Способ получения полипептидов

904518 9 2037. Колоночная хроматограф я на кремнеземе с применением системы К38, Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип, 60-80 С), т.пл. 172-174 С39 Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т.кип, 60-80 С),т.пл. 140-141 С40. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением смеси этилацетата с метанолом41. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром В С Р Р Н К Я 50 а 387 6 В,.10 ф йрииее Полйпептиа Н-МеТут-О-А 1 а-Я 55 55 2 30 69 77 Тут-А 1 а-С 1 у-РЬе-Ееи-М 1 а 60 6 0 66 52 17 0 59 77 66 59 86 50 60 50 аб 95 87 67"0(С 4 1 ОАс 67 г-ЯегС 1 у(68 62 59 а 9 а 5 а ав Й 65 ОАе ,оье 9 а СЕОСОСцНз 1СН,ОЕОСНВ 1ю-Ьеи"КН(СК ОАа) 18 Н-Тут-О"Зе 32, Лиофильная сушка33., Колоночная хроматография накремнеземе с применением систем Р,( и К34. Перекристаллизация из смесиэтилацетата с циклогексаном, т.пл.163-164 е С 35. Перекристаллизация из смеси метанола с эфиром, т.пл. 130-131 С 1636. Гидролиз сложного эфира в процессе операции (исходное соединение 137) 2 Н-Тут-О-А 1 а-Ай 81 у-РЬе-Ат.1 еи-М 123 Н-Тут-В-А 1 а-С 1 у-Р 1 а-Ееи(СИ ) И22 й Н-Тут-Э-А 1 а-С 1 у-РЬе-З.ец-О(ч 3) 2 Яюе 6 Н-Тут-А 1 а-С 1 у-Р 1 ю-Х 1 е-ВеУ 11-Тут-А 1 а-С 1 у-Лю(бН) -Ееи1-Туг-А 1 а-Яу-Р 1 к(бИ) -Ееи 1-Тут-Аар-Иу-Р 1 ю-Есц-Ъе 0 И-Тут-АзаХе-С 1 у-РЬе-Ееи-Сйе И-ТУг+Ьеи-С 1 у-Ье-Ьеи-Ое 1-Тут-Ь-Вет-С 1 у-АгрЬе-Ьеи-З 1 еЗ и-Туг-О-Зег-С 1 у-Р 1 е-Ьеи-О(а )904518 22 на на 1 О ФФФМВюммФ вавееае тваееа ее е Примечания Ну С ь 1 э.1 оч ают хроматографией на кремнеземе с применением 25 обА смеси метанола и хлороформа и растворителя К Н 5 Соль 1 з.1 осаждает добавлением смеси метанола с эфиром Н 9 Соль с 2 НОАс получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет."бутанолом Н 9 Соль с 2 НОАс получают а виде высушенного лиофильной сушкой порошка или си воды с трет.-бутанолом в присутствии 11 С 1 Н 9 Очищают хроматографией на кремнеземе с применением 25 об.1 смеси метанола и хлороформа, в присутствии растворителя К 122 12 В Н 9 Соль с НОАС Н 9 Получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка иэ воды илн с си с трет.-бутанолом Н 2 Выделяют упариванием после фильтрования через диатомовую землю Н 2 Получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет.-бутанолом, т.пл. 143 фС 127 Н 5 Соль К 1 выделяют упариванием после фильтрации через диатомовую землю 12 Н 9 Соль 11 С 1 получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет.-бутанолом в присутствии 1 Е 1 Н 5 Соль К:1 осаждают добавлением эфира; т,пл. 157 аС 138 Н 11 Соль трифторуксусной кислоты (ТФК) осаждают добавлением смеси зтилацетата с эфиром, т.пл. 103 фС (раэл.) Н 11 Соль ТФК выделяют упариванием после фильтрования через диатомовую земле; 114 Н 11 Сола ТФК выделяют упариванием после Фильтрования через днатомовую землю, т,пл. 87 еС (раэл,) Н 11 Соль ТФК выделяют упариванием после фильтрования через диатомову землю, т,пл, 9 ВС (разл.) Н 11 Соль ТФК выделяет упариванием после фильтрования через диатомовую землю Н 11 Соль ТФК выделяют упариванием после Фильтрования через диатомовую землю, т.пл, 146-143 вС Н 11 Соль ИС 1 получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка иэ воды или смвСи воды с трет,-бутанолом 21(с разл.)42. Перекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром(т.кип. 60-80 аС), т.пл. 111-113 С 5 4. Колоночная хроматография кремнеземе с применением 1 об.3 метанола в хлороформе44. Колоночная хроматография кремнеземе с применением систем и К45. Т,пл. 121-122 С 46, Перекристаллизация из этилацетата, т,пл. ".48-250 С47. Очистка на Сефадексе Ш 20 в диметилформамиде48Перекристаллизация из смеси э 1 илацетата с петролейным эфиром (т.кип. 60-80 С), т.пл. 152-155 С49. Перекристаллизация из смеси этилацетата с петролейным эфиром (т,кип, 60-80 С), т,пл. 164-168 С50. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением 5 об.4 метанола в этилацетате94518 25 26 Продоощвние табл, 1 ет ее е ееееег Исходноесоединение Соособ Примечания ет е ге г е е гетег 124 Н 9 Соль НС 1 получает в виде высушенного лиофильной сушкой оорошка из воды или смеси воды. с трет.ебутанолом в присутствии НС 1 130 Н 5 Соль НС 1 выделяют упариванием после фмльтрованил через диатоиовуе эемл 131 135 Н 9 Выделяет упариванием после фильтрования через дматомовую землю 178 Н 1 Соль НС 1 очищают на сефадексе С 15 в 5 об, водной уксусной кислоты Н 9 Соль НС 1 оолучают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет."