Способ получения антигенной детерминанты вируса спид

(72) Роберт АНТИ т СПИДа на осно". й защите человек Изобретелогии и медзовано для биотехноыть испольител СПИДа крови челоких жидкосотноситсяе и можетружения ансыворотке менекия белк и м е р. По одирующую ос первых 14 амип ледовательностьатки 15-512 (все, ноконцевых остатего вирус ромеов) огиче а или друг гена яая, в зают из рекомбиактиче иммунопр х, а такж ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТПРИ П(НТ СССР Бюл, Р 15 нн-Ля Рощ унд Ко.,Митчел Краул и Дэру Янг(56) Сгою 1,К.е а 1. НТ 1.Чепчргойася яупгЬея 1 гей тп Е.со 11 агегесорп 1 кед Ьу апг 1 Ьойхя ргеяепг пяего А 10 Б рагтепгя Перг. Ио 1. Сепег.НоНвап.а-Кос 1 те Кея Серег. Иаг 1 еу,М 707110, ПБ , Се 1.1, 1985, 41, Ф 3,р, 976-986,(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕННОЙДЕТЕРКШАНТЫ ВИРУСА СПИД(57) Изобретение относится к биотехнологии и медицине, и может быть использовано для обнаружения антителСПИДа и его вирусов в сыворотке крови человека или других биологическихжидкостях, а также к иммунопроилактической защите человека от СПИДа на. основе применения белка, Сущностьспособа состоит в том, что последовательность ДНК, кодирующего остатки 15-512 (все, кроме первых 14 аминокислотных остатков) гена яая, вырезают из рекомбинантного шагового клона %НХВ 3 и связывают с экспрессионной плазмидой Е.со 11 рЕЧ-чгй 2 для получения плазмиды рЕЧ 2/рад 15- 5 12, Последовательности, ДНК, соответствующие аминокислотным остаткам 319-331 епч, удаляют из экспрессионной плазмиды рГЧЗ/епч 44-460 путем направленного затравкой мутагенеза для получения плазмиды рЕЧЗ/епч 44- 64 Д 319-331, Направляемый затравкой мутагенез проводят на плазмиде рЕЧ/ /епч 44-640 Д 329-331 и получаютплазмиду рЕЧЗ/егч 44-640 Д 319-331 6514-524. Фрагмент рестрикционной эндонуклеазы гена епч из плаэмиды рЕЧ/епч 44-640 Д 319-33 Д 514-524, кодирующий остатки епч 467"640 Д 514- С 524 и епч 467-640 Д 514-624, связывают с фрагментом рЕЧ 2/дар 15-512 и получают в результате гибридный ген, кодирующий остатки Ка 8 15-436 и остатки епч 467-640 Д 514-524 в плазмк ф де рЕЧ 2/рад 15-436/епч 467-640 Ь 514- р 524. На каждой стадии конструирования плазмиды репродуцируют путем трансформации в штамме Е,со 11 МС 106 1(рКК 248 с 1 гя).1644720нантного Фагового клона Я НХВи На каждой стадии конструированиясвязывают с экспрессионной плазмидой плазмиды репродуцируют путем трансФорЕ.со 11 рЕЧ-чг 12 для получения плазми- мацни в штамм Е.со 11 ИС 1061ды рЕЧ 2/8 а 8 15-512. (рВК 248 с 1 Ез),Последовательности ДНК, соответст"вующие аминокислотным остаткам 319- Общая методика получения рекомби 331 епч, удаляют из экспрессионной нантного вектора.