Питательная среда для культивирования штамма рsеudомоnаs sтuтzеri вкпм в-4724 продуцента рестриктазы ps и 1

,цр,ЯфЯ ТЕЛЬСТВУ ин, С.Х.Дегтярев ДЛЯЕОПР Я КУЛЬТИ ООМОМАЯ ОДУЦЕНТА кробиол ных сре чныи гидролизат тативного гидроучае почек живосушиванием на гии, сред ерм том,вани Рзец держ источ ский солиГОСУДАРСТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ С(56) Аркадьева З.АТрифонова Т.В Агапова Н.С. и Козлова Е.И, - Научн, докл, высшей школы биол. науки, 1976. М 7, с, 113-115,6 пцегоз ТЯ., Огеепоц 9 Ь 11 еЬЫКгацс 1., йоЬепз Й,.1, Тао печч гезтг 1 стоп епбопцсеазез 1 гогп Рго 1 ечч чц 19 аг 1 з, - Мцс 1 ес Ассз Вез 1981, чо 1, 9, М 18, р, 4525-4536.(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ВИРОВ А Н И Я . ШТАММА Р ЗТОТЕЕ 81 В КП М В7 - РЕСТРИКТАЗЬ РЯО 1(57) Изобретение относится к м гии и касается состава питате Изобретение относится к микробиолов частности к составам питательныхпредназначенных для культивировародуцентов рестриктазы РЯО 1.Цель изобретения - повышение выхода ента и его активности.Сущность изобретения заключается в то питательная среда для культивироя продуцента рестриктазы - штамма бопопаз зтцсег ВКПМ Всаит в качестве питательной основы и ника аминного азота панкреатичепочечный гидролизат и минеральные(з 1)з С 12 К 1/20, 9/22//(С 12 М 1/ С 12 Б 1;38) предназначенных для культивирования гродуцентов растриктазы Рзц 1, С целью повышения выхода фермента и его активности предлагают использовать для выращивания продуцента рестриктазы Рзц в Рзецсощопаз зтциег ВКПМ - 4727 питательную среду, содержащую в качестве питательной основы и источника аминного азота панкреатический почечный гидролизат с содержанием, %; общий азот 11,2; аминный азот 6,7; зола 9;7; влажность 4,1, при следующем соотношении компонентов, г/л: панкреатический почечный гидролизат 15,0- 20,0; аммоний сернокислый 1,0 - 2,0; натрий лимоннокислый 0,5- 0,7; хлористое железо 0,001 - ,0,002; вода до 1 л. При этом выход биомассы достигает 12,5 - 13,0 г/л культу- ральной жидкости, выход рестриктазы 10000 - 15000 ед,/г биомассы, а активность увеличивается до 125000 - 195000 ед./л культуральной.жидкости, что в 2 - 5 раз превышает аналогичные показатели на известной среле, 1 табл,Панкреатический почепроизводят путем ферменлиза отходов (в данном слтных) с последующим вьраспылительной сушилке.Панкреатический почечный гидролизат представляет собой порошок светло-коричневого цвета, Он богат важными жизненно необходимыми элементами для нормального роста, развития бактерий, проявления биосинтетической активности,Почечный гидролизат содержит, 0: общий азот 11,2; аминный азот 6,7: зола 9,7; влажность 4,1, Кроме того, так как в почкахживогных содержатся и другие биологически активные вещества (витамины, микроэлементы и др.), то при приготовлении гидролизата, он обогащается этими веществами.Введение панкреатического почечного гидрализата способствует активизации роста, стимулированию жизнедеятельности бактерий и накоплению рестриктазной активности.Введение сернокислого аммония способствует дополнительному питанию бактерий аминным азотом и серой. В качестве источника углеродистого питания в питательную среду вводят лимоннокислый натрий, В результате совместного использования лимоннокислого натрия и сернокислаго аммония происходит поддержание рН во время выращивания культуры в оптимальных предзлах (7,2). Ионы натрия совместна с ионами железа, входящими в состав хлорида железа, воздействуют на дыхательные центры бактерий.