бутанолом в присутствии НС 1 200 209 Соль с 2 НС 1 очищают хроматографией на кремнеземе с применением 25 об.Ф смесиметанола и хлороформа, с применением растворителя КВыделяют упариванием после Фильтрова ия через диатомовую землю Н 2 Н 9 Соль 1 МЛ очищают хроматографией на кремнеземе с применением 25 об.2 смеси метанола и хлороформа 193 218 Н 2 Соль ТФК выделяют упариванием после Фильтрования через диатомовуе землю, т.пл. 16 С С Н 9 Соль НС 1 очищают хроматографией на кремнеземе с применением 25 об сдеси метанола.и хлороформа, с применением раствсрителя К 185 Н 10 Соль с 211 С 1 получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси еоды с трет,-бутанопом 191 Н 5 Соль с 3 НС 1 получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка из воды или смеси воды с трет.ебутанолом Н 9 Соль с 3 НОАс очищают хроматографией на кремнеземе с применением 25 об.2 смеси метанола и хюрофориа с применением растворителя К 199 Н 9 Соль НС 1 получают в виде высушенного лиофильной сушкой порошка иэ воды или снеси воды с трет.ебутанолом, в присутствии НС 1 183 Н 9 Соль с НОАС очищают на сефадексе Св 5 об.2 уксусной кислоты 203 Н 11 Соль НС 1 очищают хроматографией на кремнеземе с применением 25 об.Ф смеси метаиолаехлорофориа и растворителя К 187 Н 9 Соль с 2 НС 1 очищают на сефадсксе Св 5 об.2 уксусной кислоты Соль с НОАС получает в виде высушенного лиофильной сутаной порошка мв водыили смеси воды с трет,-бутанолом; т.пл. 2 18-219 вССоль НС 1 очищают хроматографией на кремнезеие с применением 25 об. 2 смесиметанола и хлороформа, с применением растворителя К 217 Н 9 180 Н 9 Соль с 2 НС 1 очеяают ачалогично Н 9 Соль с 211 С 1 очищают аналогично и получают в виде высушенного лиофильной суекей пораока Н 9 Очищает иа сефадексе 625 в 5 об,2 водной кислоты. Эпектрофореэ ори рН 6 5 Перемещает иа 0;78 по отношение к гистидину в качестве стандартной метки 198 Н 1 Соль с НОАС оолучеет в виде высушенного лиофильмой сушкой порошка из воды или смеси воды с трет.ебутанолои в присутствии НОАС-1 в -т ш Ю СЧ сЧ сЧ ОО ш ш ш О Г- МЮ ЮсЧ сЧ (Ч 1 " Ш ц СО л сЧ м ю сЧ м О0 О О г м ц м-ф Г.7 -4сО 01 Ю сЛ Л 0 вСЧ СЧ Эб Эй6 1Ог.лгР 3 с 3ъ 11 Га1л лсЧ сЧ СЧ СЧ с р б О 1904518 Х Ы О о т .Э Фел л со со Гъ М Ю о о С с 1333 1Х6 1 1о е1 1 1СК 1С 3 СХх эо ОЛ О 1 СЧ - М - оо о чэ д о л а о асо ю М юО О Ос боо 1 1 1 гЧ Гц Гц О 1 1 1А,ъ,Фм; ) 3 Р, 1 1 1 Ь; Н Ко Б Щс о з к оо м ст оо маа зло :Ю с 9 Б о О о 3 Офо х 1 1 :3 3 1 Ю 1 х 133 Ес3ок .3 Т33 о о х о 11 1 1 1 Б 1 1 2 3о 1оХ 13 1 1 1 4,ю о9 а Й 3 6-6ЕЗ,С р О,2, Вос-Еец-Д + фенол Тблиц 7 рот ура ООКИ Х Я Р Г И 2 46 Феееееее ееееейе)-(Н(2- Н (СН 0 (Сн ) -(Ся ) - 0Ий О;ВН О Н Н 11 . -О НИ О М Е 1 Но -3ОП 1,2 С Н (ОСОГН,) С 1 1 ОСОН;ОС 11(ШдОАс); ОС ЦСНдОС(СЦ;ОВц; Т 1 г-ОН; 3 ЩЮ; И О; МЕ;0(СЩ 1 Ж 2; 0(СНДЫ 4 е 2;ОСНаСН=С 11 а, ОРЙМН(С 112) 01ф(СНу.)Рф 1 е 1 ф(СН 2 Ь 111 Ъ 1МИх, Ме; 0(СН)ЖЬ;Р-Пг-ОН,или С и К вместе представляют собой О(СН )я 2; О(СН 1 р 1 е 2;ОСЮСН=С 1 1, ОГ 11 е; .И(Щ)Я 1;ВН(СН)Ж 1 е; М 1(01 ЦФ 1 е,ЫЕйд, 1 Ь; 0(С 11) ЯПЬ илиР-Т 11 г-ОВг 11или С и К вместе представляют собой35)й 25 В 1 где Й 1 й водород, метильный или ацетильный радикал;водород; 2; Н-В-А 1 а; 2-Аяр; Е-Еуя; Е-Еув(Е); Е-Еуя(ВрЦ Н-( 1 уу2-А 5 р (ОВг 1) 2-Ьу 2-Ьтз(2) "-Еуз; 2-Атд(2) - -Рго-Ьуя,2); 2-Г 11 уу-Г 11 у;2-Ьы-Ьец-Ьец; 2-С 1 ц-С 1 у-ОВк 1 2 Ьу; 2-Рго-С 1 п-С 1 п;2-Лир(ОВк 1) -61 ууу;2- Ьузууили 2-С 1 уу-Яу 2-Ьуя;2-Лгд(2) -Рто-Ьу(2) -Ртоп-Г 1 п; Вос; Нц(ОВц );ао Вос-Ьуз(Вос); Н-Р-Ьуз Зос); Н-Ьу 5 (Вас); Вос-РЬ 11-1,у Вос-С 1 у-С 1 у-С 1 у или Восууууу-С 1 у; Тут; Тут(Вк 1); Туг(2) или Туг(Вц );Р-А 1 а; Р-Аьр; Аьа 1 а; Р-Ьец; Р-Бег; Р-Пп", Р-Ттр; -А 1 а; Р-Бег(Вц); Р-Ьу;Р-Ьуз(Вос) или Р-Ме 1; С 1 у или Акд 1 у;Р 11 е; Агре или РЬе(61); Ьец; Аг 1 ец; Х 1 е; Ме 1; Рто; РЬ-Ьец или Агрго;Д 1 е 1 1112 0(112321 ф 2 у 0(611)%йе ОН 0(Ш 2)а.д 1 0(С 11) ОАс; 0(С 112)ЛОСОС Н , ЛС 11 СН(ОЛс) СНОАс; Т В ЕК 20заключающиФся в том, что отщепляютзащитные группы в соединении формулы Получение исходных соединений осуществляют при использовании различных методов пептидной химии, например карбодиимидного или азидного метода получения смешанных ангидридови т.п, 12 . При этом получают исходные соединения, блокированные различными защитными группами, Например,для блокировки иминогруппы используютбензилоксикарбонил, трет -бутоксикарбонил. Гидроксильную группу защицают бензилом или трет.