Способ получения биомассы micrococcus luтеns вкпм в-2836 продуцента рестриктазы mlu 1

(9 12 й 9/14, 1/20 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ ИПРИ ГКНТ СССР ТЕТРЫТИЯМ Е ИЗОБРЕТЕНИДЕТЕЛ ЬСТВУ ПИСА К АВТОРСКО выращивавной аэ арг/л воды:экстракт 5; - дй плотностисреды. 4 г (после двух.осфоцеллю) 800 ед,ОС ОО 03 гаемому яв- биомассы(71) Научно-исследовательский конструкторско-.технологический институт биологически активных веществ(56) Баткис Э. ВКадулене Э. Ю., ЯнулайтисА, А, Влияние гидролизатов дрожжей на биосинтез бактериальных рестриктаз. - До. стижения микробиологической практики. - Тезисы докл. 7-го Съезда Всесоюзню микро.- биологич. общества, Алма-Ата, 1985, т. 4, 12.ЯццзаЫ Н., Капазааа Я. Иеа генгстоп епбопцсеазез 1 гогп РачоЬас 1 егцвоеапоЕоТез (ГоМ ) аМ Мсгососсцз цтецз(М 1 ц ) - Оепе. 1981, 16, р. 7378. Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению биомассы для производства эндонуклеазы рестрикции,При получении рестриктаз важным этапом являются стадии оптимизации селекции и культивирования штаммов-проду- . центов с целью достижения более высокого выхода изучаемых ферментов.Выход .рестриктаз и неспецифическое нуклеаэное загрязнение в значительной мере обусловлены составом питательной среды и условиями выращивания штамма-продуцента.Эти данные свидетельствуют об отсутствии обобщенной теории биосинтеза рестриктаз, что обуславливает эмпиричность в подборе условий культивирования штаммов-лродуцентав.Наиболее близким к предлаляется способ получения(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ МСВОСОССОЯ ШТЕОЯ ВКПМ В- ПРОДУЦЕНТА РЕСТРИКТАЗЫ М О(57) Использование; биотехнология. Сущность изобретения; проводят предварительное пассирование посевного материала на: агаризованной среде, содержащей ДНК из тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, и селективный отбор наиболее продуктивных клонов бактерий путем анализа их на содержание целевого фермента. Способ позволяет в 12 - 15 раз повысить содержание целевого фермента в биомассе. 1 табл.,Мсгососсцз ц 1 ецз, вклнцнающий ние культуры при 37 О с цнтенси цией в среде, содержащей, бактопептон 10; дрожжевой МаС 5; глюкоза 1, до оптическо А 26 о=1. Выход биомассы с 1 лВыход фермента из 1 г клеток хроматографических стадий (ф лоза Р - 11 и ДЕАЕ-целлюлоза ДЕ акт.Недостатком известного способа является низкое содержание рестриктазы Мцв биомассе.Цель изобретения - повышение содержания рестриктаэы Мц .Поставленная цель достигается тем, что способ получения биомассы Мсгососсцз цтецз ВКПМ В- продуцента рестриктазы Мцпредусматривает приготовление посевной культуры на агаризованной среде, содержащей в качестве добавки ДНК изти-муса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, последующий селективный отбор клонов с наибольшим содержанием рестриктазы М 1 о 1 и минимальным загрязнением неспецифическими нуклеазами, засев отобранным клоном жидкой питательной среды и выращивание в оптимальных условиях.При реализации этого способа достигается уровень содержания фермента Мц 1 в грубом экстракте клеток 12000 - 15000 ед. акт./г влажных клеток. После проведения двух стадий очистки (фосфоцеллюлоза Ри ДЕАЕ-целлюлоза ДЕ - 52) из 1 г клеток получают 10000 - 12000 ед. акт. очищенного фермента Мо, В качестве контроля проводят пассирование и селекцию посевного материала на средах без ДНК и с добавлением ДНК в различных концентрациях.Результаты опытов представлены в таблице.Проведены следующие исследования: анализ клонов на содержание рестриктазы УЬпри пассиравании на средесДНК (первая дорожка - 5 мин инкубации, вторая - 30 мин инкубации одинакового количества клеточного лизата с 0,5 мкг ДНК фага лямбда);анализ клонов на содеркание рестриктазы Ма 1 при пассировании на среде без ДНК (контроль, первая дорожка - 5 мин инкубации, вторая - 60 мин инкубации одинакового количества клеточного лизата с 0,5 мкг ДНК фага ламбда);анализ биомасс М. 1 цсеоз на содержание рестриктазы Мв 1, полученных с пассираванием на среде без ДНК, с пассированием на среде с ДНК. В пробы добавляли соответственно клеточного лизата 0,5(а); 1,0(б); 2,0(в); 3,0(г); 5,0(д); 10,0(е);0,025(ж); 0,05(з); 0,1(и); 0,15(к); 0,25(л) и 0,75(м) мкл, инкубировали с 0,5 мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч при 37 С.