Способ получения продукта присоединения дипептидного производного и аминокислоты

ОП ИСАНИЕИЗОБРЕТЕ Н ИяК ЙАТЕМУ Союз СоветсваСоцмалмстмчвснмдРеслублни(32) 27, 01, 77 5 Ьеударатеаеый кемитвт ФССР ае делам язеврвтвкяв и открытка(5 З) УДК 547 964.4.07(088.8),Опубликовано 28.02.82.Бюллетень а 8 Дата опубликования описания 23.04.82 ИностранцыЕсиказу Изова, Мунеки Охмори, КаоЮдзи Нонака, Кейити Кихара, Кийотаи Сигеаки Нисимура(72) Автори изобретения ва, ато Иностранная бирма МануФакчури н г,КО., ЛТ Р н) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ ПРИСОЕДИНЕНИЯДИПЕПТИДНОГО ПРОИЗВОДНОГО И АМИНОКИСЛОТЫ,и ,н Изобретение относится к способу получения новых продуктов присоединения дипептидного производного и аминокислоты, соединений, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в биохимии и медицине.Известно применение протеаз (таких как папаин, химотрипсин) для образования пептидных связеиТаким способом были осуществлены белковые синтезы из моноаминокарбоновых кислот, таких как лейцин, имеющих М-концевую защитную бензоильную группу, и лейцин глицин, обе из которых имеют С-концевую защитную группу 1 .При этом продукты реакции осажда-, лись в водной среде и как водонерастд и(Зйдандодйзин)Сагйии Й ика1, "( юмц воримые при потере водорастворимыхгрупп (что необходимо для сдвига обратимой реакции в сторону, образованиябелка). В случае, когда водораствори" а. мая группа сохраняется в реакционномпродукте, например, как в случае использования в качестве исходного соединения дикарбоновых аминокислот,неоЬходимо водорастворимую группу ис" 1 в ходного соединения закрыть менее гид"родильной защитной группой.Цель изобретения - новый способполучения новых Ьиологически активныхсоединений.р Поставленная цель достигается тем,,что в способе получения продуктоврисоединения дипептидного производого и аминокислоты общей формулы(1,65 ммоль) продукта присоединенияметилового эфира Ы-бензилоксикарбо"нил-Ьсаспартил-Ь-Фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина, полуценного в примере .19, загружают в30 мл колбу, добавляют 2 мл воды и2,0 мл 1 н.НС 1, смесь перемешивают 1 опри 60 С в течение 3 мин, затем обрабатывают способом, описанным аналогичным в примеру 19, получают0,35 г кристаллов метилового эфираИ-оензилоксикарбонил"Ь-аспартил"Ь-15-Фенилаланин, Чистота 1004; выход100 Р;.П р и и е р 26. 0,594 г (2 ммоль)М-Р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 0,860 г (4 ммоль),2 охлоргидрата метилового эфира Ь-фенилаланина растворяют в 1 н.йаОН,значение рН доводят до 6,0. Получен"ный раствор смешивают с 50 мг термолизина, встряхивают в течение ночи 2538-40 ОС. Осадок отфильтровывают,промывают 10 мл воды, сушат, полу"чают 0,928 г кристаллов, имеющих 687 оСРезультаты подтверждают получение зОпродукта присоединения метиловогоэфира И-Р-метоксибензялоксикарбонил""Ь-аспартил-Ь-Фенилаланина и метилового эфира Ь- Фенилаланина (1: 1).После перекристаллизации продуктаиз смеси этилацетата и н-гексана.Т,пл. 72-76 С, 3 1 = + 6,5 (С = 1,метанол).Найдено, 1.: С 61,85; Нб,04; М 6,46СН,ОРассчитано, Ф; С 62,15; Н 6,16;й 6,59Инфракрасный спектр: 3280 см(С".Н деформационное колебание);1380 см " (карбоксилат); 1210 до1240 см- (колебание растяжения связиС-О-С и 3-е амидное поглощение);1030 см(колебание Фенила в плоскости). и 690, 740 и 810 см колебаниеФенила вне плоскости).Спектр ЯМР, 8: (1) 2,7 ррщ (2 Н);(14 Н).Полученные результаты показывают,что продукт является продуктом присоединения формулы 1, где Й, К, Йь,и и означают и-метоксибензилоксикар"бонил, бензил, метокси и 1 соответственно.Смесь 0,500 г (0,78 ммоль) продукта присоединения метилового эфира И-Р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспар-тил-Ь-Фенилаланина и метилового эфираЬ-фенилаланина, полученного таким образом, с 2 мл воды и 0,94 мл ."