-бутилом,карбоксильную группу защищают, получая эфирметиловый или этиловыйспирт. Для снятия этих групп применяют известные методы, Так, бензилили бензилоксикарбонил удаляют гидрогенолизом; трет.-бутоксикарбонилили трет.-бутил - обработкой исходного соединения кислотой, напримертрифторуксусной, или хлористым водородом. Для удаления бензилоксикарбонила или трет,-бутоксикарбонилаиспользуют бромистый водород в уксусной,кислоте. Иетиловый или этиловыйэфир расцепляют с помощью гидрогенолиза или щелочной обработкой исходного продукта,Восходящую тонкослойную хроматографию проводят на пластинах, покрытых силикагелем (Кизельгур 6). Мроматографирование проводят в следующих системах растворителей: бутанол- уксусная кислота - вода1:1:5 об.ч, (ВА); бутанол- уксусная кислота - вода - пиридин15:3:12:1 О об.ч. (КВ); бутанолЕЭ4133 ЭО Эд сС х О сС х э и О 2 и а о о+ о ч.ч Г.РГ -1о Э Р ГфЪ СО СО СОлЭ ГЧЧ ГЧЧ Рч 1 1904518 53; об.ч. (КЩ; ацетон - хлороформ1:1 об.ч. (ЙЕ); хлороформ - этанол1:4 об,ч. (КЕ); циклогексан - этилацетат 1:1 об,ч, (КС); циклогексанэтилацетат - метанол 1:1: об;ч.5ЩЩ; хлороформ - метанол - вода11:8:2 об.ч, (В К); хлороФорм - метанол 19:1 об,ч. (ЙР) и хлороФорм - метанол 9:1 об.ч. (Р), Некоторые из таких систем растворите Олей используют также для копоночнойхроматографии на кремнеземе (растворители 6, К, я и Р). Во всех случаяхпластины оценивают в ультрафиолетовомсвете и обрабатывают Флуоресцеином, 5нингидрином и реагентом - хлорйодистым крахмалом. Если нет особых указаний, то показатель Йозначает,что этими способами обнаруживают отдельное пятно. 20Гидролиэаты кислого характера длявсех продуктов получают нагреваниемпептида или блокированного пептидас 6 н.раствором соляной кислоты,содержащимвес.об.3 Фенола, в запаянной пробирке, иэ которой выкачен воздух, в течение 16 ч при 110 С.Аминокислотой состав каждого гид"ролизата определен с помощью анализатора аминокислот Локарта. В каж- звдои случае наблюдают соответствие сожидаемым составом.П р и м е р ы 1-42. Блокированный полипептид подвеогают восстановительному расщеплению.Восстановительное расщеплениеосуществляют следующим образом.Н 1. Исходный материал в количестве 1 ммоль растворяют в этаноле,содержащем до 251 воды, ив атмосфе вре азота добавляют 5 вес.Ф катализатора, содержащего 5 вес,4 палладированного угля, и ч-рез перемешиваемую реакционную смесь при 20-25 Состорожно барботируют поток водорода. Для полного завершения реакциидостаточно 5-6 ч. Водород заменяютазотом, и катализатор фильтруют через слой диатомовой земли. Продуктвыделяют упариванием фиг,ьтрата в ва-кууме, Выход 90-95;,Н 2, Осуществляют как и в Н 1, новместо водного этанола применяютметанол.55 Н 3, Осуществляют, как и в Н 1, но применяют метанол в качестве реакционной среды. 6Н 4. Осуществляют, как и в Н 1, ноприменяют водный этанол при добавлении 1 экв,ч. хлористого водорода.Н 5. Осуществляют, как и в Н 1, ноприменяют водный метанол при добавлении 1 экв.ч. хлористого водорода,Н 6., Осуществляют, как и в Н 1, ноприменяют диметилформамид при добавлении 1 экв.ч. толуол-и-сульфокислоты.Н. Осуществляют, как и в Н 1, ноприменяют метанол при добавленииэкв,ч. хлористого водорода.Н 8, Осуществляют, как и в Н 1, ноприменяют в качестве реакционнойсреды смесь диметилформамида с бутанолом.Н 9 Осуществляют, как и в Н 1, ноприменяют в качестве реакционнойсреды водную (90-95 об.Ф) уксуснуюкислотуН 10. Осуществляют, как и в Н 9,но добавляют 1-2 экв.ч. хлористоговодорода.Н 11. Осуществляет, как и в Н 1,но применяют в качестве реакционнойсреды водный диметилформамид,Н 12. Осуществляют, как и в Н 1,но применяют в качестве реакционнойсреды смесь водного этанола и хло- .роформа.Н 13 Осуществляют, как и в Н 1,но применяют в качестве реакционнойсреды смесь метанола в диметилформамиде.В результате получают полипептидные производные, приведенные втабл, 1.П р и м е р ы 43-69 Блокированный полипептид подвергают расщеплению хлористым водородом по следующимметодикам.Е 1. Исходное соединение растворяют в этилзцетате и добавляют растворхлористого водорода в этилацетате вколичестве, достаточном для получе-ния 2-6 н.кислоты, Реакцию проводятпри 20-25 С в течение 1-2 ч, Хлоргидрат продукта осаждают и отфильтровывают, Выделение проводят упариванием в вакууме.Е 2. Осуществляют, как и в Е 1, нов качестве реакционной среды вместоэтилацетата применяют метанол.