плазмиды рЕЧЗ/епч 44"640 пуем на- Масломасштабное выделение плазмиправленного затравкой мутагенеза для 10 дной ДНК из 1 мл насыщаемой в течениеполучения плазмиды рЕЧЗ/епч 44-640 суток культуры проводят согласно метоб 319-331, дике Бернбойма, позволяющей выделятьНаправляемый затравкой мутагенез для аналитических целей из бактериальпроводят на плазмиде рЕЧЗ/епч 44"640 ной колонии небольшие количества дНК.6 319-331 для удаления нуклеотидов, 15 Большие количества плазмидной ДНК покодирующих аминокислотные остатки 514- лучают из 1 л культуры согласно стан 524, и получают плазмиду рЕЧЗ/епч 44- дартной методике с применением центри 640 6319-331 Ь 514-524. Фугирования в хлористом цезии.Фрагмент рестрикционной эндонуклеа- Для рестрикционных эндонуклеаз едизы гена епч из плазмиды рЕЧЗ/епч 44- 20 ницу активности определяют как коли 640 Ь 319-331 Ь 514-524, кодирующий честно Фермента, необходимое для расостатки епч 467-640 Ь 514-524, связы- щепления 1 мкг ДНК за 60 мин в общемвают с Фрагментом рЕЧ 2/Нар 15-512 и реакционном объеме 0,05 мл при т.усв.получают в результате гибридный ген, 37 фС. Рестрикционные растворы кромекодирующий остатки яар 15-436 и остатподвергаемой расщеплению ДНК содержатки епч 467-640 Ь 514-524 в плазииде 100 мкг/мл альбумина бычьей сывороткирЕЧ 2/Нар 15-436/епч 467-640514-524, и следующие буФерные компоненты:В 81 11; 100 мМ МаС 1, 10 мИ трис-НС 1 (рН 7,4), 10 мИ МяС 1 и 10 мМ 2-меркаптоэтанола (2-ИЭ)еС 1 а 1: 50 мМ МаС 1, 6 мИ трис-НС 1 (рН 7,9) и бмМ ИяС 1,Нкпс 11;100 мМ МаС 1, 10 мМ. трис-НС 1 (рН 7,4), 7 мИ МяС 1 и 1 мМ дитиотреи"тола (ДТТ)3Н 1 пй 111: 50 мМ МаС 1, 50 мИ тряс-НС 1 (рН 8) и 10 мМ ИяС 1Нра 1: 6 мМ КС 1, 10 мИ трис"НС 1 (рН 7,4), 10 мИ МяС 1 и 1 мМ ДТТ;Рзй 1: 100 мМ МаС 1, 10 мМ трис-НС 1 (рН 7,5) и 10.мМ МяС 1,Роч 11: 60 мИ ИаС 1, 6 мМ трис"НС 1 (рН 7,5), б мМ МдС 1 и 6 мМ 2"МЭ;Яп,1: 100 мИ НаС 1, 10.мМ трис"НС 1 (рН 8), 10 мМ МяС 1 и 6 мМ 2-МЭ.Связывание Т 4 ДНК лигазой прово" 40 дят при 16 ОС в смеси, содержащей ДНКи 50 мМ трис-НС 1 (рН 7,8), 10 мИ. МдС 1, 20 мМ ДТТ, 1 мМ АТФ и 50 мкг/мп. альбумина бычьей сыворотки, Единицу активности Т 4 ДНК лигазы оп- ределяют как количество, необходимое для 50 "ного связывания Фрагментов Нпй П 1 лямбда-ДНК за 30 мин при 16 ОС в 20 мкл инкубационной смеси и концентрации 5 -концов ДНК 0,12 мкИ (300 мкг/мл).Очистка Фрагментов ДНК в агарозе,После расщепления с помощью рестрикционной эндонуклеазы предназначенные для клонирования Фрагменты ДНК выделяют электроФорезом в 1 -ной агарозе. После проявления с помощью 1 мкг/мл этидийбромида тонкие слои геля, содержащего целевые Фрагменты ДНК, экстрагируют через иглу 21 раз-мера в 4 мл раствора, содержащего10 мМ трис-НС 1 (рН 7,4), 1 мМ ЭДТАи 300 мИ ВаС 1. Полученную смесь вымораживают 3 ч при -80 С, оттаивают30 мин при 37 С и центриФугируют при10000 я в течение 30 мин. Полученнуюжидкость Фильтруют через Фильтр Мд 11 ех 0,45 мк, концентрируют до объема0,25 мл и трижды осаждают втор-бутанолом и этанолом с 10 мкг Е.