Способ получения полипептидов или их солей

ОП ИСАЙ ИЕИЗОЬЕЕТЕНИЯК ПА 1 ЕИУУь02,82 ата опубликования описания Иностранцыта (Индия), БаррингБрайан Гайлзликобритания)(72) Авторы изобретени варуп Ду и Иайк на н Джон аниая фирма л Индастриз Лимитед ликобритания) Инос иал Кеми71) Заявите ОВ ИЛИ ИХ СОЛЕЙ 54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИП ый относится к способу полипептидов - соеющих биологической торые могут найти пр зобрет получения новых динений, облэда активностью, ко менение в медиц ние но син не,ается тидов форхимии для конденсарагментов и аминоки В пептиднции пептидны Зег-Тцг-А - В - Аг - Рго уг(Ме); О,-Ье О-РЬе; А - О-Туг, ОО-Бег(ВцО-А 1 а; Оец, Немец; Ягд 1 у;ИНд,А - Агд 1 у, А Сец Н 1 З - ОЯ 10 - Н 13 ег азиды с пептидами гр-Бег-Туг-Я-В-Агд -Туг-А-В-Агд-Рго-Еенно,го" Е-Г, соотили Н ветств значен ли если то Е указаны вы,В,Гм выдде ос простая связ - СН 11 Н- олей,ющийся в том, ч левого ние п Е или их здключд пептидн вания или соли,ты продукта осущестроматографии в тонкт Кнтроль чист с помощью о .конденсир е фрагмент Гопударствапай коиите СССР по пелаи иэабретеник и открыткалот широко используют ази бодиимидный методы 1 1.Цель изобретения - пол вых полипептидов, обладаю ными биологическими свойсПоставленная цель дост способом получения полипе мулы910116 20 1 1 1 1 1 1 1 1 со о сЧ Мв л о о о М сЧ е л л л о о о 1 О ссъ сЧ сЧ Мл о о о 1 1 1 м о о ло л л о22 910116 21 Таблица 2 Пример рН 2,1 0,94 0,96 О-Бег ец 0,25 0,84 0,87 10 О-РЬе Ме ец 0,35 Т 9 г ТгР Зег Нс 5 Формула изобретения Способ получения полипептидов формулыгде если А - О-Туг; О-Туг(Ме);О-Бег;О-Бег(Вц ); О-РЬ Г;О-А 1 а; О-Тгр,то В -1.-1 ец; 1. -МеЬец;Е -Аг 01 у;Р -МН 2,или если А - Аг 61 у; АгА 1 а;то В - -ец;простая связь;Е - С 2 Н -МН,или их солей,Бумажный электрофорезпо отношению к лулиберину Р о т л и ч а ю щ и й с я тем, что конденсируют пептидные фрагментыС ц-Н 1 з-ОН, или 10 1 ц-Н 1 з-Тгр-Бег-ОН или их азиды с пептидамиН-Тгр-Бег-Тчг-А-В-Агд-Рго-Е-Г, или Н-Туг-А-В-Аго-Рго-Е-Г соответственнозначения А,В,Г и Е указаны выше, с последующим выделением целевого продукта в виде основания или соли. Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Шредер Э. и Любке К. ПептидыМ., "Мир" 1967, ч.1, с.116.Решетн лиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проект каз 916/78 Тираж 448 ВНИИПИ Государственного ком по делам изобретений и о 113035, Москва, Ж, РаушсВеи агу Рфф Лгуну Оодписнета СССРрытийя наб., д. 4/3 901 ком слое (ТСХ) силикагеля (марки кизельгель) .Для проявления хроматограмм используют системы растворителей при следующих обьемных соотношениях:5 бутан-ол ; уксусная кислота :вода 4:1:5 (И, А); бутан-ол :уксусная кислота ; вода ; пиридин 15:3:12:10 (ВГ, В); бутан-ол:3 вес/об.З водная гидроокись аммония 3:1 (ВГ,С); 1 о ацетонитрил:вода 3:1 (ВГ, О); ацетон: хлороформ 1:1 (ЙГ, Е); хлороформ:этанол 1:4 (КГ, Г); циклогексан:этилаце" тат 1; (КГ, С); циклогексан:этилацетат:метанол 1:1:1 (ВГ,Н); хлороФорм;метанол:вода 11:8:2 (ВГ,К);хлороформ:метанол 19;1 (ВГ, Р) ихлороформ:метанол 9:1 (ВГ,Я), Во всех случаях пластинки просматривают в ультрафиолетовом свете и обрабатывают такими реагентами как Флуореска 1 мин, нингидрин и хлор-крахмал-иод.