Е 3. Осуществляют, как и в Е 1, ноприменяют хлористый водород в смесиметанола с этилацетатом,Е 4, Осуществляют, как и в Е 1, ноприменяют уксусную кислоту для раст1 Л ч л лСУ11 1Ь 4 11 Х 11 -- 41Р 1АД1 а Э Е а + а Ф Е ЧР а + т Ф ъ 1 ах Е а м о + 4 Лл лМ лл Съ 4:Ф л Гк 34518 Сефадексе С 15соляной кислоты. Сефадексе С 25 кислоты. 12, Очищает нав 0,01 И растворе 13. Очищают нав 5 об.3 уксусной ворения исходного материала с последующим добавлением хлористого водорода в этилацетате.Е 5, Осуществляют, как и в Е 2, нов атмосфере азота в присутствии противонагарного средства, например2-меркаптоэтанола,Еб. Осуществляет, как и в Е 1, ноприменяет диэтиловый эфир вместоэтилацетата в качестве реакционнойсреды.Е 7. Осуществляют, как и в Е 1, нов качестве реакционной смеси вместоэтилацетата применяют диоксан.Е 8. Осуществляют, как и в Е 1, нов качестве реакционной среды применяют уксусную кислоту вместо этилацетата.Е 9. Осуществляют, как и в Е 1, нов атмосфере азота в присутствии противонагарного средства, например2-меркаптоэтанола,Е 10. Блокированный материал перемешивает с концентрированной солянойокислотой (примерно 1 О мл/г) при 0 Св течение 10 мин. Избыток кислотызатем отгоняют в вакууме, по воэможности при минимальной температуре,и полученный поодукт сушат лиофили"зацией.В результате получают полипептидные производные, приведенные втабл. 2.Примечания (сноски) к табл, 2.1, Соль НС 12, Соль 2 НС 13. Выделяют упариванием послефильтрования через диатомовуе землюВыделяют осаждением5. Осаждают добавлением эфира6. Осаждают добавлением смесиметанола с эфиром7, Кристаллиэуют иэ смеси этилацетата с петролейным эфиром(т.кип. 60-80 С),8. Получают в виде высушенноголиофильной сушкой порошка из водыили смеси воды с трет.-бутанолом.9. См.сноску 8, в присутствии НС 1.10. Очищают хроматографией накремнеземе с применением растворителя О.1. См.сноску 10, с применениемрастворителя К,814, Т.пл. 202-205 С15. 1.пл. 110 С16. Т,пл. 179-180 С17. Т.пл, 173-174 С18, Т.пл, 142-14419, Т,пл, 118-120 С20. Т.пл, 138-140 С21. Т.пл. 111-114 С22. Т.пл, 195-200 С (с разл.)23, Т,пл. 1 20- 122 С24. Т.пл. 174"176 С (с раэл.)25 Тпл. 120-124 СП р и м е р ы 70-88. Блокированный полипептид подвергают расщеплению с помощью трифторуксусной кислоты по следующим методикам,Е 1, Исходное соединение растворяют в трифторуксусной кислоте(10 мл/г) и проводят реакцию при 2025 С в течение 1-2 ч. Продукт выделяют в виде трифторацетата упариванием раствора в вакууме. Используялиофильную сушку в присутствии не"- большого избытка хлористого водород да, получают соответствуощий хлоргидрат.Л. Осуществляют, как и в Г 1, ноприменяют водную (90 или 95 об.4)трифторуксусную кислоту,Е 3 Осуществляют, как и в Е 1, ноприменяют водную (90 или 95 об.4)трифторуксусную кислоту в атмосфереазота в присутствии противонагарногосредства, например 2-меркаптоэтанола,Примечания (сноски) к табл. 31, Соль НС 12. Соль уксусной кислоты3. Соль трифторуксусной кислоты(ТФК)Соль 2 ТФК405. Выделяют осаждением послефильтрования через диатомовую земле.6. Осаждают добавлением петролейного эфира (т.кип. 60-80 С)7. Выделяют в виде высушенноголиофильной сушкой порошка иэ водыили смеси воды с трет.-бутанолом.8. См. сноску 7, в присутствииНС 1,9, Очищают на Сефадексе С 15 в5 об,З водной уксусной кислоты.10. Т. пл, 150-155 С11. Т.пл. 166-168 СП р и м е р 89. К 235 мгмешивают при температуре окружающейсреды в течение 3 ч. Раствог упаривают в вакууме, разбавляют водой иподкисляют разбавленным растворомсоляной кислоты. После осветленияфильтрованием раствор подвергаютлиофильной сушке, продукт растворяютв водном 50,"-ном растворе уксуснойкислоты и пропускают через колонку,заполненную Сафадексом С 15, элюатвновь лиофилизуют, получают .Н-Туг-Р-Бег-С 1 у-РЬе(бН)-1,ец-ОН,КС 0,38.П р и м е р 90, При обработкеН-Ме-Р-Бег-С 1 у-РЬе(6 Н)-1.еи-Сйе (исходное соединение 102) в водномрастворе гидроокисью натрия (2 экв.)с последующим проведением процессапо методике примера 89 получаютН-Ее-Р-Бег-С 1 у-РЬе(бЩ -1.ец-ОН,й 0,44.П р и м е р 91. 140 мг(224 мкмоль) Ас-Туг-Р-А 1 а-С 1 у-РЬе-Ьи-ййе (исходное соединение 123)растворяют в 10 мл теплого диоксанаи постепенно температуру растворадоводят до температуры окружающейсреды, после чего добавляют 12 млводы и 1 н.водный раствор гидроокисинатрия (0,75 мл, 3,5 экв.ч.). Смесьинтенсивно перемешивают при температуре окружающей среды в течение2,5 ч, затем большую часть диоксанаотгоняют в вакууме. Остаток подкисляют добавлением 1 н.