(0,94 ммоль) 1 н.НС 2 перемешивают при60 С в течение 3 мин, Полученную суспензию отфильтровывают и промывают6 мл воды, сушат, получают 0,32 г кристаллов.Нижеследующие результаты подверждают, что продукт является сложнымэфиром Ы-Р-метокси-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина. Чистота 1001, выход 89,11,Кристаллы растворяют в этилацетатеи продукт осаждают н-гексаном получают соединение с т. пл. 128-130 С,ЯО = - 15,1 (С = 1 метанол)Найдено, 4: С 60,30; Н 5,74; Х 599СьНа 61 ЮвРассчитано, Ф: С 60,25; Н 5,721М 6,11.Инфракрасный спектр: 3280 см(9 Н).Эти результаты показывают, чтоконечным продуктом является соединение формулы 1 Ч, в котором Й 1, К, йи и означает и-метоксибензилоксикарбонил, бензил, метокси й 1 соответственно.21 91010,2 весовых частей полученного ме- тилового эфира И-Р-метоксибензилокси-карбонил,-аспаргил.-фенилаланина растворяют в 2 вес.ч. ацетона и к полученному раствору добавляют5 1 вес.ч. 4 н.НС 0, смесь нагревают на водяной бане со слабым противотоком в течение 1,5 ч, до полного разложения для образования раствора, содержащего в качестве. основных компонен О тов метиловый сложный эфир Ь-аспартил- -Ь-фенилаланина, метиловый эфир Ь-фенилаланина и анисовый спирт, причем из указанного раствора получают метиловый эфир 1.-аспартил,-фенилаланина 15П р и м е р 27. 0,562 г (2 ммоль) И-бензилоксикарбонил-Ь-глутаминовой кислоты и 0,860 г (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира 1,-фенилаланина растворяют в 1 н,Ич 011, и.рН доводят до 6,0.Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина и смесь встряхивают при 38-40 фС в течение ночи. ОсаДок Отфильтровывают промывают 10 мл 25 воды, сушат, получают 0,510 г кристаллов, т. пл. 80-.85 С.Следующие результаты подтверждают, что получили продукт присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-глутамил,-фенилаланина и ме" тилового эфира Ь-фенилаланина (1:1). Продукт перекристаллизовывают из смеси этилацетата и н-гексана т, пл.92-97 С. ГАД 0 = О,1 (С = 1, метанол)Найдено, /: С 63,61; Н 6,31; Х 6,65СМ 1159 "1.Ф 9Рассчитано,: С 63,75; Н 6,32; И 6,76.Инфракрасный спектр: 3340 см (колебание растяжения связи И-Щ;2950 и 3030 см(колебание растяжения связи С-Н); 1730 и 1745 см" (С = О сложный эфир); 1690 см (С = О уретан); 1660 см (1-ое амидное погло 45 щение); 1620 см (карбоксилат);1530 см "(2-ое амидное поглощение);1440 см " (С-Н деформационное колебание); 1405 см " (карбоксилат); 1240 до 1310 ам (С-О-С колебание растяже 50 ние и 3-е амидное поглощение);1050 см (колебание Фенила в плоскости); 700 и 750 см (колебание Фенила вне плоскости).Спектр ЯМР, 8 : (1) 2,0 ррв 2 Н); (2) 2,3 ррв (гн); (3) 3,0 ррв (4 Н); (4) 3,6 ррв (ЗН) и 3,7 ррв ЗН); (5) 3,8 ррв (1 н); (6) 4,3 ррв (1 Н); (7) 48 ррв (1 Н)(8) 5,0 Ррв 2 Н (9) 17 228 ррв (ЗН)(10) 5,8 ртяп (1 Н); (11) 7,2 ррв (1 Н); (12) 7,2 ррв (10 Н); (1,3) ,3 ррв (5 Н) .Эти результаты показывают, что продукт является присоединением формулы 1, где Й, Й, Й и и означают бензилоксикарбонил, бензил, метокси и 2 соответственно.0,100 г продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил- -Ь-глутамил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-Фенилаланина добавляют при перемешивании 2,3 мл (0,32 ммоль) 0,14 и НСГ, и смесь затем перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин. Полученный белый осадок отфильтровывают и промывают 3 мл воды, сушат, получают 0,0683 г кристаллов.Следующие результаты подверждают, что продукт представляет метиловый эфир И-бензилоксикарбонил"Ь-глутамил- -Ь-фенилаланинаЧистота 100; выход 95,8.1(ристаллы растворяют в этилацетате, и продукт осажГают н-гексаном, т. пл. 97-99 С, 1 АЛ = - 11,0 (С = метанол)Найдено, л: С 62,63; Н 5,94; И 6,24С 11 гв ИаОРассчитано, 4: С 62,43; Н 5,92; И 6,33.