При введении пакреатического почечного гидролизата в количествах менее 15,0 г/л (например, 12,5 г/л) снижается выход биомассы и фермента, так ак не хватает амин- ного азота для роста и развития бактерий Рзецбогпопаз зтцтхег 1 и, соответственна, для биосинтеза рестриктазы Рзц 1, При введении панкреатического почечного гидролизата в количествах более 20,0 Г/л (например, 22,5 г/л) снижается выход биомассы и фермента, так как происходит репрессия роста бактерий и биосинтеза рестриктазы Рзц 1,При введении сернокислога аммония в количествах менее 1,0 г/л 1 например, , 0,5/л) происходит снижение выхода биомассы л рестриктазы Ры 1, так как количества ионов аммония не дсстаточно для подщелачивания среды и поддержания рН. При введении сернокислого аммония в количествах более 2,0 г/л например, 2,5 г/л) снижается выход биомассы и рестриктазы Рзц, так как происходит ингибированле рсста бактерий и биасинтеза фермента,При введении лимоннакислого натрия в количествах менее 0,5 г/л (например, 0.4 г/л) происходит снижение выхода биомассы бактерлй и рестриктазы Рзц 1 вследствие того, чта не хватает ионов натрия в среде для активации клеточного дыхания бактерий, Введение лиманнокислаго натрия в количествах более 0,7 г/л (например.0,8 г/л) вызывает снижение выхода биомассы бактерий и рестриктазы Рзц 1, так как происходит ингибирующее воздействие на дыхательные центры клеток. Введение хлорида железа,в количествахменее 0,001 г/л (например, 0,0005 гlл) приводит к снижению выхода биомассы и рестриктазы Рзц 1, так как не хватает ионов5 железа в среде для активации клеточногодыхания бактерий и ионов хлора для питания кульэуры, При введении хлорида железав количествах более 0,002 г/л например,0,0025 г/л) происходит снижение выхода10 биомассы бактерий и рестриктазы Рзц 1вследствие того, чта происходит репрессивн; воздействие на дыхагельные центры иизбыток ионов хлора ингибирует рост, развитие и биосинтетическую активность кульП р и м е р 1, Питательная среда содержис г/лПанкреатический почечныйгидр олизат 20,020 Сернокислый амманий 2,0Лимоннокислый натрий 0,7Хлорид железа 0,002Вода До 1,0 лОживление штамма Рзецбоглопаз25 зтциег 1 131 ВКПМ В - 4727 осуществляют насухом питательном агаре (сухой питательный агар 35,0 г/л; вода 1,0 л) в чашкахПетри. Инкубируют в термокамере при 28 Св течение 24 ч,30 С поверхности агара в чашках Петрикультуру переносят бактериологическойпетлей в качалачные колбы с. питательнойсредой данного состава, рН 7.,2.Выращивают посевной материал при35 28 С в течение 18 ч на качалке,.Ферментацию культуры проводят напитательной среде данного состава прирН 7,2, температуре 28 С, перемешивании200 об/мин, подаче воздуха: 2 сбъема ваз 40 духа на 1 обьем питательной среды, выращива от до достижения оптической плотностибактериальной суспензии 1,7 опт,ед, (ЗЭК,филь.гр М 6, кювета 0,5 см).Выход биомассы 13,0 г/л культуральной45 жидкости.Выход рестриктазы Рзц 1 15000 ед,/гбиомассь; 195000 ед,/г культуральной жидкости.Для определения активности фермента50 используют метод электрофсреза в геле,Активность фермента определяют вгрубом экстракте биомассы бактерийРзецдагпапаз ыциег 1 131 ВКПМ В - 4727 ив конце выделения (после хроматографии на55 колонке с фосфоцеллюзай).За единицу активности рестриктазыРьц 1 принимают минимальное количествофермента, которое требуется для полногооасщепления 1 мкг ДНК фага л, в течение 1 чпри 3/ С, 1698286Выделение фермента проводят следу,ощим образом.50 г биомассы бактерий Рзецг 1 сгпопаззтцаег суспендируют в 100 мл 10 м 1 Л трисНС 1-буфера, рН 7,2, содержащего 1 О мМ 2 меркаптозтанола, 1 мУ азидэ натри, 1 л 1.11трилона Б (буфер А), и доводят зтим же буфером дс обьема 150 мл, К суспензии добавляют 1,5 мл 10,-ного.тритона Хи150 мгл лизсцима. Лизис проводят 1 ч припостоянном перемешивании, Дальнейшеефракционирование лизата пооводят в системе двухфазного разделения,Полученный лизат добавляют к смеси,состоящей из 37,0 мл 15"-,ь-ного водного раствора декстрана Т, 56 мл 30;4-ноговодного раствора полизтиленгликсля ПЗГ)и 35 мл 4,0 М хлористого натрия (рН смеси6,5), Тщательно перемешивают в течение 15мин и центрифугируют на центрифуге"НоЬ зрееб" (20000 о 20 мин), ВерхнююПЗГ-фазу объемом 120 мл, содержащуюфермент, отбирают, разбавляют двухкратным обьемом буфера А, добавляют тритонХ - 100 (0,1;ь-ный) и накосят на колонку сфосфоцеллюлозой, уравновешенную буфером А, содержащим 0,1 ф-ный тритон Х 100 (буфер Б), Фермент элюируют 0-1,0 Улинейным градиентом концентрации хлористого натрия в буфере Б, Фракции, содержащие рестриктазу Рзц 1, концентрируютдиализсм против буфера Б, содержащего55-ный глицерин.