раствора соляной кислоты. Полученную суспензиюконцентрируют в вакууме. К остаткудобавляют водный аммиак вместе сводным 0,05 М раствором ацетата аммония до получения прозрачногораствора. Изыбток аммиака упариваюти продукт чистят на колонке, заполненной Сефадексом б 25, в водном0,05 И растворе ацетата аммония.Элюат лиофилизуют, получаютАс-Туг-Р-А 1 а-С 1 уЪееи-ОН, йР0-56, йР 0,47Способы, указываемые в таблицахзначениями Н 1-Н 13 включительно,Е 1-Е 10 включительно и Г3 включительно соответствуют значениям, приведенным, соответственно, в примерах 1-42, 43-69 и 70-88. Другие значения расшифровываются ниже,Реакции активного сложного эфираА 1, Раствор подходящего аминосоединения (1 моль) и соответствующего активного сложного эфира(11 ммоль) в диметилформамиде (ми 9"4518 10нимальный объем) выдерживают при20-25 С до отсутствия положительнойреакции с, нингидрином 15 -50 ч. Реакционную смесь концентрируют ввакууме и выделяют неочищенныйпродукт или осаждением его при добавлении подходящего органического растворителя, или обработкой водой, илисмесью воды и подходящего органи 1 О ческого растворителя, например эфира.При необходимости осуществляют дополнительную очистку.А 2, Осуществляют, как и в А 1, заисключением того, что в качестве5 реакционной среды применяют этилацетат при 4 С,А 3. Осуществляют, как и в А 1, нопри добавлении 1-оксибензотриазола(примерно 0,2 ммоль).2 о А 4. Осуществляют, как и в А 1, нореакционную смесь выдерживают при 4 С.А 5. Осуществляют, как и в А 1, нопри добавлении 1-оксибензотриазола(примерно 0,2 ммоль), и всю смесь25 выдерживают при 4 ОС.Реакции смешанного ангидридаВ 1. Раствор подходящего кЭрбоксилсодержащего компонента (1 ммоль) вдиметилформамиде (примерно 5 мл) охзо лаждают до температуры от -20 до40 С и обрабатывают И-метилморфолином (1,05 ммоль)а затем изобутилхлороформиатом (1,05 ммоль), Смесьперемешивают при температуре от -20одо -40 С в течение 5 мин, а затемдобавляют раствор аминокомпонента(1 ммоль) в диметилформамиде. Прииспользовании соли аминокомпонентадобавляют также Х-метилморфолин40 (1 ммоль), Смесь перемешивают при20-25 С до 24 ч завершения реакции,затем ее упаривают в вакууме. Остаток распределяют между разбавленнымводным раствором лимонной кислоты45 и подходящим, не смешивающимся с водой органическим растворителем, обычно с этилацетатом,Продукт переходит в органическуюфазу, которую отделяют и промываютводным раствором лимонной кислоты иводным раствором бикарбоната натрия,сушат и упаривают в вакууме. Если ненайден подходящий растворитель, топромывают сухое вещество которое55затем выделяют фильтрованием послеокончательной промывки водой.В 2, Осуществляют, как и в В 1 нов качестве третичного основания применяют триэтиламин.901518 45 56 55 83. Осуществляют,как и в В 1, но применяют этилхлорформиат с образованием смешанного ангидрида.В 1, Осуществляют, как и в В 1, но смешанный ангидрид получают с этилхлорформиатом и М-метилморфолином в тетрагидрофуране. 35, Осуществляют, как и в 01, носмешанный ангидрид получают с этилхпорформиатом и в качестве третичного основания применяют триэтиламин.Реакций азидаС 1, Гидразид (1 ммоль) карбоксильного компонента растворяют в диметипформамиде (примерно 5 мл), охлаждают до -20 С и превращают в азидобработкой 6 М раствором хлористоговодорода (5-6 ммоль) в диоксане, азатем в трет.-бутилнитрит;е(1,2 ммоль). Исчезновение гидразидаиз раствора выявляют нанесением смеси на Фильтровальную бумагу с последующим добавлением смеси хлорногожелеза и феррицианида калия. Смесьперемешивают в течение 10 мин при-10 С и нейтрализуют добавлением эквивалентного количества триэтиламина (т.е. 5-6 ммоль) и необходимогоаминокомпонента (1 ммоль), растворенного в диметилформамиде (3 мл), Прииспользовании соли аминокомпонентана этой стадии также добавляют требуемое количество триэтиламина(1 ммоль), Реакционную смесь затемоперемешивают при 0-4 С в течение18-21 ч. Осадок отфильтровываю,фильтрат упаривают в вакууме и остаток, растворенный в растворителе,не смешивающемся с водой, промываютводной лимонной кислотой, воднымраствором бикарбоната натрия и водой, продукт выделяют или упариваниемраствора или Фильтрованием, есливыпадает осадок,Реакции ИИ -дициклогексилкарбодиимидаД 1, Подходящий карбоксилсодержащий компонент (1 ммоль) растворяютв диметилформамиде (5 мл) и перемешивают при