Способ обнаружения гомологичных нуклеотидных последовательностей

(51)5 С 12 0 1/68 ЕТЕНИЯ ЕЛЬСТ ледовательскии иборостроения А.В. Дроздов,р. 346 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМПРИ ГКНТ СССР ОПИСАНИЕ К АВТОРСКОМУ СВИД(56) Ргос, Мат, Асад. Яс 1, 19843470,(54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ГОМОЛОГИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности, может быть использовано при диагностических исследованиях в научно-исследовательских работах,Цель изобретения - упрощение и ускорение способа.Для этого антитела против гаптенизированной индикаторной последовательности получают иммунизацией животного любым гаптенизированным фрагментом нуклеиновой кислоты, антитела коньюгируют с их иммунохимической меткой, а обработку продукта взаимодействия гаптенизированной индикаторной последовательности и исследуемой последовательности осуществляют непосредственно конъюгатом,П р и м е р 1. Для модификации ДНК с помощью й-ацетил-М-ацетокси-аминофлюорена (АААФ) 5 мг ДНК (из тимуса теленка) растворяют в 5 мл 2 мМ(57) Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине и может быть применено при диагностике инфекционных и наследственных болезней, Цель изобретения - упрощение и ускорение способа, Установлена воэможность использовать антитела к конкретному гаптену для выявления любого гаптенизированного комплекса нуклеиновой кислоты с этим гаптеном, конъюгировать антитела к гаптену с иммуноферментной меткой для реакции гибридизации, а обработку продукта взаимодействия индикаторной и исследуемой последовательностей оснований проводить непосредственно конъюгатом с иммунохимической меткой. натрий-цитратного буфера (рН 7,0) и денатурируют кипячением в течение 10 мин. К раствору ДНК добавляют 5 мл раствора АААФ в 400-нам этиловом спирте с концентрацией 1 мг/мл. Инкубируют при 37 С в темноте в течение 3 ч. Нерастворенный АААФ удаляют центрифугированием (1000 9, 5 мин, 20 С). Очистку супернатанта от АААФ проводят пятикратной экстракцией эфиром. К раствору добавляют 3 мл 3 М ацетата натрия (рН 4,8) 20 мл этилового спирта и выдерживают 2 ч при -20 С. Осадок АААФ-ДНК собирают центрифугированием (50009, 5 мин, 20 С)и растворяют вфизиологическом растворе в концентрации 0,6 мг/мл.Иммунизацию кроликов проводят смесью модифицированной ДНК (АААФДНК) с метилированным бычьим сывороточйым альбумином (МБСА). Для однойиньекции смешивают 0,4 мл раствора АААФ-ДНК, 0,1 мл 0,250-ного раствора МБСА, 0,5 мл полного адьюванта Фрейнда. Смесь вводят в подушечкую лапы кролика четыре раза с недельным интервалом. Затем с недельным интервалом делают три внутривенных инъекции смесью АААФ-ДН К с МБСА без адьюванта, Через неделю после последней инъекции у кроликов берут кровь,Сыворотку крови отделяют центрифугированием (1000 ц, 10 мин, 20 С) и разводят физиологическим раствором в отношении 1:1. К 10 мл сыворотки добавляют 10 мл насыщенного раствора сульфата аммония и выдерживают при 4 С в течение 10 ч.Центрифугируют (5000 ц, 10 мин, 4 С), осадок растворяют в 5 мл физиологического раствора и добавляют 2,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония, Выдерживают при 4 С в течение 10 ч и центрифугируют (5000 д, 10 мин, 4 С). Осадок анти-ДНК иммуноглобулинав растворяют в 1 мл физиологического раствора и диализуют в течение 48 ч при 4 С против физиологического раствора, затем лиофилизируют.Для получения коньюгата пероксидазы хрена с анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинами 5 мг пероксидазы хрена растворяют в 0,45 мл 0,1 М карбонатного буфера (рН 9,3) и добавляют 0,05 мл 0,05 М раствора периодата натрия, Раствор активированной пероксидазь 1 смешивают с 1,5 мл раствора анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинов в 0,1 М карбонатном буфере (рН 9,3) с концентрацией 10 мг/мл. К смеси добавляют 300 мг сухого сефадекса 6-25 и выдерживают 3 ч в темноте, сефадекс удаляют фильтрацией. К фильтрату добавляют 0,4 мл раствора боргидрида натрия с концентрацией 5 мг/мл, Инкубируют при 4 С в течение 2 ч, затем доводят объем физиологическим растворам до 2,5 мл и прибавляют 2,5 мл насыщенного раствора сульфата аммония, Выдерживают при 4 С в течение 10 ч. Центрифугируют (5000 ц, 10 мин, 4 С). Осадок конъюгата пероксидазы с анти-АААФ-ДН К иммуноглобулинами растворяют в 1 мл физиологического раствора и диализуют в течение 48 ч при 4 С против физиологического раствора, Добавляют глицерин до 500-ной концентрации. Срок годности препарата не менее 1 года при температуре 5 +3 С,Полученный