Для получения аминокислотного состава получают кислотные гидролизаты путем нагревания пептидов или защищенных пептидов с 6 н, соляной кислотой, содержащей 1 вес/об. 3 Фенола в откачанной и запаянной ампуле в теочение 16 ч при 100 С. Аминокислотный состав каждого гидролизата определяют с помощью аминокислотного анализатора ЭоСасе. Термин "осуществлялось обычным способом", использован" ный в описании примеров, означает, что после проведения реакции весь35 твердый остаток отфильтровывают, филь трат упаривают досуха при температуре ниже 40 фС, остаток в этилацетате промывают 20-ным раствором лимонной кислотой, водой, насыщенным4 О раствором бикарбоната натрия и водой, сушат над безводным сульфатом натрия, затем в вакууме упаривают этилацетат, в результате чего получают ко. нечный пооачкт. При описании процессов использованы следующие сокращения;ОСр - 2,4,5-трихлорфениловый сломный эфир;Вг - бензил;5 О7 - бензилоксикарбонил;Всс- трет,-бутоксикарбонил;ОИР - диметилформамид.П р и м е р ы 1 т 8. Синтез -пироглутамилгистидилтриптофил.--серил. -тирозил-А.-лейцил"-аргинилпролил-Е"Е. Общий способ щ (табл,1, примеры 1 3). 16 4К,охлажденной (0 С) суспензии - -пироглутамил.- гистидингидразида(0,2 ммоль) в 0,9 мл диметилформамида и 0,7 мл диметилсульфоксида добавляют при перемешивании 5,7 н.раствор хлористого водорода в диоксане(0,8 ммоль). Через 5 мин интенсивного перемешивания получают про;рачный раствор. Раствор охлаждают доо-20 С, добавляют 0,22 ммоль, трет,- бутилнитрита и продолжают перемешивать 25 мин. Затем температуру пониожают до -30 С, и раствор нейтрализуют добавлением 0,8 ммоль триэтиламина. После введения предварительно охлажденной смеси (-20 С ) -триптофил.-серилтирозил-А.-лейцил- -1 -аргинил-.-пролил-Е-Г-дигидрохлорида (0,1 ммоль), полученного гидрогенолизом й-бензилоксикарбонилпроизводного в 80 об.Ф-ном водном растворе метанола, содержащем 2 эквивалента хлористого водорода, над 5 вес.Ф палладием на угле в течение 16 читриэтиламина (0,1 ммоль) в 1 мл диметилформамида, реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч при 4 С. Диметилформамид отгоняют в вакууме, аостаток хроматографируют на Сефадексе 1 Н, используя в качестве элюента диметилформамид, Полученный хлор. гидрат пептида чистят с помощью раз делительной хроматографии на Сефадексе -25, используя в качестве растворителя систему н-бутанол:уксусная кислота : вода:пиридин 5:1:5:1.тСинтез 1-пироглутамилгистидил- -1.-триптофил-.-серил-.-тирозил-А-В- -1.-аргинилпролил-азаглицин-амидаОбщий способ У(табл. 1-, примеры 4-8).1.-пироглутамил.-гистидил.-триптофил.-серин-гидразин (0,2 ммоль) растворяют в 4 мл диметилформамида и превращают в азид в сбответствии со способом в, Его конденсируют по способу щ с хлоргидратом 1.-тиролизил- -А-Варгинилпролилазаглицин-амида (0,15 ммоль), полученному каталитическим восстановлением 1.-бензилокси карбонил-бензилтирозил-А.-лейсбцил-(Й -нитро)-.-аргинилпролил-азаглицин-амида в 80 об.3-ном водном метаноле в течение 20 часов над 5 вес. палладием на угле, конечный продукт в виде хлоргидрата чистят как описывалось выше.Характеристики сбединений, полученных по предлагаемому способу сог4 о 13 910один эквивалент хлористого водорода, в течение 5 ч.Х.11. (А=О-РЬе), К насыщенному раствору 4,98 г (8,36 ммоль) М-бензилокси-карбонил-бензил.-тирозин -2,4,5-трихлорфенильного сложного эфира и 2,5 г ( 7,6 ммоль) хлоргидрата О-фенилаланил.