную смесь подвергают лиофильной сушке по методике изготовления сухой плазмы крови. 4Раствор соединения РсОН-ДНК при постоянном вращении охлаждают до .40 С втечение 40 мин, а затем выдерживают приэтой температуре 12 ч, После этого температуру повышают до -20 С, образец откачиваютвтечение 40 ч, нагреваютдо 40 Сисноваоткачивают 26 ч. Полученные после лиофильной сушки соединения Р 1 ОН-ДНК вдальнейшем хранят в закрытой стекляннойпосуде в холодильнике или на воздухе, Выход целевого продукта РсОН-ДНК практически соответствует теоретическому.Для экспериментальной проверкипредлагаемого способа получения соединения Р 10 Н-ДНК было проведено 19 опытов, восемь из которых показали положительные результаты. В положительных опытах получен продукт, Уф-спектры которого имеют параметры, характерные для предлагаемого соединения.Результаты опытов сведены в табл,1, где приведены характеристики полученных продуктов в зависимости от способа их получения. ДНК. Таким образом, интервал исходной концентрации ДДП обусловлен тем, что максимальная концентрация ДДП ограничена ее растворимостью в воде при 20 С, а минимальная - величиной, ниже которой резко изменяется степень гидролиэа ДДП, Эта величина равна 1080 мкг/мл.Выбор концентрации н-ДНК обусловлен выбором концентрации ДДП и необходимостью соблюдать моля рное учить целевое соединение с вышеуказанными параметрами (опыты 8 и 9),Результаты.опытов 10-13, приведенные в табл.1, указывают, что взаимодействие ре агентов протекает быстро и заканчивается за время, не превышающее 5 мин. Увеличение времени термостатирования реакционной смеси до 30 мин не влияет на параметрыпродукта реакции,Температура проведения реакции существенмо влияет на такой параметр продукта реакции как Е 2 б 5,7, На это указывают результаты опытов 14-19. Из зависимости Е 255,7 от температуры видно, что для получения предлагаемого соединения Р 10 Н-ДНК термостатирование реакционной смеси надо вести при 78,0.ф. 0,50 С. Отклонение от температуры больше, чем в указанном пределе, не дает возможности получить продуктс необходимыми параметрами УФ-спектра.Опытами установлено, что заданнаястепень гидролиза ДДП обеспечивается нагреванием водного раствора ДДП в опреде; ленном режиме.В табл,2 приведены характеристикиспособа гидролиза и полученного в результате продукта гидролиза ДДП.Гидролиз проводили при разных исходных концентрациях ДДП и в разных режимах нагревания. В первых шести опытахнавески ДДП растворяли в воде при 30 С ираствор нагревали до 78;0 + 0,5 С в термостате в том же режиме, как и нагревалий-ДНК, т,е.со скоростью 1 С/мин в течение48 мин, Результаты этих опытов показывают, что указанный режим нагревания обеспечивает получение продукта с заданнымиЛизка и Емакс для растворов с исходнымиконцентрациями ДДП 2400, 1800, 1200 и1080 мкг/мл (опыты 1-4). Понижение исходной концентрации ДДП (опыты 5 и 6) непозволяет достигнуть заданных параметровУф-спектра.В опытах 7 - 14 навески ДДП растворялив воде, нагретой до 78,0 .ф. 0,5 С, и полученные растворы выдерживали в термостатепри этой температуре в течение 3-10 мин.Из результатов, приведенных в табл,2, и зависимости Лот времени видно, что необходимые параметры спектров,соответствующие заданному интервалу степени гидролиэа ДДП, также достигаются,если ДДП растворять в горячей воде (температура 78,0 .ф. 0,5 С) и раствор термостатировать в течение 5 - 9 мин,Приведенные выше данные позволяютзаклачить, что смешение предварительнонагретых до температуры плавления н-ДНКводных растворов н-ДНК и гидролиэованной до заданной степени цис-дихлородизмминплатины ( 1) при молярном соотношении1,5:1 и термостатировании смеси реагентовпри этой температуре в течение времени,необходимого для окончания реакции, позволяет получить соединение, характеризуемое формулойЦРт ОН)СКМНз)(Н 20)ИРтС 1(ИНз)(НгО)Д 4 )хх,и -ДНК,где и =2000 1. 