ИнФракрасный спектр: 3300 см (колебание растяжения И-Н); 2930 и 3030 см, (колебание растяжения С-Н);1735 см (С = О сложный эфир);1690 см (С = О уретан); 1650 см (1-ое амидное поглощение); 1530 см (2-ое амидное поглощение); 1440 см (колебание деформации С-Н); 1220 до 1280 см(колебание растяжения С-О-С и 3-е амидное поглощение); 1050 см , (колебание фенила в плоскости) и 695 и 35 см(колебание фенила вне плоскости).Спектр ЯМР, ц : (1) 2,0 ррв (2 Н); (2) 2,4 ррв (гн); (3) ЗД реп (2 Н); (4) 3 7 ррв (ЗН); (5) 4,3 ррв (1 Н); (6) 4,8 ррп (1 н);5,1 ррв (гн); (8) 5,9 ррп (1 Н); (9) 7,2 ррв (1 Н); (10) 7,2 ррв (5 Н)р (11) 7,3 ррв (5 Н); (1 г) 8,1 ррв (1 н).Эти результаты показывают; что конечный продукт представляет собой соединение Формулы Щ где К, Йа, Кь и и означает бензилоксикарбонил, бен-зил, метокси и 2 соответственно,Полученный метиловый эфир И-бензи" локсикарбонил-Ь-глутамил.-фенилала23 9101 нина посредством восстановления водо" родом превращают в метиловый эфир Ь- -глутамил-Ь-Фенилаланина, и гидролизом его превращают в И-бензилокси" карбонил-Ь-глутамил"Ь-фенилаланин,П р и м е р 28. К раствору 0,686 г (3, 12 ммоль) хлоргмдрата метилового эфира Ь-фенилаланина в 25 мп воды при охлаждении льдом добавляет 2 н,ИаОН водного раствора при переме 30 шивании, при этом доводят рН до 7,5, затем не прекращая перемешивания, постепенно добавляют 0,360 г," (1,44 ммоль) ангидрида И-бензилоксисарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты, рН 15 поддерживают в пределах 7,0-7,5 посредством добавления 2 н.водного раствора ИаОН. Смесь перемешивают в течение 2 ч, к реакционной смеси добавляют 1 н,НИ водный раствор, .чтобы 2 в довести рН до 6. Полученный осадок отфильтровывают, промывают 50 мп воды, сушат, получают 0,416 г продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарЬонил-Ь-аспартил-фенилала" 25 нина (смесь 86/ метилового эфира И- -бензилоксикарбонил"Ь-аспартил-(С 3-)- -Ь-фенилаланина и 144 метилового эфира И-ЬензилоксикарЬонил-Ь-аспартил- -(СЭ)-Ь-фенилаланина) и метилового зв эфира Ь-фенилаланин (1:1) (т. пл.10 оС), В реакционной смеси обра" зуется значительное количество ме" тилового эфира Ы-Ьензилоксикарбонил" . -Ь-аспартил-(Сф-Ь-фенилаланина, но большая часть соединения остается в Фильтрате и в промывочной воде.Полученный продукт присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбо", нил.-аспартил- (С и СЬ) -1.-фенилаланина и метилового эфира Ь-Фенил" аланина добавляют к 1,7 мп (07 моль) 0,4 н.НСО при перемешивании, смесь продолжают перемешивать при комнатной температуре в течение 15 мин. По45 лученный белый осадок отфильтровыва" ют, промывают 3 мл воды, сушат, по" лучают О, 136 г (выход 96,33) кристаллов метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина (содержащий 173 И-бензилоксикарбонил.- -аспартил-(С 1)-Ь-фенилаланина (т.пл, 110-118 С).Пример 29. В 30 мл колбе 0,543 г (2 ммоль) И-бензилоксикарбонил"Ь-аспарагиновой кислоты и 0,918 г55 (4 ммоль) хлоргидрата этилового эфи" ра 1.-фенилаланина растворяют в 5 мл воды, к раствору добавляют 4 н.ИаОН,17 24значение рН доводят до б. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, и смесь встряхивают в течение ночи при 38-40 С. Осадок отфильтровывают, промывают 30 мл воды, сущат, получают 0,913 г кристаллов, т. пл. 85-90 фС.Продукт тождественен с продуктом присоединения этилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил.-фенилаланина и этилового эфира 1.-фенилаланина (1:1).После перекристаллизации из смеси этилацетата и н-гексана приучают продукт с т. пл. 93-95 фС,С 4.3 О = + 6,0 (С 1, метанол).