М С при добавлении Х,И -(1,1 ммоль) и необходимого аминокомпонента (1 ммоль), Смесь продолжаРют перемешивать приСили в некоторых случаях при 20-25 С до отсутствия положитепьной реакции нанингидрин (до 18 ч), Если аминокомпонент берут в виде соли, то к реакционной массе добавляют в начлереакции триэтиламин (1 ммоль). Осадок отфильтровывают, продукт выделяют упариванием Фильтрата в вакууме,5 остаток растворяют в подходящем органическом растворителе, напримерв этипацетате, и промывают последовательно водным раствором лимоннойкислоты, водным раствором бикарбо О ната натрия и водой, после чего высушенный экстракт упаривают или осаждают продукт добавлением подходящего осадителя, например петроМейногоэфира (т.кип. 60-80 С).5 Д 2. Осуществляют, как и в Д 1, но при добавлении к реакционной смеси .1-окси бензотриазола (2 ммоль),Д 3 Подходящее карбоксилсодержащее соединение.(1 ммоль) растворяют в сухом тетрагидрофуране( 2 мл) и добавляют М-оксисукцинимид (1 ммопь) а затем раствор ИИ -дициклогексип(карбодиимида (1 ммоль) в тетрагидрофуране (1 мл), Через 15 мин добавляют аминокомпонент (1 ммоль) и смесь перемешивает при 20-25 С в течение 15-25 ч, фильтруют, фильтрат упаривают в вакууме, продукт повторно растворяют в подходящем растворителе, например в этилацетате, и промывают раствор последовательно водным раствором лимонной кислоты, водным раствором бикарбоната натрия и водой, сушат и упаривают в вакууме.Реакция восстановления С 1. Для получения производных гексагидрофенилаланина подходящее промежуточное соединение, содержащее Фенилапанин (1 ммоль) растворяют в 803-ном водном растворе уксусной кислоты, возможно содержащей некоторое количество хлористого водорода; добавляют катализатор Адамса из окиси платины (50-150 мг) и проводят восстановление пропусканием потока водорода через перемещиваемую смесь при 20-25 РС до завершения реакции, Катализатор отделяют фильтрованием раствора через слой диатомовой земли, Фильтрат упаривают в вакууме,Гидролиз сложного эфираД 1. Сложный эфир (1 ммоль) растворяют в водном 753-ном ацетоне (10- 15 мл), содержащем гидроокись натрия 11,1-1,2 ииопь и раствор перемешивают при 20-25 С до прекращения реакции, что подтверждают спустя2-3 ч тонкослойной хроматографией.Смесь концентрируют в вакуу 1 е, остаточный водный раствор промываютэтилацетатом. Смесь подкисляют добавлением лимонной кислоты и продуктлибо экстрагируют подходящим растворителем, например этилацетатом, либовыделяют упариванием, если это осуществимо,Экстракт промывают насыщенным рассолом, высушивают и упаривайт в вакууме, получают необходимое карбоксилсодержащее соединение.32. Осуществляют, как и в Э 1, ноприменяют смесь воды, метанола иацетона.33. Осуществляют, как и в 31, нов качестве реакционной среды применяют водный метанол.34. Гидролиз проводят с 1 экв,ч,гидроокиси натрия в, воде и продуктвыделяют в виде его натриевой солиупариванием под вакуумом.Д 5. Осуществляют, как и в 31, нов качестве реакционной среды применяют диоксан,Реакции ацилированияК 1. К охлажденному льдом растворусоответствующего сложного моноэфираглицерина (1 ммоль) в хлороформе(1 мл), содержащем пиридин (3 ммоль),добавляют хлористый ацетил (3 ммоль)ои смесь перемешивают при 20-25 Св течение 18 ч, Растворитель отгоняют в вакууме и остаток вновь растворяют в этилацетате, раствор промывают последовательно водой, насыщенным водным раствором бикарбонатанатрия и водой. Высушенный экстрактупаривают в вакууме, остаток растирают с небольшим количеством метанола и фильтруют.1 Сложный моноэфир глицерина, необходимый для такого ацилирования,получают следующим образом,Сложный эфир, блокированный изопропилиденом (50 ммоль), в 2-метоксиэтаноле (300 мл) нагревают на паровой бане в течение б ч с борнойкислотой (500 ммоль), Растворительотгоняют в вакууме и остаток растворяют в этилацетате,После промывания водой растворсушат и растворитель отгоняют в вакууме, получают сложный эфир в видемасла, которое подвергают дополнительной очистке хроматографией наколонке с применением кремнезема. 5 0 15 20 25 30 35 40 45 50 55 К 2. Осуществляют, как и в К 1, новместо хлористого ацетила применяютхлористый пальмитоил,К 3. Блокированный бензилиденомсложный моноэфир глицерина (1 ммоль)и боную кислоту (4 ммоль) в триметилборате (5 мл) нагревают на паровойбане в течение 20 мин. Триметилборат отгоняют, остаток нагревают допол ительно 20 мин на паровой бане.