Получают очищенный фермент Рзц 1 ввиде прозрачной бесцветной жидкости,Рестриктаза Рзц 1 расщепляет ДНК фага Л на 3 сайта,Содержание неспецифических экзо- иэдонуклеаз после выделения отсутствуют,Хранят рестриктазу Рзц 1 при -10 С втечение 1 года.П р и м е р 2. Питательная среда, содержит, г/л;Панкреатический почечныйгидролизат7,5Сернокислый аммонийЛимсннокислый натрий 0,6Хлорид железа ОЯ 015Вода До 1,0 лВыращивание биомассы: адаптациюкультуры, юокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.Выход биомассы 12.75 г/л культуральной жидкости,Выход рестриктазы Рзц 112500 ед,/г биомассы; 160000 ед./л культуральной жидкости,Определение активности, выделениефермента Рзц 1 и хранение осуществляютаналогично примеру 1,П р и м е р 3, Питательная среда содержит, г/л:Панкоеатический почечныйгидролизат 1505 Сернскислый аммоний 1,0Лимоннокислый натрий 0,5Хлсрид железа 0,001Вода До 1,0 лВыоащивание биомассы: адаптацию10 культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1.Вь:ход биомассы 12,5 г/л культуральнойжидкости,15 Выход рестриктизы Рзц10000 ед./гбиомассы; 125000 ед, /л культуральной жидко тиОпределение активности, выделени:фермента Рзц 1 и хранение осуществляют20 аналогично примеру 1.П р и м е р 4, Питательная среда содержит, г/л:Панкреатический почечныйгидоолизат 12,525 Сеонокислый аммоний 0,5Лимоннокислый натрий 0,4Хлорид железа 0,0005Вода До 1,0 лВыращивание биомассы; адаптацию30 культуры, инокуляцию посевного материала, ферментацию культуры проводят аналогично примеру 1,Выход биомассы 5,1 г/л культуральнойжидкости.35 Выход рестриктазы Рзц2300 ед,/г бис"массы; 11730 ед./л кул ьтуральной жидкости.Определение активности, выделениефермента Рзц 1 и хранение осуществля;откак в примере 1,40 П р и м е р 5, Питательная среда содержит, г/л;Панкоеатический почечныйГидролизэт 22,5Сернскислый аммоний 2,545 Лимоннокислый натрий 0,8Хлорид железа 0,0025Вода До 1,0 лВыращивание биомассы: адаптацию. ку ьтуры, инокуляцию посевного материа 50 ла, ферментацию культуры проводят как впоимере 1.Выход биомассы 5,7 г/л культуральнойжидкости,Выход рестриктазы Рзц3100 ед,/г55 биомассы.Определение активности, выделениефермента Рзци хранение осуществляюткак в примере 1,П р и м е р 6, В таблице представленыданные по сопоставительному анализу вы1698286 15,0 - 20,01,0-2,0 0,5-0,7 0,001-0,002Да 1 л 15 Питательн П редла гаема г/ Панк почечный гид лый аммоний ислыи натрии д железа 0,002 ода 1,0 л атическииСернокиЛимонноХлори лиз трий 5,0а 1,0 льтуральнои каст ОО ед,/г биомассы;ед./л культуральной жкости Составитель В СаинаТехред М Моргентал Корректо Редактор А, О Заказ 4367 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета па изобретениям и открытиям при ГКНТ СС 113035, Москва. Ж. Раушская наб 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, ул,Гага ращивания штамма продуцента Рзецдопопав зийкег 1 ВКПМ Вна известной и предлагаемой средах,При выращивании на предлагаемой среде продуцента рестриктазы Рзц 1 - Рзецбогпопав зтциег 1 ВКПМ В - 4727 выход биомассы бактерий возрастает в 2 раза, а выход и активность рестриктазы увеличиваются в 3 - 5 раз по сравнению с известной средой,Формула изобретенияПитательная среда для культивирования штамма Рзецбогпопаз ыцтгег 1 ВКПМ В - 4727 - продуцента рестриктазы Рзц включающая источник аминного азота, минеральные соли и воду, о т л и ч а ю щ а яс я тем, что, с целью повышения выхода фермента и его активности, в качестве источника аминного азота среда содержит 5 панкреатический почечный гидролизат. а вкачестве минеральных солей - сернакислый аммоний, лимоннокислый натрий и хлористое железо при следующем соотношении компонентов, в г/л:10 Панкреатический почечныйгидролизатАммоний сернокислыйНатрий лимоннокислыйХлористое железаВода