100; рс -ДНК=(СзН 51 Озай 15 РФ, с описанными физико-химическими свойства. ми. Отклонение от вышеуказанных параметров способа получения: интервала исходных концентраций ДДП и н-ДНК, степени гидролиэа ДДП, соотношения реагентов итемпературы проведения реакции, недает воэможности получить предлагаемое соединение с указанными характеристиками,П редлагаемое соединение РсОН-ДН К как индивидуальный препарат представляет собой мелкокристаллический порошок желтого цвета. Оно устойчиво в водных растворах и в твердом виде, способно длительное время храниться на воздухе при комнатной температуре и в холодильнике без изменения свойств. Состав и строение соединения Р 1 ОН-ДНК определенй на основе химико-аналитических и физико-химических йсследований растворов и твердых образцов,10 15 Элементный анализ твердого образцаподтверждает состав синтезированного целевого соединения РйОН-ДНК.Найдено, : Р 38,97; О 7,38; С 15,53; й 20 9,83; Н 7,17; Р 2,98,Вычислено, ; Рт 38,19; О 6,95; С 15,27;И 9,59; Н 4,05; Р 2,97.Измеренная вискозиметрическим методом молекулярная масса соединения 25 РЮН=ДНК составляет 6,0 10 дальтон, Исходя иэ молекулярной массы соединения Р 1 ОН-ДНК и массы мономерной единицей этого полимера, имеющей эмпирическуюформулу30аГ;(ОН)СОМНзХН 2 О)МВСЕНзуо)2 Ъ х х (С 39 Н 51 ОЖЙ 15 Р 4)можно рассчитать среднестатистическую 35 величину и в соеАиненйи, Онз равна2000 + 100. Следовательно, е среднем на 2000 нуклеотйдных квартетов ДНК, состоящих из пар арбенин-тймин, гуанин-цитоэин.приходится примерно 4000 комплексных ча стиц (Рт(ОН)С(МНзХН 20 Н и 8000 комплексных частиц (Р 1 С 1)ЙНзХН 20)3УФ-спектр поглощения соединенияРтОН-ДНК, полученного в водном растворе и выделенного индивидуально, характери 45 эуется максимальным поглощением при265,7 нм, а свободная н-ДНК максимально.поглощает свет. при 258,0 нм. Молярный коэффициент поглощения РфОН-ДНК, рассчитанный на моль нуклеотида, Е 2 вт,5 10000 50 л моль" см 1 (у свободной н-дНК Е 25 в 7000 л моль см ),Длинноволновоесмещение максимума поглощения, ЬЛ макс, на 7,7 нм у соединения РтОН-ДНК по сравнению с н-ДНК говорит об образовании ковзлент ных связей между атомами платины (И) идонорньми атомами азотистых оснований биомакромолекулы. Длинноволновое смещение в УФ-спектре соединения Рт-ДНК, Ммакс, составляет 10,8 нм. Более низкаявеличина М мкс для РОН-ДНК по сравнению с ЛАмакс для Р 1-ДНК указывает, чтоковалентные связи между металлом и основаниями ДНК в предлагаемом соединениив среднем слабее, чем в соединении Рт-ДНК, 5Повышение интенсивности поглощения дляР 1 ОН-ДНК, составляющее 30 говорит отом, что присоединение металла к ДНК вызывает сильные конформационные изменения ее двухцепочечной структуры, 10УФ-спектр соединения Р 10 Н-ДН К, полученного в растворе, и его идентичность спектрураствора, приготовленного из твердого образца, свидетельствует об одинаковой химической природе соединения РОН-Д-К, 15образующегося в растворе и выделенного втвердом виде, Об этом же говорят одинаковые результаты биологических испытаний,Растворимость кристаллического образца РОН-ДНК в воде при 20 С, составляющая 0,0075% (75 мкг/мл), показывает, чтомаксимально достижимая концентрацияР 1 ОН-ДНК при растворении твердого соединения в 35 раз ниже максимально достижимой концентрации соединения, 25полученного в растворе, Низкая растворимбсть индивидуального вещества свидетельствует о его кеобратимойдесольватации при выделении в кристаллическом виде, что обуславливает необходи- ЗОмость использовать его в виде суспензияпри биологических испытаниях.Водный раствор Р"ОН-ДНК практически не проводит электрический ток, что свидетельствует о том, что при растворении 35соединение не подвергается электролитической диссоциации.