Способ получения тетрадекапептида

(33) США Опубликовано 07,02.82, Бюллетень5 Дата опубликования описания 07,02,82 оо делам изобретений и отератнй(72) Автор изобретения аИностранецДжеймс Эдвин Шилдс (США) Иностра ирмаКомпашт 7) Заявитель и эндСША(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТЕТРАДЕКАПЕт 1 ТИЛА В етоксибензил; -хлорбензилок д или д, или ка Н-О-ЧТЬГ-Р а 1-(31 у. Сув.1.у 5- -А 5Ье-ТЬГ-Яег-Су 5.ОНение формулы е-Р У 5 В.О.н.аРИе-РТЬГ(Вгде В 1.61 у.Суа(В 8.ТГР(В 6) 1 з)-Бег(В 4.1-у 5(В 2)-А 5у 5(Ве).ТЬГ(ВГу 5(В )Х,или трет.бутил е. (П ереме. , Смо. ватель- водород икар. нил; Изобретение относится к получению ново. го тетрадекапептида, биологически активного соединения, которое может найти применение в биологии и медицине,Известен способ получения пептидов путем одновременного отщепления защитных групп и полимерной смолы от пептидной смолы обработкой соответствующей пептидной смолы фтористоводородной кислотой в присутствии анизола или метилмеркаптана 111.Цель изобретения - получение нового тетрадекапептида.Поставленная. цель достигается тем, что согласно способу получения тетрадекапептида формулы Вэ,В 4 - каждый, водород или бензил;5 Х - ОСН-белил-смолаобрабатывают фтористоводородной кислотой в присутствии анизола или метилмеркаптана,П р и м е р 1. 1 ч-трет-Бутилоксикарбонил.-цистеинил (8-л-метоксибензил) -метилирован- .10 ная полистирольная смола.К 500 мл й, 1 ч-диметилформамида, содержащего цезиевую соль й -трет-бутилоксикар.бонин. (8-л-метоксибензил) -цистеина, полученную из 9,06 г (26,5 моль) свободной кислоты, 15 добавляют 51,0 г хлорметилированной полисти.рольной смолы (0,75 ммоль/г) Смесь перемешивают при комнатной температуре 6 дн. Смо.лу отфильтровьввают, последовательно промьтвают 3 раза смесью 90% диметилформамида оО и 10% воды, 3 раза 95%-ным этанолом и 3 оа.за диметилформамидом, К смоле, суспендированной в 500 мл диметилформамида, добавляют раствор 10,5 г ацетата цезия. Смесь п шивают 6 ди при комнатной температуре И лу отфильтровывают, промывают последо3 904но 1 раз водным диметилформамидом 3 разасмесью 90% диметилформамида и 10% воды,3 раза,95%-ным этанолом 3 раза хлористым метиленом, 3 раза 95 о-ным этанолом и 3 раза хлоро.формом. Малую часть смолы удаляют 4-кратнымсуспендированием в хлороформе, декантируякаждый раз жидкость, Затем смолу высушива-ют в вакууме при 40 С в течение ночи, получают 44,8 г тетрадекапептида, Анализ показывает содержание 0,25 ммоль цистеина на 1 гсмолы. Пистеин определяют в виде цистеиновойкислоты, полученной при кислотном гидролизесмесью диоксана и концентрированной хлористоводородной кислоты 1:1, к которой добавляют небольшое количество диметилсульфоксида.П р и м е р 2. й-грег-Бутилоксикарбонил-валил-глицил- (Я-и-метоксибензил) цистеинил.1-(й -о-хлорбензилокси-карбонил) -лизилЯ-1.-(Я-гг-метоксибенэил)-цистеинил-метилированная полистирольная смола.Продукт, полученный в примере 1 (7,0 г),загружают в реакционный сосуд прибораБекмана 990 для автоматического синтезапептидов и двенадцать из остальных тринадцати аминокислот добавляют в этот автоматический прибор. Полученггую защищенную три.декапептидную смолу разделяют на две равныепорции и концевой остаток вводят в одну изэтих порций. Применявшиеся аминокислоты,а также последовательность их применения,следующией- трет- Бутилоксикарбонил- (о. бензил).1.-серии;й-трет-бутилоксикарбонил-(о-бензил)-1.-треонин;й- трет- бутилоксикарбонил.-фенилаланин;й-трет-бутилоксикарбонил. (о.