Способ определения генетический вариантов каппа-казеина у сельскохозяйственных животных

СОЮЗ СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК 9488 А 5 С 12 0 ГОСУДАРСТВЕННЫЙПО ИЗОБРЕТЕНИЯМПРИ ГКНТ СССР МИТЕТОТКРЫТИЯМ тен ПИСАНИЕ ИЗОБ Авторскому свидетельств(71) Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова и Всесоюзный научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных (72) Г,Е. Сулимова, Г.О. Шайхаев, И.А. Захаров и В.Г, Шевченко(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ВАРИАНТОВ КАППАКАЗЕИНА У СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ (57) Изобретение относится к области генетики и селекции животных, в частности к молекулярной генетики - к способам определения генетипов животных посредством молекулярно генетических маркеров, Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа. Разработан способ определения генетических Изобретение относится к области генетики и селекции животных, в частности к молекулярной генетике, к способам определения генотипов животных посредством молекулярно-генетических маркеров.Цель изобретения - упрощение и повышение чувствительности способа.Для упрощения способа определения генетических вариантов каппа-казеина сельскохозяйственных животных по сравнению с известным способом ряд этапов упрощены, а отдельные исключены. Для выявления генетических вариантов примевариантов каппа-казеина у с/х животных с помощью полимеразной цепной реакции, включающий в себя выделение хромосомной ДНК в количестве 0,5 - 1,0 мкг из клеток крови и использование двух праймеров длиной 23 и 24 нуклеотида, комплементарных противоположным цепям ДНК и фланкирующих исследуемый участок гена, содержащий полиморфный сайт рестрикции для Нпс 1 и Тац 1, проведение амплификации исследуемого участка гена посредством полимеразной цепной реакции с использованием ДНК-полимеразы Т)еппцз Вегеор)1 вз, обработку ампифицированного участка ДНК рестриктазой Н 1 пб 11 или Тац 1 и анализ продуктов рестрикции с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. По сравнению с известным способом обеспечивается его упрощение 6-7-кратное сокращение длительности и 3,5-кратное снижение стоимости определения генетических вариантов каппа-казеина. няется амплификация участка гена каппаказеина с помощью известной полимераэной цепной реакции (ПЦР) с использованием ДНК-полимеразы иэ бактериального штамма Т 1)егвнз Т 1)егп)ор 1)1 оз и двух праймеров,комплементарных противоположным цепям ДНК и фланкирующих участок ДНК, содержащий полиморфные сайты для рестриктаз Н 1 пб П и Тац 1, определяющий генетические варианты каппа-казеина с последующим расщеплением амплифицированного участка ДНК длиной 228 п.н. рестриктаэой Н 1 пб 1 или Тац 1. Появлениедополнительных полос ДНК длиной 128 и 100 п.н. после расщепления по Н пб(Тац ) амплифицированного участка ДНК указывает на существование двух генетических вариантов каппа-казеина типа А и В в геноме животного, В качестве праймеров используются химически,синтезированные олигонуклеотиды: ЯОЕ 23 ТАТСАТТТАТ ООССАТТООАС А и 5 О 024 ТТОАОАТТССТОТОТАОТТТОТТС, структура которых была подобрана на основе анализа известной первичной структуры гена каппа-казеина коровы и вариантами , ЯДРФ по рестриктазам Нпди Та 9 , охарактеризованными в прототипе. Выделение ДНК в прототипе обычно проводится по методу Маниатиса и дррекомендующем получение препаратов ДН К в больших количествах, порядка 10 - 15 мг, в предлагаемом способе используется метод выделения микроколичеств хромосомной ДНК, описанному Сигнер и др, Рестрикция и злектрофо, рез ДНК проводится общепринятымиметодами, а последующие этапы в предложенном способе исключены, что позволяет сократить время анализа в 6 - 7 раз, а также снизить стоимость анализа в 3,5 раза,Я р и м е р 1. Для проведения ЯЦР, основанной на свойстве термофильной ДН К-полимеразы сохранять ферментативную активность после прогревания до 95 - 97 С, синтезируют два праймера химическим способом следующей структуры: Ы Е 23 5-ТАТСАТТТАТООСАТТООАССА и ЯОО 243-ТТОАОАТТССТСТОТАОТТТОТТС, комплементарных противоположным цепям ДНК и фланкирующих участок ДНК гена каппа-каэеина в районе 5-го экзона. Для амплификации составляют инкубационную смесь состава; 100 мкл инкубационной смеси содержат 10 мМ трис-НС, рН 8,4; 2,5 мМ МдС 2; 50 мМ КС, 200 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, четыре бчТР по 200 мкМ каждого, два праймера, ЯОЕ 23 и ЯОО 24, по 0,3 мкг каждого и 0,5 - 1,0 мкг хромосомной ДНК животного из клеток крови. Денатурацию ДНК проводят при 95- 97 С в течение 7 - 10 мин, отжиг праймеров 2 - 3 мин при 55 - 58 С, затем добавляют 2,0 - 2,5 ед.