коньюгат пероксидазы с анти-АААФ-ДНК иммуноглобулинами используют для выявления АААФ-ДНК. На нитроцеллюлозный фильтр наносят в виде отдельных точек по 10 мкл растворов АААФДНК с концентрациями 10 мкг/мл, 1 мкг/мл, 100 мг/мл, 10 нг/мл, 1 нг/мл, 100 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 пг/мл и по 10 мкл растворов контрольной немадифицираванной ДНК (из тимуса теленка) в тех же концентрациях. Фильтр с ДНК высушивают на воздухе в течение 30 мин, Препарат конъюгата пероксидазы с анти- АААФ-ДНК иммуноглобулинами разводят в отношении 1:200 фосфатна-солевым буфером (ФСБ), содержащим 7 мМ фосфорно- кислого двухзамещенного натрия, 3 мМ фосфорнокислого однозамещенного натрия, 120 мМ хлористого натрия, 0,30 твина, 1,5 мг/мл яичного альбумина, рН 7,4, Фильтр с иммобилизованным ДНК выдерживают в течение 30 мин в буфере ФСБ, затем 1 ч в растворе коньюгата, разведенного в отношении 1;200 буфером ФСБ, Промывают фильтр три раза по 5 мин буфером ФСБ и окрашивают погружением его в раствор хромогенного субстрата, содержащий 0,2%-ный раствор бензидина в зтиловом спирте, 10%-ный от насыщения раствор хлористого аммония. 20 мМ ЭДТА, рН 6,0, 0,3%-ный раствор перекиси водорода. Через 20 с положительные пробы окрашиваются в ярко-голубой цвет.Коньюгат пероксидазы с анти-ДНК иммунаглобулинами выявляет не менее 10 мг АААФ-ДН К и не реагирует с немодифицированной ДНК.П р и м е р 2. Для модификации ДНК сульфированием 5 мг ДНК (из тимуса теленка) растворяют в 7 М мочевине до концентрации 1 мг/мл и денатурируют кипячением в течение 10 мин, К раствору ДНК добавляют 10 мл 3 М раствора 0-метилгидроксиламина (рН 6,0) и 15 мл 2 М раствора метабисульфита натрия (рН 6,0), Инкубируют при 37 С в течение 8 ч затем диализуют против дистиллированной воды в течение 18 ч при 4 С, Добавляют 3 мл 4 М ацетата натрия (рН 4,8) и 75 мл этилового спирта, выдерживают при -20 С в течение 2 с.Образовавшийся осадок сульфированной ДНК (С-ДНК) собирают центрифугированием (5000 ц, 5 мин, 20 С) и растворяют в физиологическом растворе в концентрации 0,6 мг/мл.Иммунизацию кроликов, выделение анти-С-ДНК иммуноглобулинов, получение коньюгата пероксидазы хрена с анти-СДНК иммуноглобулинами проводят по примеру 1, Полученный коньюгат пероксидазы с анти-С-ДНК иммуноглобулинами используют для выявления С-ДНК. На нитроцеллюлозный фильтр наносят в виде отдельных точек по 10 мкл растворов С-ДНК с концентрациями 10 мкг/мл, 1 мк/мл 100 нг/мл, 1 нг/мл, 100 пг/мл и по 10 мкл растворов контрольной, немодифицированной ДНК (из тимуса теленка) в тех же концентрациях.1659487 лает его экономичнее при сохранении высокой специфичности и чувствительности,Формула изобретения5 Составитель Т. ЗабойкинаРедактор М. Петрова Техред М.Моргентал Корректор Т.Колб Заказ 1821 Тираж 372 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб.; 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Фильтр с ДНК высушивают на воздухе в течение 30 мин, Обработку фильтра коньюгатом пероксидаэы с анти-С-ДНК иммуноглобулинами и окрашивание образующихся комплексов проводят по примеру 1.Конъюгат пероксидазы с анти-С-ДНК иммуноглобулинами действительно выявляет не менее 100 пг С-ДНК и не реагирует с немодифицированной ДНК,Таким образом, данное техническое решение значительно упрощает способ, так как универсальные антитела к применяемому гаптену могут быть получены заранее и, таким образом, отпадает необходимость каждый раз получать их к различным комплексам нуклеиновая кислота-гаптен. Кроме того, использование для гибридизации конъюгата антител к гаптену с иммуноферментной меткой исключает использование анти-антител и позволяет применять антитела любого происхождения. Обработка продукта конъюгатом значительно упрощает способ, сокращает время на его осуществление, снижает трудоемкость способа. деСпособ обнаружения гомологичныхнуклеотидных последовательностей, включающий проведение гаптенизации последовательности ДНК и получение антител 10 против гаптенизированной последовательности ДНК, конъюгата с иммуноферментной меткой, проведение ДН К-ДН К гибридизации с гептенизированным ДНК-зондом, регистрацию гомологичных 15 последовательностей с помощью,иммуноферментной реакции, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, проводят иммунизацию животных гаптениэированной произвольной последо вательностью ДНК, антитела против гаптенизированной последовательности ДНК конъюгируют непосредственно с иммуноферментной меткой, а иммуноферментную реакцию осуществляют непосредственно 25 этим конъюгатом,