со 1 хтРНК (транспортная РНК) в качественосителя.Культуральная среда,Среда М 9 СА содержит 10 г НаНРО 4,3 г КНРО 4, 0,5 г ЯаС 1 и 1 г ИН 4 С 1на 1 л с 1 мМ МяЯО 4, 0,5 глюкозы и0,5 казаминокислот при рН 7,4,Бульон Луриа (БЛ) содержит 5 гбакто-дрожжевого экстракта, 10 г бак1644720 то-триптона и 10 г ИаС 1 на 1 л при РН 7 ф 5Там, где указано, добавляют антибиотики тетрациклин и ампицилин до их окончательной концентрации соотввтст 5 венно 15 и 50 мкг/мл.ТрансАормация и вцделение рекомбинантов.ТрансАормацию штамма Г.со 11 МС 1061 (рйК 248 с 11.з) проводят следующим образом.200 мп бактериальных клеток выращивают при 30 С н БЛ до значения О.П.,1 д (оптическая плотность) 0,5 - 1, после 15 чего клетки собирают центриАугированием при 6000 я и 4 С 5 мин, вновь суспендируют н 50 мп раствора, содержащего 10 мМ морАолинопропансульфоновой кислоты (МОПС, рН 7) и 10 мМ 20 НЪС 1, Клетки собирают центрифугированием и вновь суспендируют в 30 мп раствора, содержащего 10 мМ МОПС (рН 6,5), 50 мМ СаС 1 и 10 мМ йЪС 1После инкубирования в течение 30 мин 25 при 0 С клетки собирают, вновь суспендируют в 6 мп 10 мМ МОПС (рН 6,5) с 50 мМ СаС 1, 10 мМ ВЬС 1 и 157. глицерина и в 40 пробирок ЭппендорАа (300 мкл на пробирку) отбирают аликво ты, которые замораживают до -80 С.ТрансАормацию проводят оттаиванием аликвоты на 100 мкл клеток и инкубируют 30,2 и. 2 мин соответственно при О, 37 и 0 С н присутствии образцаолигазной смеси в 10 мкл, содержащего примерно 100 нг ДНК, и добавлением в пробирку 0,1-0,5 мп БЛ, Пробирку затем инкубируют 60 мин при 22 С, после чего разливают по 200 мкл клеточ О ной суспензии в БЛ, содержащем ампицилин, и инкубируют 20 ч при 30 СобИндуцированные клетки, суспендированные в трис-глициновом (ТГ) буфере,смешивают с равным объемом электрофо"ретического буйера, инкубируют 5 минспри 95 С и по методике Лаэммпи подвергают электроАорезу в 12,5 Х-ном полиакриламидном геле. После электроАорезаоелки из геля элюируют в течение 6 чпри 95 В в 12,5 мМ трис- .и 96 мИглицина с 20 Х метанола и 0,013 БРЯ,рН 7,5 на нитроцеллюлозную мембрану(О, 1 мк) . Затем проводят анализ Вестерн-пятен,Направляемый затравкой сайтспецифичный мутагенеэ проводят согласнометодике Моринага. Используемые в мутагенеэе искусственные олигонукпеотиды синтезированы фосфитным методом сприменением автоматического синтезатора и очищены электрофореэом. на по"лиакриламидном геле.При гибридизации колоний в качестве индикатора для гибридизации используют тот же олигонуклеотид, чтои в направляемом затравкой сайтспеци.фичном мутагенезе, после мечения 5 конца с помощьюР (АТФ с применением полинуклеотидкинаэы) .