Из полученных данных установлена, что картина полного специфического гидролиза ДНК рестриктазой наблюдается в первой биомассе на дорожке в, что соответствует содержанию фермента 1000 ед. экт./г клеток, во второй - на дорожке к, что соответствует содержания фермента 13500 ед, акт./г клеток (т. е. выше, чем в первой в 2,0/0,15=13,4 раза); Причем ва втором случае при пятикратном избытке (дорожка м) сохраняется картина рестрикции, тогда как в первом при том же избытке (дорожка е) наблюдается размывание фрагментов ДНК,П р и и е р 1. Пассировэние и селекция посевного материала.Штамм М. мерз(коллекционный номер в ВКПМ В) рассевэют на агаризованную среду (рыбный питательный агар), содержащую ДНК тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл, Выращивают в течение 18ч при 37 С. Затем из нескольких отдельных5 колоний (из 8-12) отбирают петлей половину материала и переносят в отдельные пробирки, содержащие по 200 мкл буфера дляразрушения следующего состава: 100 мМтрис-НС 1/ рН 8,0; 50 мМ йаС 1; 0,1 О/-ный10 Тритон Х - 100; 0,01 О(-ный лизоцим, Полученные лизаты (после инкубации при 4 Свтечение 30 мин) используют для определения количества рестриктазы и неспецифиче 15 ского нуклеазного загрязнения (по реакциирасщепления ДНК фага лямбда), Для этогопо 5 мкл лизатэ каждого клона инкубируютс 0,5 мкг ДНК в инкубационной смеси втечение 5 и 30 (60) мин. Затем продукты20 расщепления разделяют электрофорезом вгеле агарозы, Колонии, содержащие максимальный уровень рестриктазы при минимальном загрязнении неспецифическиминуклеазами, используют для культивирова 25 ния (контральный опыт со средой без ДНКпри необходимости выполняют идентично),П р и м е р 2. Получение биомассы.Отобранный клон клеток засевают в 50мл питательной среды для получения иноку 30 лята. После инкубации на качалке при 200 -220 об/мин в течение 18 ч при 37 Сполученным инокулятом засевают .объемсреды (качалочные колбы с 250 мл среды),предназначенный для культивирования, из35 расчета 1 мл инакулята на 100 мл среды.Инкубируют в техже условиях в течение 18ч, Затем после охлаждения клетки собираютцентрифугированием при 5000 об/мин. Выход биомассы; 4,1-4,3 г с 1 л среды. Содер 40 жание фермента 12000 - 15000 ед. акт./гвлажных клеток,Формула изобретения Способ получения биомассы 45 Мсгососсоз Ьсеоз ВКПМ В- продуцента рестриктазы М 1 о 1, предусматривающий приготовление посевной культуры на твердой питательной среде, содержащей добавку, засев ею жидкой питательной сре ды, выращивание в оптимальных условиях,отделение клеток, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью повышения содержания рестриктазы, посевную культуру готовят на агаризованной среде, содержащей в качест ве добавки.ДНК из тимуса теленка в концентрации 0,1 мг/мл среды, и перед засевом проводят селективный отбор клонов с наибольшим содержанием рестриктазы М 1 о 1 и минимальным загрязнением неспецифическими нуклеазами;1738853 Выход биомассы, г/л среды Примечание Содержание фермента МЬ 1,е, акт./г кл.После двух стадий очистки4,0 800 800-1000 3,8 1000-1200 1000-200012000-1500010000-12000 4,1 4,3 4,0 10000-12000 После двух последовательных пассажей на с е е с НК, 0,1 мг/мл 4,1 10000-12000 Редактор В, Петраш Заказ 1978 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина. 101 По известному способуПосле пассирования:на среде без ДНКна среде с ДНК:0,05 мг/мл0,1 мг/мл0,2 мг/мл Повышаетсясодержаниенеспецифических нуклеаз Составитель Л. ЮшковаТехред М,Моргентал Корректор О, Кравцова