Изменение в ИК-спектрах соединенияР 1 ОН-ДНК по сравнению со свободной ДНКсвидетельствует о наличии химических связей между атомами платины ) и атомамикислорода фосфатных групп, В ИК-спектрахимеются полосы при 1060 и 1220 см, соответствующие валентньцл колебаниям группы-Р;-,о, полосы в области 1500 - 1700 см, 45соответствующие валенткым колебаниямгрупп С=С, С=К, С=О азотистых оснований,полосы в области 3100 - 3700 см, соответствующие валентным колебаниям С-Н, И-Н,О-Н, входящих в состав ДНК и молекул воды. Кроме того, при 340 см наблюдаетсявалентное колебание Р 1-С, при 1340 смдеформационное колебание координированной молекулы ИНз, при 3295 см - валентное колебание координированной 55гидроксильной группы,По данным термогравиметрии соединение РтОН-ДНК теряет молекулы воды только при нагревании до 200 С. Высокая температура удаления молекул воды свидетельствует об их прочном связывании в соединении.Данные элементного анализа, вискозиметрии, кондуктометрии, УФ- и ИК-спектров поглощения подтверждают, что синтезированное соединение действительно высокомолекулярное вещество - поли(бисгидроксохлороамминакваплатина ( )тетракисхлороамминдиакваплатина (- р -дезоксирибонуклеат формулыР тСКОНХ НзХН 2 ОВРС (ИНзХН 2 ОИО;- ,и -ДНКгде и =2000 +100.В табл,З представлекы результаты испытаний токсичности и противоопухолевой активности известного соединения Р 1-ДНКи предлагаемого соединения РОН-ДНК, пОлученного в растворе и выделенного в индивидуальном состоянии. Опыты проводили на мышах и крысах обоего пола разведения питомника "Столбовая".Токсичность изучали на группах животных из половозрелых нелинейных мышей массой 30,0 + 2,0 г, прошедших карактин 20дней в каждой группе по 10 животных). Препараты вводили трехкратно внутрибрюшинко с интервалами в 2 ч в виде водногораствора или водной суспензии объемом 0,5 мл. Суммарные дозы составляли 34,0; 68,0 и 84,0 мг/кг, Количество животных, погибших в каждой группе, отме 1 вли через 24 - 48 ч посге введения препаратов, Расчет токсической дозы, ДЛы, проводили по методике, летальную дозу, ЛД 100, определяли эксгериментально,Установлено, что для Р 1-ДН К ЛД 5 о -- 51,8 мг/кг, ЛД 1 оо =84,0 мг/кг, для предлагаемого соединения Р 1 ОН-ДНК ЛД 5 о = 66,0 мг/кг, ЛД 1 оо = 100 мг/кг независимо от формы введения, Из сравнения приведенных величин следует, что токсичность РОН-ДНК ниже, чем токсичность соединения Рс-ДНК,Согласно гистологическим исследованиям гибель животных, получивших токсические дозы препаратов, обусловлена их энтеротоксичностью.Противоопухолевую активность каждого из препаратов оценивали из экспериментов, проведенных на четырех группах животных (в каждой группе по 10 животных). Опыты проводили дважды,Белым беспородным крысам массой 150-200 г под кож бедра трансплантировали 2 10 - 2 10 клеток перевивногоВ, 0штамма лейкоза Швеца, Животныегруппы служили для контроля, Животные ;и Ч групп получали соединения Рт-ДНК и РтОНДНК в растворе или в суспензии соответственно, Препаоаты вводили внутрибрюшинно трехкратно на 4-6 сут после трансплантации опухоли, второй и третий раз с интервалом в 1 сут, Суммарные дозы составляли 17,1 мгlкг.Противоопухолевую активность оценивали по выживаемости животных(ВЖ, Оь) на десятые сутки после перевивки опухоли, по обьему опухоли (Ч, см 1) и степени угнетения роста опухоли (Т/С), Расчеты производили по формуламвж(у,):А 100где А - число животных на десятые сутки после трансплантации опухоли;К - число животных в данкой групп 6; Ч (смз) = 4/3 л В,в 1+аг+щз2 3где в 1, в 2 и вз - три взаимно перпендикулярных измерения опухолевого узла, где Чкон, и Чоп. - обьем опухоли в контрольной группе и в опытной соответственно.