бензнл)- -1 треонин;й-грет-бутилоксикарбонил-й -о-хлорбензил.оксикарбонил.лизин;й -трет-бутилоксикарбонил- (й-формил) 1.триптофан;й.трет-бутилоксикарбонил:феннлаланин;й-трет- бутилоксикарбонил:аспарагингг-нитрофениловьтй эфир;й- грет-бутилоксикарбонил. Й -о-хлорбензил-оксикарбонил.1-лизин;й-трет-бутилоксикарбонил фп-метокси.бензил)-1-цистеин;й-трет- бутилоксикарбонил.глицин;й-грег- бутилоксикарбонил.О.валин,Последовательность отщепления защитныхгрупп, нейтрализации, сочетания и нового сочетания для введения каждой аминокислотыв пептид следующая 519 41. Три промывки хлороформом (10 мл/гсмолы), по 3 мин каждая;2. Удаление бутилоксикарбоновой группыдвукратной обработкой, каждая 20 мин,смесью 29% трибторуксусной кислоты, 48%хлороФорма, 6% триэтилсилана и 17% хлористото метила (10 мл/г смолы);3. Три промывки, по 3 мин каждая,хлороформом (10 мл/г смолы);1 п4, Одна промывка 3 мин хлористым метиленом (10 мл/г смолы);5. Три промывки, по 3 мин каждая,смесью 90% трет-бутилового спирта и 10%трет-амилового спирта (10 мл/г смолы);7, Нейтрализация тремя обработками,по 3 мин каждая, 3%.ным триэтиламином вхлористом метилене:,8. Три промывки, по 3 мин каждая, хлористым метиленом (10 мл/г смолы);9, Три промывки, по 3 мин каждая,смесью 90% трет-бутнлового спирта и 10%трет-амилового спирта (10 мл/г смолы);10. Три промывки, по 3 мин каждая,хлористым метиленом (10 мл/г смолы);э 5 11. Добавление 1,0 ммоль/г смолы, защищешюй аминокислоты и 1,0 ммоль/г смолый, й-дициклогексилкарбомида в 10 мл/г смолы хлористого метилена с последующим пе.ремешиванием в течение 120 мин;12. Трехкратная промывка 3 мин каждая,хлористым метиленом (10 мл/г смолы);13, Три промывки, по 3 мин каждая,смесью 90% бутилового спирта и 10% трет-амилового спирта (10 мл/г смолы);14, Три промывки, по 3 мин каждаяхлористым метиленом (10 мл/г смолы);15, Нейтрализация тремя обработками,по 3 мин каждая, З о.ным триэтиламином вхлористом метилене (10 мл/г смолы);16. Три промывки, по 3 мин каждая,хлористым метиленом (10 мл/г смолы);17. Три промьвки, по 3 мин каждая,смесью 90% трет.бутилового спирта и 10%грег-амилового спирта (10 мл/г смолы);18. Три промьвки, по 3 мин каждая,45 хлористым метиленом (10 мл/г смолы);19. Три промывки, по 3 мин каждая,диметилформамидом;20. Добавление 1,0 ммоль/г смолы, защищенной аминокислоты и 1,0 ммоль смолы.50 й,й-дициклогексилкарбодиимида в 10 мл/гсмолы смеси диметилформамида и хлористого метилена 1:1 с последующим перемешива.нием в течение 120 мин; 55 21, Три промывки, по 3 мин каждая, диметилформамидом (10 мл/г смолы);22, Три промывки, по 3 мин каждая, хло.ристым метиленом (10 мл/г смолы);5 9045123. Три промывки, по 3 мин каждая,смесью 90% трет-бутнлового спирта и 10%трет-амилового спирта;24. Три промывки, по 3 мин хлористымметиленом (10 мл/г смолы);525, Нейтрализация тремя обработками,по 3 мин, 3%-ным триэтиламином в хлористом метилене (10 мл/г смолы);26, Три промьвки, по 3 мин каждая,хлористым метиленом (10 мл/г. смолы);27. Три промывки, по 3 мин каждая,смесью 90% трет-бчтилового спирта и 10%трет-амилового спирта;28. Три промывки, по 3 мин каждая,хлористым метиленом (10 мл/г смолы).Приведенную последовательность обработокприменяют при добавлении каждой из амино.кислот, эа исключением глицинового и аспарагинового остатков. При добавлении глицинового остатка применяют только стадии 1 - 18.Аспарагиновый остаток вводят через его актив.ный л-нитрофениловый эфир. При этом ста.