Конструирование плазмиды рЕЧ 2/дад15-512.Конструкцию конечной экспрессиончой плазмиды, кодирующей гибридныйбелок 8 а 8/епч, получают конструированием плазмиды (рНЧ 2/Рар 15"512), содержащей нуклеотиды, кодирующив все,кроме первых 14, аминокислотные концевые остатки. Некоторые нуклеотиды,кодирующие карбоксилконценые остаткиеаза, затем замещают последовательностями ешь с получением конечного гибридного продукта.Выращивание клеток и индуцирование экспрессии гена, 45Культуры Е,со 1. МС 1061, содержащие плазмиду рВК 248 с 1 з, и экспрессионную плазмиду выращивают н среде М 9 СА при 30 С до среднеор, Ааэы и затем температуру повышают до 42 С с целью инакотивации фР, репрессора. После 2 ч инкубирования при 42 С клетки из 1 мпоиндуцированной культуры отделяют центрифугированием и вновь суспендируют в ТГ-буфере, содержащем 10 мМ трисНС 1 (рН 7,4) и 10 Х глицерина, для получения аналитического препарата.ЭлектроАорез на ЯРБ-полиакриламидном геле и анализ Вестерн-пятен. Для приготовления плазмиды рЕЧ 2/ /дад 15-512 ДНК-последовательность, ,кодирующую остатки 15-512 белка ад, получают иэ 50 мкг рекомбинантного фагового лямбда клона Я НХВ-З, содержащего провирусный геном НТЬЧ. ДНК подвергают расщеплению в присутствии С 1 а 1 (50 единиц) и Нкпс 11 (50 ециниц) н течение 120 мин при 37 С для получения Арагмента в 1700 п.о. (пар оснований). Фрагмент ДНК выделяют препаративным электрофорезом н агароэном геле и вновь суспендируют в 0,1ТЕ-буфере (1 мМ трисНС 1 (рН 7,4) с 0,1 мМ ЭДТА) до окончательной концентрации 0,03 пмоль/мкл.Для получения Фрагмента ДНК рая2 мкг экспрессионной плазмиды Е,со 1 г. рЕЧ-чгГ 2 расщепляют с помощьюС 1 а 1 (5 единиц) и Рчгг 11 (5 единиц)в течение 60 мин при 37 С и электроЬорезом на 1%-ном геле агарозы выделяют фрагмент в 1700 п.о., содержащий5 Р, промотор. Фрагмент ДНК послепредварительного осаждения этанолом 10вновь суспендируют до окончательнойконцентрации 0,03 пмоль/мкл,Используемая при таком конструиро"вании плазмида рЕЧ-чгГ 2 являетсяпроизводной легко доступной плазмиды 151рВК 322 (АТСС 31344), фаговый лямбдаклонНХВполучен использованиемфстандартной методики с рекомбинантнойДНК из указанной клеточной линии Н,зараженной НТ 1 Л"111. ЗараженнаяННЛлиния клеток человека обоэначена Н 9-НТЬЧВ и депонированав Американской коллекции типовыхкультур под регистрационным Мф Сцг.8543. Знание последовательности гено-.ма НТ 1 Лпозволяет легко сконструировать ДНК-индикатор,для вьгцеления генома из Нили любых другихлиний, способных к распространениювируса.0,03 пмоль Фрагмента 8 а 8/С 1 а 1 Нг.