Способ получения рестриктазы bsp di

)5 С 12 И 9/14 БРЕТЕН био очи л 500 ем, ис (О ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССРОПИСАНИ ВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ(71) Институт биологической и медицинскойхимии АМН СССР(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫВврО(57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических работах. Цельюизобретения является повышение выходацелевого продукта. Изобретение заключается в том, что в качестве продуцента ре. Асбэ йев 1989, ч, 16 Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в научно-исследовательской работе в генетической инженерии и молекулярной биологии.Рестриктаэыкласса (сай 1-специфические эндонуклеазы) широко применяются при изучении первичной структуры ДНК, в молекулярном клонировании, изучении структурно-функциональной организации генома, выяснении механизмов экспрессии генов, в частности роли метилирования в этом процессе.В литературе описано более 1100 эндонуклеаз рестрикции, одна из которых выделена из Ясгер 1 ососсцз ацгецз ЗА.Этот фермент имеет 116 участков узнавания на ДН К бактериофага Л, 87 - на ДН К аденовируса Ас 2, 8 - на ДНК обезьяннего стриктазы используют В.ЯрЬаегсць ВКМ В, который выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами. Биомасса В,зрЬаегсцз ВКМ В(О) содержит новую эндонуклеазу рестрикции ВзрО, узнающую и расшепляющую последовательность ДНК 5 ОАТС3 в количествах, достаточных для получения рестркактазы в препаративных масштабах. Для иэошизомера ВэрО-рестриктазы Бац ЭА выход очищенного фермента 500 ед на 1 г сырого веса биомассы, Выход очиц,енного препарата рестриктазы Вэр О составляет 1600 - 2000 ед, активности на 1 г сырой биомассы, что в 3 - 4 раза превышает укаэанные цифры для рестриктазы Яэц ЗА,вируса ЯЧ 40, 22 - на плазминиодного на ДНК р 174.Содержание рестриктазы БацЗА вмассе Я,ацгецв ЗА не указано, выходщенного препарата фермента составляед/г биомассы,Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта,Поиск штамма-продуцента осуществляли с помощью разработанного экспресс-метода определения рестриктазнойактивности в толуольных лизатах из клетокмикроорганизмов с последующим электрофоретическим разделением в агароэном геле продуктов расщепления ДНК.Поставленная задача достигается тчто в качестве продуцента рестриктазыгользуют Вэсцз зрЬаегсцз ВКМ В1), который выращивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, в условиях аэрации. целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами.Рестриктаза Бвр О 1 - изошизомер ЗаоЯАузнает участок нуклеотидной последовательности ДН К 5.ОАТС 3 и расшепляет ДНК фага Л по 116 участкам, ДНК вируса ЗЧ 40 - по 8, ДНК плазмиды рВВ 322 - по 22 и не гидролизует,ДНК рх 174,Штамм Вас 1 ив эрЬаег 1 саз ВКМ Вбыл получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранится по номером ВКМ ВССМ 1087-Вц 386- АТСС 10208= И, Я. Я тй 966 (Каталог культур Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов),Характеристика штамма.Морфологические особенности.Палочки подвижны, грамотрицательны, Культурально-биохимические свойства, На скошенном агаре рост по штриху обильный, На чашках с мясопептонным агаром колонии крупные, матовые, На мясопептонном бульоне Хоттингера заметное равномерное помутнение, осадок.Отношение к кислороду - аэроб.Лакмусовое молоко - свертывание, пентонизация. Индол - не образует, На глюкозе - кислота+, газ-, маннит-. Желатина уколом - разжижение.Оптимальные условия выращивания и хранения культуры.Культура В,эрйаег 1 свв ВКМ Вхорошо растет нэ твердых и жидких полноценных питательных средах; масопептонном агаре, бульоне Хоттингера, средеВ Оптимум роста культуры при рН среды 7,2 - 7.4, При рН 10 культура не растет.Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу Ввр 01, достигается в том случае, когда штамм-продуцент выращивают на питательной среде Хоттингера, которая содержит в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 5 г ИаС 1, 1 г К 2 НРО 4 и до 1 л Н 20,Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды,Рабочие культуры пересев: от на среду Хоттингерэ один раз в 8 - 10 дней, Хранят культуру в полужидком агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизиронэнном виде в ампулах.Выделение рестриктазы Взр 01 производят фракционированием полиэтиленимином и хроматографией на колонках с аффинным сорбентом и ионообменниками. 