дия 2 была изменена на три следующие последовательные стадии: а) три промьвки,по 3 мин каждая, диметилформамидом(1;3) с последующим перемешиванием в те 30чение 720 мин; в) три промывки по 3 минкаждая, диметилформамидом (10 мл/г смолы).Также изменена стадия (20) и использованл-нитрофениловый эфир 1 ч-трет-бутилоксикарбонил-аспарагина в смеси диметилформамидаи хлористого метилена (1:3) с последующимперемешиванием в течение 720 мин.Готовую пептидную смолу сушат в ваку.уме. Порцию продукта гидролизуют кипячением с обратным холодильником в течение72 ч со смесью диоксана и хлористоводородной кислоты. Анализ содержания аминокислотв получившемся продукте дает следующие результаты (в качестве стандарта применялсялизин): Азр 1,04; ТЬг 2,68; Бег 1,08;Ча 1 1,12; 01 у 1,04; РЬе 3,87; 1.уз 2,00;Тгр 0,75,Триптофан определяют после 21-часовогогидролиза образца продукта в присутствиидиметилсульфоксида и тиогликолевой кислоты,Цистеин не определен, так как он разрушается нри этом методе анализа.П р и м е р 3. О-Валил-глицил-цисте.инил-лизил.-аспарагинил- .фенилаланил.-фенилаланил.-триптофил лизин.-треонил 1.-фенилаланил.1.-треонил.- серил.-цистеин. где В - водород или трет-бутилоксикарбонил;В, - водород или метоксибеизил;В 2 - водород или о-хлорбензилокси.50 карбонил;Вз,В 4 - каждый, водород или бензил;В - водород или формил;Х - ОСН-фенил.смолаобрабатывают фтористоводородной кислотой 55,в присутствии анизола или метилмеркаптана.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, Шредер Э., Пюбке 1, Пептиды. Ч. фМ., "Мир", 1967, с. 88. К смеси 5 мл аннзола и 5 мл этилмер. каптана добавляют 2,828 г защищенной тетрадекапептид-смолы (уровень замещения 9 60,150 ммоль/г) примера 2. Смесь охлаждаютв жидком азоте и добавляют дистилляцией56 мл фтористого водорода, Получившуюсяосмесь нагревают до 0 и перемешивают 2 ч.Затем фтористый водород отгоняют и к оставшейся смеси добавляют эфир, Смесь охлажодают до 0 и получившееся твердое веществоотфильтровывают и промывают эфиром. Продукт сушат и незащищенный тетрадекапептидэкстрагируют из смеси смолы 1 М уксуснойкислоты. Затем уксуснокислый раствор нодвергают лиофилизации досуха в темноте. По.лучившееся белое твердое вещество суспендируют в смеси 10 мл дегазированной 0,2 М уксусной кислоты и 4 мл ледяной уксусной кис.лоты Получившуюся суспензию нагревают,но твердое вещество при этом не растворяетсяполностью. Нерастворившуюся часть отфильтровывают и мутный бесцветный фильтрат загружают в колонку с сефадексом СР, Условияхроматографирования: растворитель - дегази.рованная 0,2 М уксусная кислота; размерыколонки - 7,5 х 150 см; температура - 26 С;скорость пропускания - 629 мл/ч; объем фракции - 22,0 мл.Мера поглощения света при 280 мкм каждой фракции, нанесенная в зависимости от номера фракции, показьвает большой пик с наследующим уступом, Ультрафиолетовая спектроскопия обнаруживает, что главный пик даетцелевой продукт. Фракции объединяют, Объемфракции 224 - 240 - 4906 - 5280 мл, пик - 5054 мл.Собранные фракции не включают последу.юшсго уступа. Ультрафиолетовая спектроскопияпоказьвает, что присутствует 175 г продукта(выход 24,8%), Титрование аликвоты по Эллману показьвает содержание свободного сульфогидрила в количестве 93,6% от теоретического,Формула изобретенияСпособ получения тетрадекапептида формулы 1 Н-О.Ча 1 Иу.Суз.уз-Авр-РЬе-РЬе.Тгр.уз-ТЬг-РЬе.ТЬгег-Суа-ОН, о т л и ч а ющ и й с я тем, что соединение формулы ПВ-О-Ча 1.9 у-Суа(Я,)-1.ув(В) -Азр-РЬе-РЬе.Тгр.