пс 11 смешивают с 0,03 пмоль Фрагмента рЕЧ-чгИ 2/С 1 а 1- Рпч 11 и связывают с помощью Т 4 ДНК-лигазы(200 единиц) в течение 18 ч при 15 Сов конечном объеме 10 мкл. Продуктсвязывания затем трансформируют вштамм Е,со 1 г. МС 106 1 (рВК 248 с 1 Сз)и трансйорманты отбирают путем выращивания на агаровьтх пластинках БЛ сампицилином после инкубирования 18 чпри 30 С, ДНК рекомбинантных плазмиданализируют для выявления нужногоразмера отщепленного Фрагмента после 45расщепления рестриктазами Вя 1 11,РнС 1 или Ньпй 111. Продукты выделения, прошедшие анализ по размеру, за"тем отбирают с помощью электрофорезав полиакриламидном геле и анализаВестерн"пятен на наличие предшественника 8 ая,Культуры клеток, содержащих плазмиду рЕЧ 2/8 а 8 15-512, индуцируют при40 С а дубликатные образцы индуциФ55рованных клеток готовят для электро-.форетического анализа в полиакриламидмидном геле, После электрогггореза гельразделяют на две части, одну половину окрашивают бриллиантовым голубым Кумасси, в то время как вторую сторону геля подвергают электроэлюции и анализу Вестерн-пятен с применением антител к Ва 8.Анализ показывает, что индуцированные клетки продуцируют белки, мигрирующие в геле в виде двух основных полос и имеющие молекулярный вес при-. мерно 56 и 53 кДРазмер полного белка яа 8 15-512 примерно 56 кЦ, Оба основных белка реагируют с антителами к 8 ая. Наблюдается также ряд меньших по количеству низкомолекулярных белков вступающих в реакцию с анти- телами.Конструирование плаэмиды рЕЧ 3/епч 44-640 А 319-331.Экспрессионная плазмида рЕЧЗ/епч 44-640, конструирование котброй из плаэмид 7 г НХВи рЕЧ-чьей описано Кроулем, направляет синтез НП.Чепч - специфичного белка 68-кД в Е.со. ДНК-последовательности, сбответствующие аминокислотным остаткам епч 319-331, удаляют с помощью направляемого затравкой мутагеиеза с использованием 18-шег искусственного олигонуклеотида, имеющего последовательность 5ССА ТТТ СТТ ААС АТТ АСТ 3 Такой олигонуклеотид предназначен дополнять епч-последовательности с тем, чтобы присоединять нуклеотиды, кодирующие остаток 318 к нуклеотидам, кодирующим остаток 332. В результате соединения указанных последовательностей в плазмидную ДНК вводится новый уникальный участок Нра 1 с одновременным удалением фрагмента в 39 п.о, Для образования пробела("дар") для гетеродуплексной молекулы в плазмиде рЕЧ 3/епч 44-640 использованы сайты Брэгг 1 и Нпд 111.ДНК из выделенных колоний, гибридизуюгиеся сР-меченным искусственным олигонуклеотидом, трансформируют в МС 1061 (рВК 248 с 1 Сз) и анализируют на присутствие нового уникального Нра 1 участка.Конструирование плаэмиды рЕЧЗ/епч 44-640 6 319-331 Ь 514-524Второе удаление в рамках кодирующих епч-последовательностей проводят с помощью направляемого затравкой мутагенеза с использованием искусственного олигонуклеотида, имеющего последовательность 5 АСА ССА СТС1644 720 10 Рго С 1 у С 1 у Ьуе Ьуе. Ьув Тус Ьув Ьец Ьуе Н 1 в 11 е Ча 1 Тср А 1 а. Бег Агу С 1 ц Ьец С 1 ц Агд РЬе А 1 а Ча 1 Авп Рго С 1 у Ьец Ьец С 1 ц Т.