-лейцинметилового сложного эфира в диметилформамиде добавляют 1,1 мл ( 7,6 ммоль)триэтилами о на и перемешивание продолжают в течение ночи при комнатной температуре. Хлоргидрат триэтиламина отфильтровывают, и Фильтрат упаривают досуха. После перекристаллизации остатка из водного метанола получают производное трипептида с выходом 3,6 г, (69,7 й); т,пл, 183-184 С; Ру,. О 0,82; Р, Е 0,69; РН 0,78; Ру, Р 0,71; Р , 0 0,82. 20Х 1;1. (А=О-РЬе). Раствор 3,42 г (5,04 ммоль) описанного в стадии Х 1.1 сложного иетилового эфира и гидрата гидразина (60 ммоль) в 30 мл диметилформамида перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч концентрируют до небольшого объема, гидразид осаждают добавлением 500 мл воды, Отфильтровывают, промывают водой, смесью метанол:простой эфир 1;4 и простым эфиром и сушат. Выход 2,94 г (85,93); т.пл. 179- 180 С; Р, А 0,81; Р, В 079; Рр С 0,88; Ру, О 0,69; Р, Е 0,49; Рр Г 0,65; Р , Н 0,67; Р, Р 0,25; Р, О 0,57.З 5 Х 1 Ч и ХЧ, (Я=О-РЬе), 1,83 мл (11 ммоль) раствора 6,02 М хлористого водорода в диоксане добавляют к раствору 1,86 г (2,75 ммоль) Н-бензилоксикарбонил-О-бензил.-тирозил- -О-фенипаланил-(.-лейцин гидразида во5 мл при -20 С в полученную смесь вводят 0,33 мл (2,89 ммоль) трет.-бу. тилнитрита. Спустя 2 мин добавляют-.1,89 мл (13,5 ммоль) предварительно охлажденного раствора ( -20 С) три" этиламина и 1,02 г (2,5 ммоль) хлоргидрата Й -нитро-Ь-аргнинил-Ь-пролилазаглицин-амида в 10 мл диметилформамида, реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4 С, Полу"о чают гексапептидное производное, которое чистят колоночной хроматограФией на силикагеле (20 г), исггользуя в качестве элюирующих растворителей 5 об.Г-ный метанол в хлороформе, 10 об. метанол в хлороформе и смесь хлороформ:метанол;вода 11:8:2, вы 16 4ход продукта 0,74 г ( 29,3 ); т,нл, 17 139 С; Ру, А 0,68; Р , В 0,72; В, с 0,5 В; Р, о и,й; кг, н О,зч; Р ф К Оэ 95,ХН 1, ХЕ.911 и Х 9111. 1.-пироглютамил-(.-гистидин-гидразид (10 ммол) превращают в азид по способу, описан ,ному в общем способе, и соединяют со сложным метиловым эфиром (.-триптофил-серина (1 ммоль), полученным гидрированием 11-бензилоксикарбонильного производного над 5 вес.1. палладием на угле в диметилформамиде при -10 С в течение 30 мин и при 4 С в течение 24 ц. Хлоргидрат триэтиламина отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха. Сырой пептид чистят колоночной хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюирующего растворителя 1 О об."л-ный метанол в хлороформе, 20 об-ный метанол в хлороформе и смесь хлороформ:метанол; вода 11:8:2, Выход продукта 70/; т,пл. 142- 145 С (с разложением); Ру, Я 0)39; Р, В 0,72; Р, С 0,45; Р , О 0 48; Р , К О 61. ХЬ 1 Х, Раствор сложного метилового эфира -пироглютамил- Ь.гистидил- -триптофил-Ь-серина ( 5,4 ммоль ) в 70 мл диметилформамида обрабатывают гидразин гидратом ( 100 ммоль) в течение 4 ц. Диметилформамид отгоняют в вакууме, остаток растирают с этанолом, отделяют, промывают этанолом и эфиром, сушат. Выход 88,22 т.пл.184- 189 С; Ру, А 0,18; Рр, В 0,55; Р,(Я=О-Тгр), 4,87 г (23,6 ммоль) дициклогексилкарбодиимида добавляют к раствору 7,27 г (21,5 ммоль) М-бензилоксикарбонил- О-триптофана, 3, 12 г ( 21,5 ммоль) сложного метилового эфи" ра лейцина и 5,8 г ( 43 ммоль) 1-гидроксибензотриазола в 50 мл диметилформамида при 0 С. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и обрабатывают обычным способом. После перекристаллизации из смеси этилацетат:петролейный эфир ( т,кип, 60-80 С ) получают дипептидное производное( 9,55 г), в котором с помощью хроматографии в тонком слое обнаруживают следы примесейПродукт чистят колоночной хроматографией на силикагеле ( 300 г), используя в качестве элюирующего растворителя хлороформ и 5 об.4-ный метанол в хлороформе. Выход продукта(А=О-Тгр),Каталитическое восстановление в 80 об.й водном диметилформамиде над 5 вес.4 палладием наугле в течение 5 ч.( 20 ммоль) сложного эфира И-бензилоксикарбонил-бензил-.-тирозин,4,5 трихлорфенила, 6,28 г,1 19 ммоль)сложного эфира О-триптофиллейцинав 100 мл диметилформамида перемешиваютпри комнатной температуре в течение 1560 ч, Реакционную смесь обрабатываютобычным способом и остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат:петролейный эфир ( т,кип. 60-80 С ) получают трипептидное производное с выходом 8,52 г (62,5) т.пл. 165-166 С;й, А 0,78; В, В 0,73; В, С 0,84;Ву, О 0,80; Я, Е 0,62; Ву, Г 0,70;В, Н 0,76; й, Р 0,58; В, ( 0,68.,1, (А=О-Тгр).7,26 г (10,1 ммоль)раствора сложного метилового эфирай-бензилоксикарбонил-бензил-.-тирозил-О-триптофил-.-лейцина в смеси200 мл метанола и 50 мл диметилформамида обрабатывают гидразин гидратом 30(2,5 ммоль) хлоргидрата М -нитро".-аргинил-.-пропил-азаглицин-амида и1,89 г (13,5 ммоль),триэтиламина в10 мл диметилформамида и полученную 53реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4 С, Ее обрабатываютобычным сособом, полученный остаток.( 1,27 г ) помещают в колонку с силикагелем ( 230 г ) и продукт элюируют хлороформом и 5 об,-ный Метанолом з хлороформе, Выход 0,91 г (34,43); т. пл. 139- 140 С с разложением); Я, А 0,67; В, В 0,72 й, С 0 58; В р, О 0 62; Ву, Н 0 34; В , К 0 95.Ч. (А=О:Туг(Ме.К охлажденному до 0 С раствору 3,17 г (9,64 ммоль, 2-О-Туг(Ме)-ОН, 1,92 г (10,6 ммоль) ец-ОМе, НС 1, 2,6 г, (19,2 ммоль)1- -гидроксибензотриазола и 1,6.мл (11 ммоль) триэтиламина в 30 мл диметилформамида добавляют 2,29 г(11,1 ммоль) Й , М-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4 С и обо рабатывают обычным способом, После перекристаллизации из горячего циклогексана получают защищенное дипептидное производное. Выход 1,41 г (95,2 ж); Я, О 0,83; й , Е 0,69; Вр Р 0,72 Вр О 0,76..Ч. (А=О:уг(Ие.Каталитическое восстановление над 5 вес.3 палладием на угле в смеси метанол:диметилформамид: вода 8:1;1, содержащей 1,2 эквивалента хлористого водорода, в течение 3 цасов.ЕЧ. (А=О:Туг(Ме. Раствор2:Туг-(Вг)-ОСр (8,2 ммоль),О-Туг(Ме) -.ец-ОМе, НС 1 (8,2 ммоль) и триэтиламина (8,2 ммоль) в 60 мл диметилформамида перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, реакционную смесь затем обрабатывают обычным способом, Продукт отфильтровывают, промывают эфиром и сушат, Выход 81,21; т.пл. 191-192 С; йу, О 0,85; В, 0,73; Яр Г 0)72; В а О,8.Х.(А=О-Туг(Ме. Гидразин гидрат (12,9 ммоль) добавляют к раствору 4,59 г (6,4 ммоль) 2-Туг(В 21)-О-Туг(Ме)-.ец-Ме в 25 мл диметилформамида и 50 мл метанола и реакционную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. Метанол отгоняют в вакууме, продукт осаждают водой, собирают, промывают водой и. сушат, получают продукт с т.пл. 212-213 С; йр Е 0,49; йр Г 0,66; й, Н 0,69; йу а 070 Г.