Полученный продукт снова растворяютв этилацетате (30 мл), промывают водой и извлекают в виде свободногомоноэфира глицерина упариванием. Затем проводят ацилирование с помощьюхлористого ацетила, как и в К 1,К 4. Осуществляют, как и в К 1, нодля окончательного ацилирования применяют хлористый гексаноил.Реакции этерификацииЬ 1. Безводную блокированную аминокислоту (10 ммоль) растворяют в сухом пиридине (10 мл) при 0 С и добавляют бензолсульфохлорид 10 ммоль).Смесь перемешивают при 0 С в течение 15 мин,затем добавляют подходящий спиот (10 ммоль). Смесь перемешивают при 4 С в течение 18 ч, затем пиридин отгоняют в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате(150 мл) и раствор промывают последовательно водой, 1 н.раствором соляной кислоты, водой, 2 н,растворомбикарбоната натрия и водой, Сушати отгоняют. Получают неочищенный продукт.Ь 2, К перемешиваемому растворусоответствующим образом блокированной аминокислоты (5 ммоль) в пиридине (5 мл) при ООС добавляют фенол(10 ммоль) и Х, Х-дициклогексилкарбодиимид (10 ммоль) и всю смесьоперемешивают при 4 С в течение 18 ч.После фиьтрования смеси и упаривания пиридина в вакууме остаток растворяют в этилацетате (100 мл) и промывают последовательно водой, водным 2 н.раствором бикарбонгта натрияи водой,Экстракт сушат и упаривают, получают неочищенный сложный эфир.Ь 3. Подходящим образом замещеннуюаминокислоту (10 ммоль) растворяютв ацетонитриле при 0 С и добавляютнеобходимое количество спирта (10 мл)вместе с пиридином (20 ммоль) иХ,Х -дициклогексилкарбодиимидомВос -. Тую(Вй -В -А 1 а -61 у -Р 15 90451 4 С в течение 18 ч, а затем фильтруют и растворитель отгоняют в вакууме.Остаток обрабатывают этилацетатом и промывают последовательно водным раствором лимонной кислоты, водным раствором бикарбоната калия,Экстракт сушат, упаривают в вакууме, получают неочищенный сложный эфир.Ь 4, Осуществляют, как и в Ь 3, 6 но в качестве реакционной среды вместо ацетонитрила применяют ацетон.Реакция с аммиакомМ 1. Определенный сложный метиловый эфир пептида растворяют в мини- а мальном количестве диметилформамида и приводят в контакт с избытком концентрированного раствора аммиака вО этаноле в течение 3 дн. при 20-25 С. 20Продукт выделяют осаждением водой.Реакция с гидраэиномСложный метиловый эфир пептида (10 ммоль) растворяют в диметилформамиде (25 мл) и добавляют водный д 601-ный раствор гидрата гидразина (50 ммоль), Смесь перемешивают при 20-25 С в течение 18 ч, концентрируют в вакууме примерно до половины РРОЬ ж ОМ, йРЯ 1. К раствору соединения Формулы М2 ТУГ" (ВФ)-д 1, выделенного из55,2 г (100 ммоль) его дициклогексиламиновой соли в сухом тетрагидрофуране (300 мл) добавляют 50 мл(800 ммоль) йодистого метила, 8,6 г 4 вгидрида натрия (300 ммоль) и смеськипятят с обратным холодильником втечение 18 ч на бане при 75 С.Избыток гидрида натрия разлагаютдобавлением зтилацетата к охлажден- фной суспенэии, а затеи воды, получают почти прозрачный раствор, которыйконцентрируют в вакууме,Полученный водный раствор разбавляют водой (150 мл) и промывают дважды. Доводят значение рН водного раствора до 3 добавлением лимоннойкислоты и продукт экстрагируют этилацетатом (400 мл, 2 к 200 мл). Экстракт промывают последовательно водой я(100 мл), 10 вес.об.4 водного раствора тиосульфата натрия (100 мл),а затем вновь водой до нейтральной 8 16обьема, и продукт осаждают добавлением воды.Другие реакцииР 1. 729 г (1 ммоль) Вос-Туг(ВР) -(6,7 ммоль) свежеотогнанного уксусно.го ангидрида перемешивают при 2022 С в течение 10 мин,Полученный раствор нагревают при90-92 С в течение 6 ч, затем охлаждают и обрабатывают водой (15 мл).Каменеподобное вещество отделяют,освобождают от верхнего слоя жидкости декантацией, промывают водой(5 х 15 мл) и растворяют в этилацетате (50 мл),Раствор промывают последовательно 10 вес.об.4 водного растворалимонной кислоты (4 к 10 мл), водой(15 мл) 10 вес.об.Ф водногораствора бикарбоната калия (310 мл)и водой (310 мл), сушат (безводнымсульфатом магния) и упаривают.Спектр ЯИР полученного твердого остатка (530 мг) показывает, что онпредставляет собой смесь ЬРЬЬ иЬ,ПЬВ-Форм структурной формулыСНуСЯИейе -ЮН - СН - СОСИ3ОЛ,1, Я, 0,47 реакции промывных вод. Экстракт сушат над сульфатом магния, упаривают, получают масло, которое суспендируют в теплом петролейном эфире (200 мл, т.кип, 60-80 С), затем растворяют в этилацетате, из охлажденного доо4 С раствора выпадает в осадок продукт Формулы 2-Ме-(Ви )-ОН, т,пл.96-99 С.