5 10 1 Г, 20 25 30 35 40 45 50 55 Инкубационная смесь дпя определения активности рестриктэзы ВзрОобьемом 50 мкп содержит 0,01 М трис-НС 1 буфер(рН 7,4) 0,01 М гх 9 С 12, 0,001 М дитиотреитолэ (или .,007 М 2-меркэптоэтанолэ) и 2 мкг ДНК фага Л . Инкубацию проводят при 37 С в течение 60 мин, Продукты расщепления Д 11 К фага Л рестриктэзой ВзрО 1 анализируют в 1,47 ь-ном агарозном геле с последующим прокрашиванием геля бромидом этидия. Зэ единицу активности фермента принимают то минимальное количество (в мкп), которое необходимо дпя полного расщепления 1 мкг ДНК фага Л при 37"С за 1 ч инкубэции в стандартных услонияк инкубационной смеси.П р и м е р 1, Культуру В, зрЬэегсцз ВКМ 8-752 предварительно адаптируют в течение нои при 37 С н условиях аэрации на основной питательной среде, годеркащей в 1 л 250 мл основного перевара Хоттингера, 5 г МэС 1, 1 г К 2 НРО и до 1 л надь; Инокулят дпя ферментерэ готовят, пересеная адаптированную культуру на 1 и свежей среды из ргсчетэ 1:10 и размножают в условиях аэрации.Фер,ентацию культуры проводят после добавления в среду инокулятэ в соотноше. нии 1:10 к объему среды при 37 С и условиях аэрации (рН среды 7,2 - 7,4).Во время выращивания рН культурально жидкости поддерживают н пределах 7 1 - 7,6. Выращивание продолжают до достикения конца логарифмической фазы роста, В ыход сы рой биомасс ь составляет 3 - 4 г/ и купьтуральной жидкости Содержание рестриктазы ВзрО 1 в биомассе составляет 7000 - 9000 ед/г.Выделение рестриктазы ВврО.5биомассы Вас 1 в врэегсов БКМ Всуспендируют в буферном раствореклетки разрушают ультразвуком при 2 - 40 С, После удаления остатков клеточных оболочек и неразрушенных клеток с помощью ультрэцентрифугировэния к бескпеточному экстракту добавляют полиэтиленимин до конечной концентрации 1;/ раствор оснетпяют центрифугиравэнинм и ведут последовательно крамэтарэфию нэ ДЭАЭ-целлюлозе, голубой сефарозе и фосфоцелл юпозе.Получают 10000 ед активности фермента в 10 мп глицеринового буфера Выход счищенногп препарата рестриктэзы 2000 ед нэ 1 г сырого веса биомассы Препарат рестриктаэы ВзрО стабильно сохраняет активность в течение не менее 3 - 5 мес при хранении при -200 С Фермент не содержит примесей фосфэтаз, экзонуяпеээ и неспеци1707077 Биомасса штамма ВасИов зрЬаегс в В;М Всодержи новую эндонуклеазу рестрикции ВрО, узнаюгцую и расщ.пляющую нуклеотидную последовательность ДНК 5, 5 АТС , 3 в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы ВзрО в биомассе 7000 - 9000 една 1 г.Выход о игце;.:ной рестриктазы Ва ЗА, изо иизомера В;,рО, 500 ед на 1 г бисмассы Составитель Р,СокаловТехред М.Моргентал Корректор В.Гирняк 1Редактор И Дербак Заказ 241 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101фических эндонуклеаз, пригоден для картирования ДНК и всех видов генно-инженерных работП р и м е р 2, Культивирование штаммаВасИвз зрпаегсов ВКМ Впроводятаналогично примепу 1, но в качестеае питательной среды исоольэуют средуВ, содержащую в 1 л 10 г триптона, 5,0 г дрожжевогоэкстракта, 10,0 г йаС и до 1 л воды.Выход биомассы 2,5 - 3,5 г/л культуральной жидкости, После проведения очистки фермента по примеру 1 выходреет риктазы В ь р О составляет 1600 ед/г биомассы,Таким образо" 1, по предлагаемому способу получают новую рестриктазу ВзрО,Для рестриктгзы Варвыход очищенного фермента составляет 1600 - 2000 ед.активности на 1 г сырой биомассы, то в 3 - 4 оаза превышает известные цифры для 5 Яаа 3 А (500 ед).Рестриктаза ВьрО из В.зрЬаегсов ВКМВпредставляет интерес для молекуляр.но-генетических исследований в плане ее использования для изучения процессов в 1метилирования ДНК. Эот связано с особенностями расщепления сайта узнавания 5. 6 АТС , 3 этим ферментом и его лзошиэомерами МЬо и Орп в зависимости от метилированного основания (аденин или цитозин) 15 в участке узнавания.Формула изобретения Способ получения рестриктвзы ВзрО,предусматривающий культивирование продуцирусщегс микроорганизма на питатель ной среде, содержащей источники углерода,азота и минеральные соли в условиях аэрации, разоушение клеток и выделение ферк;ента из бесклеточного экстракта и хроматографическую очистку, о т л л ч а ю щ и й ". я тем, что, с целью повышениявыхода целевого продукта, в качестве продуцируюшего микроорганизма используется штмм Васшв ярЬаегсцз ВКМ В,