с Бег С 1 ц С 1 у Сув Агу С 1 п 11 е Ьец С 1 у С 1 п Ьец С 1 п Рсо Бег Ьец С 1 п ТЬс С 1 у Бег С 1 ц С 1 ц Ьец Агд Бег Ьец Тус Авп ТЬг Ча 1 А 1 а Тсг Ьец Туг Сув Ча 1 Не С 1 п Агс 11 е С 1 ц 11 е Ьув Авр Тйг Ьуе С 1 ц А 1 а Ьец Аер Ьуе 11 е С 1 ц С 1 ц С 1 ц С 1 п Авп Ьув Бес Ьуе Нв Бес Бес С 1 п С 1 п С 1 у С 1 п Мес,Аер ТЬс С 1 у С 1 п Авп 11 е Ча 1 Не С 1 п А 1 а 11 е Бес Рсо Агу Тйг Ьец Авп А 1 а Тгр Ча 1 Ьув Рсо С 1 ц Ча 1 11 е Рсо Мес, РЬе Ьуе А 1 а Рйе Бес С 1 ц С 1 у А 1 а Тйс С 1 у С 1 у Нв С 1 п С 1 ц С 1 ц А 1 а А 1 а Ча 1 Ча 1 С 1 ц С 1 ц Бег А 1 а Ьец Бег Ьец Аеп Тпс Ча 1 С 1 ц ТЬг 11 е Авп Рго С 1 п Аер А 1 а А 1 а Мег.ец Аеп Тйс ИеС 1 п МеС Ьец Ьув С 1 ц Тгр Авр Асд Ча 1 Н 1 в Рсо Ча 1 Нв А 1 а С 1 у Рсо 11 е А 1 а Рго С 1 у С 1 п Мег Асд С 1 ц Рго Асд С 1 у Бег Аер 11 е А 1 а С 1 у Т 1 с Т 1 с Бег ТЬг Ьец С 1 п С 1 ц С 1 п 11 е ССА ГСА ССА 3. Этот олигонуклеотид располагает последовательности, кодирующие остаток 513 белка епч, рядом с последовательностями, кодирующими остаток 525, тем самым способствует удалению нуклеотидов, кодирующих остатки 514-524. Удаление осуществляют в плазмиде расщеплением по рестрикционным участкам Нра 1 и Ньпй 111 с 10 созданием однонитевого пробела ("Вар") в пределах епч-области.После повторного трансформирования ДНК из положительных продуктов, идентифицированных с помощью Р-меченного олигонуклеотида, анализируют на предмет удаления 33 п.о. с помощью расщепления рестриктазамиНра 1 и Ньпй 111 и электрофореза в 17-ной агарозе Такое удаление также под тверждают установлением ДШ(-последовательности с последующим применением метода химического расщепления,Удаление Д 514-524 приводит к значительному повышению экспрессии епч. 25Конструирование плазмиды рЕЧ 2/да 8 15-436/епч 467-6406,514-524.2 мкг ДНК рЕИ./Вад 15-512 подвергают рестрикции либо С 1 а 1 (5 ед) и В 81 11 (4 ед) с получением Фраг мента примерно в 1300 п.о., кодирую- щего остатки 15-436 8 а 8, либо с помощью Рвс 1 (10 ед) и С 1 а Х (5 ед) с получением Фрагмента примерно 1 Кб, Мес Авп Агс 11 е Асд 11 е Нв Агд Ьув Ьув Я 1 а С 1 п С 1 п А 1 а А 1 а А 1 а Ча 1 Бег С 1 п Авп Тус Рсо 11 е Ча 1 содержащегоГ промотор . О, 3 мкг ДНК рЕЧ 3/епч 44-640 Д 319-331 Д 514- 524 подвергают рестрикции с помощью Рз, 1 (10 ед) и 881 11 (4 ед) сполучением Фрагмента размером примерно 4 Кв, копирующего остатки епч 467- 640 Д 514-524. Полученные Фрагменты ДНК разделяют в 1 Х-ной агарозе и выделяют, 0,03 пмоль ДНК каждого выделенного Фрагмента ДНК смешивают и связывают 18 ч при 15 С в присутствии Т 4 ДНК-лигазы (200 ед). Лигазной смесью трансформируют МС 1061 (рИ(248 с 1 св) продукты трансформации отбирают на пластинках с БЛ, агаром и ампицилином. Плазмидную ДНК получают из уникальных колоний и анализируют на правильность размеров рестрикционных; Фрагментов после расщепления рестриктазой Рцч 11.