акт. ДНК-полимераэы иэ Тегпщэ йеппорЬз и проводят синтез участка ДНК при 68 - 72 С в течение 4 мин. Последующие циклы включат 1 мин при 95-97 С (денатурация), 1 мин при 55 - 58 С (отжиг) и 2 мин при 68 - 72 С (синтез). Для преотвращения конденсации воды добавляют к инкубационной смеси 80-100 мкл вазелинового масла. После 30 циклов амплификации образец инкубируют дополнительно 5-10 мин при 68 - 72 С для полного завершения ЯЦР. Амплификацию в заданном режиме проводят на программируемом термостате (РегНп Ещег-Се 1 озФзгогпепсз), ДНК из инкубационной среды осаждают эталоном (1/20 объема 5 М ацетата аммония и 2,5 объема холодного 96 -ного этанола), осадок подсушивают и растворяют в 50 мкл буфера ТЕ, рН 7,5 (10 мМ трис-НС, 1 мМ ЭДТА). Для анализа амплифицированного участка ДНК проводят рестрикцию по Нпб , Для этого отбирают 20 мкл амплифицированного раствора ДНК и добавляют в инкубационную среду с 3 мкл 10-кратного буфера для Нпб(50 мМ КаС, 10 мМ трисНС, рН 75; 10 мМ М 9 С 2; 1 мМ дитиотрейтола и 5 ед. акт. Нпби 7 мкл деионизированной воды, инкубируют 1,0 - 1,5 часа при 37 С и продукты рестрикции анализируют на 8 - 10 фполиакриламидном электрофорезе (2-3 ч, 15 - 20 в/см) относительно непорезанного по Нпсамплифицированного участка ДНК. В качестве маркера молекулярной массы берут смесь ВЯр В (Нпб ) - фрагментов ДНК плазмиды рВК 322.Ярокрашивание ДНК в геле проводят бромистым зтидием и фотографируют. Действие рестриктаэы Нпсприводит к появлению дополнительных полос ДНК или исчезновению полосы, соответствующей амплифицированному участку ДНК.1) появление двух дополнительных полос длиной 128 и 100 п.н, указывает на наличие в геноме животного генетических вариантов каппа-казеина типа А и В;2) появление двух дополнительных полос длиной 128 и 100 п,н. и исчезновение исходной полосы длиной 228 п,н. указывает на наличие в геноме животного генетического варианта каппа-казеина типа В;3) дополнительные полосы не появрются, а наличие исходной полосы, соответствующей амплифицированному участку ДНК указывает на наличие в геноме животного генетического варианта каппа-казеина типа А;Использование заявляемого изобретения позволит определять генетические ва рианты каппа-казеинасельскохозяйственных животных неэави. симо от пола и возраста, в том числе у сам цов и эмбрионов, без применени изотопных методов анализа, исключающег блот-гибридизацию, снизить стоимость ана лиза в 3,5 раза, сократить время анализа 6-7 раз и повысить чувствительность анэли за на порядок.Ф ормулаизобретенияСпособ определения генетических ва риантов каппа-казеина у сельскохозяйст венных животных, включающий обработку ЯНК гена каппа-казвина эндонуклеазами1659488 Составитель Е. КузнецоваРедактор Л. Герасимов Техред М,Моргентал Корректор Н.Король Заказ 1821 Тираж 373 Подписное ВНИИПИ Государственного комитете по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж. Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Нпби Тац , с последующим анализом продуктов рестрикции электрофореэом в полиакриламидном геле для выявления дополнительных полос ДНК в геле, указывающих на наличие различных генетических вариантов гена каппа-казеина; о т л и ч а ющ и й с я тем, что, с целью упрощения и повышения чувствительности способа, перед обработкой ДНК эндонуклеаэами проводят амплификацию.участка того же гена с использованием химически синтезированных праймеров, 56 Е 23 ТАТСАТТ ТАТООССАТТООАССА и 360 24ТТОАОАТТССТСТОТАОТТТОТТС и цепной полимеразной реакции, осуществляемой термофильной ДН К полимераэой.