Х и Х. (А=О"Туг(Ме.3,54 г (5,0 ммоль) гидразида, полученного на стадии .Х, растворяют в 10 мл диметилформамиде и охлаждают при перемешивании до -.20 С, добавляют к9101 зо 4 О Перекристаллизация из смеси метанол;простой эфир, выход 23,8,; т.пл, 152- 154 С; К, А 0,67; К,В 0,68; й, С 0,58; Ку,о 0,59 ф й н о,5 о; кк о,94; й,а 0,35. 17нему 3,38 мл (20 ммоль) 5,92 М НС 1в диоксане, затем 0,6 мл ( 5,25 ммоль)трет.-бутилнитрита. Спустя 2 мин вводят предварительно охлажденный раствор 2,04 г (5 ммог 1 ь)Н-Агу(й О 2)-Рго-Аг 61 уНьНС и 3,55 мл (25 ммоль )триэтиламина в 10 мл диметилформамидаперемешивание продолжают при 4 С втечение ночи. Реакционную смесь обрабатывают обычным способом, а получен- Оный сырой продукт чистят на хроматографической колонке с силикагелем,используя в качестве элюирующего растворителя хлороформ, 5 об.Ф-ную смесьметанола в хлороформе и 1 О об.З-ныйметанол в хлороформе. Выход 3,2 г(70,91); йу, А 0,64; йр В 0,72;к, с 0,55; й , О о,бб; К,Р о,4 о;К, Н 052.1 Х 1, (А=О-Бег(Вц ,), Аналогиц Ъна стадии .Ч 1. Полученный продуктперекристаллизовывают из водногометанола, Выход 90,4/; т.пл, 107108 С; К , О 0,80; й , Е 0,68;Ву, Г 0,53; Р, Н 0,2; Йу, Р 0,72; 2, а 0,74.1 Х 111.(А=О-Бег(Вц .Каталитическое восстановление над 5 вес.Ф палладием на угле в смеси диметилформамид:метанол 8:2 в ечение 5 ч,Х 1 Ч.(А=О-Бег(Вц . Раствор19,17 г (32,7 ммоль) 2-Туг (Вг 1)-ОСри Нег(Вц+)-1 ец-ОМе (32,7 ммоль)в 100 мл диметилфопмамида оставляютпри комнатной температуре на 72 ч. з 5В результате обычной обработки раствора получают твердое вещество, ко"торое промывают эфиром и сушат. Выход17,6 г (79,4 Ф); т.пл. 135- 137 С,кХ О о 80 к. Р 0 77 Ч а 0 81.ХЧ, (А=О-Бег(Вц+. Аналогичнастадии 1.1 Х. Перекристаллизация изводного метанола. Выход 56,24,т.пл, 134-136 С; К, О 0,66; К,н 0,64; к, а о,б 4, 45ХЧ( и .ХЧ 11,(А=О-Ьег(Вц+. Аналогичны стадии 1.Ч и 1.Х 1. Полученныйпродукт чистят хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюирующего растворителя хло" у 16 18форм и 5 об.г-ный метанол в хлороформе.Выход 38,51; т,пл. 142-145 С; й,А 0,64; й , В 0,71; йС 0,55К , 0 0,65; й , Г 0,46; й , Н 0,43й , а 0,16.ХЧ 11.(А=О-Туг(Ме5,13 г(24,9 ммоль) Н-Ме-.ец-ОМе, НВг,3,5 мл (24,9 ммоль)триэтиламина и6,12 г (45,2 ммоль) 1-гидроксибензотриазола в 50 мл диметилформамидаи перемешивание продолжают в течеОние ночи при 4 С. Реакционную смесьобрабатывают обычным способом и полученный продукт цистят колоночной хроматографией на силикагеле, используя для элюирования хлороформ. Выход55,2 Ф, масло; Кр, О 0,83; Ку, Е 0,78;кр н 0,9; ку,"Р 0,80; к, а 0,79Х 1 Х.(А=О-Туг (Ме, Каталитицеское восстановление над 5 вес,Ф палладием на угле в смеси метанол:вода8:2; содержащей эквивалент хлористого водорода в течение 6 ч.1 ХХ.(А=О-Туг(Ме, Аналогична стадииЧ 11. Продукт чистят колоночнойхроматографией на силикагеле, используя для элюирования эфир,1 ХХ 1.(А=О-Туг(Ме. Раствор 4,85 г(6,69 ммоль) 2-Туг(Вг 1)-О-Туг(Ме)Ме 1.ец-ОМе и гидразин гидрат,120,7 ммоль) в 150 мл метанола выдерживают ночь при комнатной темпе- .ратуре. Гидразид осаждают, добавляяводу, отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси метанол;вода. Выход 91,13; т.пл. 129-131 С; й.р,О 0,79; Ку, Е 0,60; й, Г 0,68;к, н 0,73; й, а о,7.ЬХХ 1 и 1.ХХ 111. Аналогичны стадиям1 Х и 1 Х 1.