Одиннадцать из 12 выделенных клонов дают требуемые Рич 11-Фрагменты ДНК размером 3505 и 2882 п.о. Два про" шедших анализ клона отобраны для синтеза гибридного белка Ва 8/епч. Эти культуры клеток индуцируют, образцы клеток отбирают для электрофоретического анализа в БВБ-полиакриламидном геле, электроэлюции и анализа Вестерн-пятен.Отобранные клоны синтезируют белок следующей аминокислотной последовательности:Тгр С 1 ц Ьуе 11 е Асд Ьец Асд2 1644720 С 1 у Тср Мег. Тпк Аеп Аеп Рсо Рго 11 е Рсо Ча 1 С 1 у 61 ц 11 е Тус Ьув Агд Тгр 11 е 11 е Ьец С 1 у Ьец Аеп Ьув 11 е Ча 1 Агд Мек Тус Бес Рсо Тпг Бег 11 е Ьец Авр 11 е Агд С 1 п С 1 у Рго Ьув С 1 ц Рго Рпе Агд Авр Тус Ча 1 61 п Л 1 а Бес С 1 п С 1 ц Ча 1 С 1 п Аеп А 1 а Авп Лер Акд Ча 1 Ьуе Рйе Тукув Тпс Ьец Агд А 1 а С 1 ц Авп Тгр ИеС Тпг С 1 ц Тпк Ьец Ьец Рго Лер Сув 1.уе Ьец С 1 ц С 1 ц Мес Тпс 11 е Ьец 1.ув А 1 а Ьец МеС Тпс А 1 а Сув С 1 п С 1 у С 1 у Рсо А 1 а А 1 а Тйг Рко С 1 у 61 у 01 у С 1 п Ча 1 Нав 1,ув А 1 а Лкд Ча 1 Ьец А 1 а С 1 ц А 1 а МесБек Тпс Аеп Тпс А 1 а Тйс 11 е МеС МеС С 1 п Акд С 1 у Авп Рпе Асд Авп С 1 ц С 1 у, Нв Ьув Мес. Ча 1 т уе Асд Аеп Сув Агд Сув Рпе Авп А 1 а Рко Асд Сув С 1 у Ьуе Ьув Ьув С 1 у Сув Тср Ьуе Сув С 1 у С 1 ц Агд 61 п А 1 а Леп Ьув С 1 ц С 1 у Нв 61 п МеС Ьув Рйе Ьец С 1 у Ьув 11 е Рпе Асд Явр Суе Тпг Рго С 1 у 61 у Ьуе Тус Ьув С 1 у Авр Мес Агд Авр Авп Тср Лсд Бег С 1 ц Ьец Туг Ча 1 Ча 1 Ьув 11 е С 1 ц Рго Ьец 61 у Ча 1 Л 1 а Рго Тпс Ьус Л 1 а Ьув Агд Лгд Ча 1 Ча 1 61 п Агд 01 ц Ьув Лкд Л 1 а Ча 1 А 1 а А 1 а 61 у Бег Тпс Мес. 01 у А 1 а А 1 а Бег Ме Тпг 1.ец Тйг Ча 1 С 1 п А 1 а Агд С 1 п Ьец Ьец Бес С 1 у 11 е Ча 1 01 п 61 п С 1 п Леп Леп Ьец Ьец Ягд А 1 а 11 е 01 ц Л 1 а С 1 п 61 п Нв Ьец Ьец С 1 п Ьец Тпс Ча 1 Ткр С 1 у 11 е Ьув С 1 п Ьец С 1 п А 1 а Асд 11 е Ьец А 1 а Ча 1 С 1 ц Агд Туг Ьец Ьуе Авр С 1 п С 1 п Ьец Ьец С 1 у 11 е Ткр 61 у Сув Бес С 1 у Ьув Ьец Ьец Сув ТЬс Тпг А 1 а Ча 1 Рсо Тср Лвп А 1 а Бес Тгр Бег Леп Ьув Бес Ьец 01 ц С 1 п 11 е Тср Аеп Нв Тйг Тпг Тср МеС 61 ц Ткр Авр Асд Рго 01 у 01 у Ьув. Ьув Ьув Туг Ьуе Ьец Ьуе Нхв 11 е Ча 1 Ткр А 1 а Бек Агд 01 ц Ьец 61 ц Агд РЬе Л 1 а Ча 1 Лвп Рго 61 у Ьец Ьец 61 ц ТЬг Бег 01 ц 61 у Суе Агд 61 п 11 е Ьец С 1 у С 1 п Ьец 61 п Рго Бек Ьец 01 п Тпс 01 у Бег 61 ц 01 ц Ьец Агд Бег Ьец Туг Аеп Тпг Ча 1 61 ц 11 е Лвп Аеп Туг Тпг Бег РЬе Аеп А 1 а Ча 1 Ча 1 Туг Не Бег/ 7Таким образом, изобретение позво О ной ДНК,. кодирующей антигенную детер"ляет получить белок, который имеет минанту вируса СПИД, трансйормациюпо меньшей мере одну антигенную де- плазмидой штамма бактерий ЕзспехьсЬдатерминанту, соответствующую последо" .