Результаты экспериментов обрабатывали статистически. Вероятностная сшибка Р 0,05,Анализ данных, представленных в табл,3, показывает, что введение соединения РтОН-ДИК обеспечивает 100"-ную выживаемость животных, Вместе с тем, оно тормозит рост опухоли на 94",ь по сравнению с контролем. Сравнительный анализ данных, приведенных в табл.3, позволяет заключить, что предлагаемое соединение РтОН-ДНК обладает лучшей эффективностью, чем известное соединение Р 1-ДНК, так как, не уступая ему по такому показателю как выживаемость животных, превосходит его по уровню степени угнетения ростаопухоли на 107 ь, Кроме того, оно менее токсично, чем известное вещество.5 Таким обоазом, создание новоо высокомолекулярного соединения платины сДНК привело к получению вещества с ценными свойсгвами; противоопухолевой активностью при малой токсичности, По этим10 показателям предлагаемое соединение выгодно отличается от соединения Рт-ДНК,превосходя или будучи сопоставимо с ним, по показателям физиологической активности, Такой комплекс свойств делает предла 15 гаемое соединение перспективным вкачестве основы для создания препаратов,"эффективных для лечения злокачественныхопухолей,Дополнительным преимуществом пред 20 лагаемого противоопухолевого веществаявляется обеспечение их возможности продолжить ряд платиносодержащих противоопухолевых препаратов и тем самымобеспечить преодоление эффекта привыка 25 ния организма к платиновым противоопухолевым средствам,Формула изобретенияСпособ получения комплексного соединения платины (11) с н-ДНК, обладающего30 противоопухолевой активностью, взаимодействием цис-дихлорориамминплатины сдезоксирибонуклеиновой кислотой (выделенной из селезенки крупного рогатогоскота, марки А) в воде при нагревании до35 780 н 05 С, отл и ч а ю щи й с ятем, что,с целью получения соединения с более высокой активностью и более низкой токсичностью цис-дихлородиамминплатину и ДНК,используют в молярном соотношении 1,5:140 и процесс ведут в течение 15 мин,О ОООО О Чф 4 Оам оооо -ч о ооооо лй аааааа 11 33 3 1 ЭФ л 1 с хВщщ Вщщ Фщ тщщ Ещ11 1 ЯкЙ с "3В 1 ЭСф1Э2 ОМ а ю р 5 ОЭ 38ВщщВВ ВВаааа л лВ ВВВ Ваааа Л Л Вщ Лщщ Вщщ Зщщщ фщ а ас 0- 8ЭС 2 3 Х 3 6 1 ЧСОаО О Ф л л л ам о О 1 ЛЛЛО лао лсо лао л л л л л л л л л Ф Ф 3 бщ Э: щ 3 3. Л"-Л Ч (Ч Ч счЧ Ч (ЧОЪ Л л л 0 Ф Ф-Ф 3 ОЛ. Ч Ч Ч сч Ч Ч Ч1%3" фа У1- Х ИЭ М л1:йФУ1 ХФ:Х оооо оооо Ч Ч Ч Ч Омао омаО офО Ф ооооо оосоо о о л ч о ч ч ч о о о ООО (Ч Ч Ч оооо О ОЪ Ч В 4 (Ч -3 "О сО О О Ч Вщ Вщщ ещщ Воо Ч (Ч 3, 13 1л 11О оо оо а О О О О О м О О О О сч чеч О а со а о о 0 О ф ч м со о О со в О 1 о о аоао о о В- О 1 О ОЪ О 1 В-" В- О ОЪ О ОЪ В-л ф л л О ОО В- О л ао л со л л л л л л Л Л ВЩ Л Л ВВ Л Л Л Л Л ЛЛ Вщ Е Л Л Л а а а а Ф -Ф и 0 0 а а а а а и и и а и О 0 0 ЧО сО ъО Ч, ъо 0 О 0 0 О 0 0 0 О 0 О СЧ Ч Ч Ч Ч Ч СЧ (Ч Ч СЧ Ч Ч (Ч Ч Ч (Ч Ч (Ч (Ч аии ОООООООаа а ч ммммм ао ао ао ф ао со со ао ао ф ф ао ао .:3 и о л в Л Л Л Л Л Л Л Л Л Л Л Л Л Л Л Л Л Л1 1 1 1 11 11111 111 1 11 11754722 Таблица 2 Опыт Характеристика условий гидролиза Характеристика степени гидролиза еКонцентрация исходного раст" вора ДДП,мкг/мл е т щи Режим нагреванияВремя нагреваниямин ЛмасеЕнд. нм л моль см Скоростьнагрева"ния,С/мин Темпера"турныйинтервал,па Таблица 3 Группа животных Показатель 111(введено соединение РСОН-ДНК,полученноеиндивидуально 1 11 (введеносоединение Рс-ДНК) Введенная доза, мг/кг 5,7 хЗщ 17, 1 5,7 хЗф 17, 1 57 хЗ 17,1 Токсическая доза,ЛД", мг/кгЛетальная доза, ЛДмг/кг 66,0 66 О 51,8 84,о 100,0 100,0 100 Выживаемость на десятые сутки, Ж (ВЖ) 100 100 0,95+0,05 Объем опухоли,смз (Ч) 15,00+0,80 2,4010,12 1,0 ОЮ,05 Степень угнетенияроста опухоли,Т/С, ь 84 Составитель О,Смирнова Редактор Н.Киштулинец Техред М.Моргентал Корректор Э.ЛончаковаЗаказ 286 б Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101 щ 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 2400 1800 1200 1080 600 240 1800 1800 1800 1800 1800 1800 1800 1800 30-7830-78 .ЗО30" 78ЗО 7878787878787878т 11 1 л 1 1 :О 0 0 0 0 0 0 0 48 48 .48 48 48 48 3 4 5 6 8 9 10 276,5 275,2 273,8 273,2 269,0 266,1 297 6 286,0 278,0 275,3 275,3 г 76;о, 277,2 278,1 110 115 110 120 125 1 г 3 118 120 .119 111 112 110 108 110