Ю . К 5,33 г (17 ммоль) раствора соединения Р 1 е-Аг 1 еу-М 1 НС 1 и 2,45 мл (17 ммоль) триэтиламина в 50 мл хлороформа добавляют 3,87 г (17 ммоль) раствора соединения формулы 2 МЬН-СО-С 1. Смесь выдерживают при температуре окружающей среды в течение 16 ч, а затем добавляют 400 мл зтилацетата. Раствор промывают последовательно водой, 20 вес.об. водного раствора лимонной кислоты, высушивают над сульфатом натрия и упаривают в вакууме. Остаток чистят хроматографией на колонке с применением кремнезема, хлороформа, 2 об.4904518 17метанола в хлороформе и систем Р и Я в качестве элюентов, Получают соединение формулы 2-Агд 1 у-РЬе-Лг 1 еу-Г 4 Н, т.пл. 116-120 С (с разл.).51. 17,5 г (30 ммоль) раствора , Е-Туг(В 21)-ОСр и 4,38 г (30 ммоль) Вос-Ы 1 еВБ в 50 мл диметилформамидавыдерживают в течение 18 ч при температуре окружающей среды. После разбавления 500 мл этилацетата раствор промывают последовательно водой, 20 вес.об.4 водного раствора лимонной кислоты и водой. Упаривание высушенного экстракта в вакууме приводит к получению твердого вещества,которое обрабатывает непосредственно раствором хлористого водорода(100 ммоль) в этилацетате в течение 2 ч при температуре окружающей среды. Растворитель отгоняет в вакууме, получают соединение формулы Е-Туг(Вк 1) -МЬНМе, НС 1, т.пл, 223- 224 ОС, йВ 0,82, йф 0,64, йф 0,63,9,4 г (20 ммоль) приведенного хлоргидрата растворяют в 200 мл хлороформа и добавляют 2,8 мл (20 ммоль) триэтиламина, а затем 2,8 мл(20 ммоль) метилового эфира изоцианатоуксусной кислоты. Смесь перемешивают в течение 18 ч при температуре окружающей среды, растворитель упаривают в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате, промывают последовательно водой, 20 вес.об.4 водного раствора лимонной кислоты, насыщенным раствором бикарбоната натрия и водой. Высушенный экстракт упаривают в вакууме, получают соединения формулы Е-Туг(Вя 1) -Агапка-С 1 у-ЯЪ, которое после перекристаллизации из смеси метанола с эфиром имеет т.пл, 107-108 С.Примечания (сноски) к табл.4-19.1. Очищают осаждением2. Т.пл. 160-161 С (с разл,)3. Перекристаллизовывает из петф ролейного эфира 1,т.кип. 60-80 С)Перекристаллизовывают из смеси изопропанола с эфиром (т.пл.181.183 С)5. Перекристаллизовызают из изо- пропанола (т,пл. 193- 194 С)6. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением хлороформа и 2 об,Ф метанола в хлороформе7. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением хлороформа8. Колоночная хроматография на кремнеземе с применением хлороформа и системы Р 189. Перекристаллизация из этилацетата (т,пл. 128-130 С)10. Колоночная хроматография накремнеземе с применением 25 об,Фэтилацетата в циклогексане11. Колоночная хроматография накремнеземе с применением системы С12. Перекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром 1 в (т.кип. 60-80 С, т.пл. 96-99 С)13. Перекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром(т.кип. 60-80 С), т.пл, 202-203 С)Перекристаллизация из этилацетата (т.пл. 122- 123 С)15. Колоночная хроматография накремнеземе с применением систем Ри 016, Перекристаллизация из этилацетата (т.пл. 177 179 С)17. Ьерекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром(т.пл. 60-80 С), т.пл, 122-123 С)18. Перекристаллизация из смеси д этилацетата с петролейным эфиром(т.кип. 60-80 С), т.пл, 108,5-110 С)19, Перекристаллизация из метанола (т.пл, 219-220 С)20. Перекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром(т,кип. 60-80 С), т.пл. 121- 122 С)21. Иерекристаллизация из смеситолуола с бензолом22. Перекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром(т.кип. 60-80"С), т.пл. 133-135 С)23. Колоночная хроматография накремнеземе с применением системы Р24. Колоночная хроматография накремнеземе с применением 3 об,Ф 40метанола в хлороформе25. Колоночная хроматография накремнеземе с применением системы (26. Пзрекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром(т. кип. 60-80 С), т.пл. 122- 124 ОС27. Перекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром(т.кип. 60-80 С), т.пл. 115-118 С28. Перекристаллизация из водного метанола, т.пл. 162-163 С29, Перекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром(т.кип. 60-80 С), т,пл, 130-132 С30. Иерекристаллизация из смесиэтилацетата с петролейным эфиром ,(т.кип. 60-80 С), т.пл. 156-157 С31. Лиофильная сушка в присутствии НС 1