со 1, культивирование, выделение ивательностям белков дав и епч вируса очистку целевого продукта, о т л иНТЬЪ. 45 ч а ю щ и й с я тем, что, с цельюповышения специфичности антигена,Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я конструируют рекомбинантную плазмидурЕ 72/ад 15-436/епч 467-640 а 514-524,Способ получения антигенной детер- кбдирующую синтез слитого белка ар/минанты вируса СПИД, включающий кон- /епч, со следующей аминокислотнойструирование рекомбинантной плазмид- последовательностью:Ме 1 Авп Агд 11 е Лгд 11 е Ньв Агд Ткр 61 ц Ьув 11 е .Акд Ьец Агд1 б 447 О С 1 ц 11 е Ьуя Ти г Аяр 11 е А 1 а Тйг Уа 1 61 п Ьец Туг Сув Н 1 в Аяп Ьуя 11 е С 1 ц Бег Ьув Ьув Ьец Ьув Бег Н 1 я Еег С 1 у Тйг А 1 а А 1 а С 1 п А 1 а Ьуя Ьув 01 п С 1 у 61 п А 1 а Тгр Ча 1 11 е Рго Мег 11 е Ча 1 11 е 61 п Мег Ьув РЬе Ча 1 Рго Туг Бег Н 1 в 11 е С 1 п Ьец А 1 а Ча 1 Тйг Бег Рго Ча 1 А 1 а Рпе Уа 1 Ча 1 Рго Бег Ьуя Тпг Ьец С 1 п А 1 а 61 у Ьец Аяп 61 п МеГ. Тйг Рго А 1 а Аяр Мег А 1 а Ьец Бег Бег Ча 1 Н 1 в Ьув С 1 п С 1 у 61 ц Тгр А 1 а А 1 а 11 е Тйг С 1 п МеГ С 1 у А 1 а 11 е Н 1 я 61 у А 1 а Рго Ча 1 т 1 е 61 п 01 п 01 ц. Тпг Бег ТЬг 01 у А 1 а 11 е 61 у 61 у Бег Тгр ТПг 11 е 61 у 61 ц 11 е Ча 1 Агд Мег Рго йуя 61 ц Ча 1 и Рго Рго Рго Аяп Аяп 11 е Туг Ьуя 61 у Аяп 11 е 11 е Тгр Ьуя Рго 61 у С 1 п 11 е Ьец 11 е Тйг Рго Бег Тпг Ьув Рпе Туг Туг Аяр Рпе Тпг Ьуя Ме Тгр 61 п А 1 а Бег 61 п Аяр Суя 01 ц 61 ц 11 е Тпг Рго С 1 п Ча 1 Мес Тпг 61 у Тпг А 1 а А 1 а Рго Уа 1 Н 1 я А 1 а 61 у Ча 1 Рго Тйг 61 у 61 п Ча 1 Бег А 1 а 11 е Ме 1 Тпг Рпе Ча 1 Мег Ьуя Агд С 1 п Агд Л 1 а Рйе 01 ц Суя Н 1 в А 1 а Рго Н 1 я Тйг С 1 у Суя 61 у С 1 п Мег Ьув 61 у Ьуя Суя Тгр Агд Суя С 1 ц С 1 у 11 е Рпе С 1 у Ьуя Ьец Рпе Авп А 1 а 01 п 61 у Ча 1 Бег Туг А 1 а Ьув Мег Ьув Ча 1 Агд 11 е Ча 1 Ьец Агд Аяр Авр Ча 1 Тгр Ьуя Ча 1 А 1 а 61 у Рго Рго Ьец Ча 1 Ьув Агд Тйг Агд Мег А 1 а 01 у 01 п 01 у Бег А 1 а Ча 1 Тпг Тпг Ме 1 А 1 а 11 е С 1 п С 1 п Ьец Авп Агд С 1 у Ьец Ьец Ча 1 Тгр Н 1 я 11 е 11 е 61 п 61 п Тпг Ьец 11 е А 1 а Ьец С 1 у 01 п Ьец 11 е Тгр С 1 у Сув Ьец Тгр А 1 а А 1 а Рго Тгр Н 1 я Тпг 11 е ТЬ.г Тгр А 1 а Мег Ча 1 Тгр Рпе 11 е Аяп Тпг Бег Туг 1этой плазмидой трансАормируют штаммЕ.со 1 ь АТСС Р 53338, а в качестве Ьуя Авр Сув Ьец С 1 п 61 п Тйг 01 ц Агд Ча 1 Н 1 я Рго Агд С 1 ц Рго Агд Ьец Агд А 1 а 61 ц С 1 ц Тпг Ьец Ьец Ьец Ьуя А 1 а Ьец А 1 а Сув 61 п 61 у А 1 а С 1 ц А 1 а Мег 61 п Агд С 1 у Авп Аяп Суя С 1 у Ьув Агд Ьуя Ьув 61 у уя Авр Агд Рго Туг Ьув Тпг Ьуя А 1 а А 1 а С 1 у Бег С 1 п А 1 а Агд 61 п Агд Туг Ьец Ьув 61 у Ьуя Ьец Ьец Бег Аяп Ьуя Бег С 1 ц Тгр Аяр Агд Ча 1 Туг Н 1 я Бег целевого продукта выделяют и ОчиШаютслитый белок дад/епч.