Найдено, Ж: С 64,50;,Н 6,56; И 6,63С 5 Н,И 5 ОРассчитано, 4: С 64,23; Н 6,50; И 6,61Инфракрасный спектр: 3300 см(колебание растяжения связи И-Н); 2900 до 3050 см " (колебание растяжения С-Н); 1710 и 1740 см (С = О сложный эфир и С = О уретан); 1640 см (1-ое амидное поглощение); 1585 см- (карбоксилат); 1520 см-(2"е амидное поглощение); 1440 см(деформационное колебание С-Н); 1380 см (карбоксилат);1200, 1270:см(колебание растяжения С-О-С и 3-е амидное поглощение);1055 см ф(колебание Фенила в плоскости); 700, 730 и 750 см (колебание фенила вне плоскости).Спектр ЯМР, 8 ; (1) 1,1 ррп (6 Н); (2) 2,7 ррщ (2 Н); (3) 3,0 рри (4 Н); (4) 4,0 рра (4 Н); (5) 4,1 реп (1 Н); (6) 4 5 ррп (1 Н); (7) 4,7 ррп (1 Н); (8) 5,0 ррй (2 Н); (9) 6,2 ррщ (1 Н);. (10) 6,7 ррп (ЗН); (11) 7,2 ррп (1 Н); (12) 7,2 ррп (10 Н); (13) 7 3 ррп (5 Н).Эти результаты показывают, что продукт является продуктом присоединения Формулы 1, где Е,1, Й 2, Й 5 и и означают бензилоксикарбонил, бензил, этокси и 1.В 30 мл колбе 0,125 г (0,197 ммоль) полученного продукта присоединения этилового эфира И-бензилоксикарбонил- -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и этилового эфира Ь-Фенилаланина смешивают 2 мл воды и 0,24 мл 1 н. НСВ(0,24 ммоль) и смесь перемешивают при комнатной температуре в течейие 30 мин. Полученную суспензию фильтруют, осадок промывают 5 мп воды, сушат, получают0,0807 г кристаллов этилового эфираИ-бензилоксикарбонил"Ь-аспартил, -С 11 ы 10Рассчитано : С 62,43; Н 5,92;И 6,33.Инфракрасный спектр: 3300 см ; от2900 до 3100 см ; 1730 см ";1690 см ; 1655 см ; 1530 см 11440 см ; 1200-1280 см ; 1030 см690 см-"; 740 см ".Спектр ЯМР, 0: 1,1 ррах; 2,8 реп;30 ррш; 4,1 ррн; 4,6 ррп; 4,8 ррв;5,1 р;,6,0 р; 7,1 ррв; 7,3 ррах;9,6 ррп 1.П р и м е р 30. 5,00 гкарбонил,-аспарагиновой кислоты и7,26 г (33,64 ммоль) хлоргидрата метилового эфира Ь-фенилаланина загру-,жают в 100 мл колбу и добавляют 1 нИаОН, рН раствора 6,0. Полученныйраствор смешивают с 2,0 г термолизина и с 0,4 г картофельцого ингибитора, смесь встряхивают при 38-40 ОС втечение 5 ч. Осадок отфильтровывают,промывают 100 мл воды, сушат, получа ют 8,11 г кристаллов, имеющих т.пл.-Фенилаланина и метилового эфира Фе- З 5 сана физические характеристики и ре" зультаты элементарного анализа, аначенного в примере 26. .0,3 г продукта присоединения метилового эфира И-Р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-Фенилаланина .и воряют 3 мл ацетона, к раствору добавляют 2 мл 2,4.н.НС, реакцию про-водят при 60 С в течение 1 ч. Реакционную смесь смешивают с водой, 1,2 н. 50 саноном, добавленным в качестве вну"треннего стандарта. Методом высоко"скоростной жидкостной хроматографии ра-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина. Вы.ход 72 73 П р и м е р 31. 0,3 продукта присоединения метилового эфира И-Р-ме 25 9101172692,64. К рист аллы перекристалли зовы- токсибензилоксика рбонил-Ь-аспартилвают из смеси этилацетата и н-геква- -Ь-фенилаланина и метилового эфирана, получают продукт с т. пл. 128- Ь-фенилаланина, полученного в приме 135 С,14.30, = - 17,3 (С = 1, мета- ре 30, разлагают и анализируют сог-,нол). 5 ласно примеру 30, но вместо ацетонаНайдено, б: С 62,82; Н 5,96; Х 6,40 используют диоксан.Выход метилового эфира 4.: -Ь-аспартил,-фенилаланина 73,04.П р и м е р 32. Аналогичен при-10 меру 31 но используют метанол вместодиоксана. Выход метилового эфира М-Ь-аспартил-Ь-Фенилаланина 63,3,П р и м е р 33. Аналогичен примеру 31, но используют вместо диокса 15 на И И - диметилформамид. Выход метилового эфира А -Ь-аспартил-Ь-Фенилаланина 28, 14.П р и м е р 34. Аналогичен примеру 31, но в качестве нейтрализующего(16,82 ммоль) И-Р-метокси-бензилокси агента используют 4 мл диоксана, 1 млдиоксанового раствора 5,3 н.НЙ итриэтиламин вместо 3 мл диоксана,2 мл 2,4 н.НС 1 и 1,2 н, водного раствора ИаНСОь, соответственно. Выходметилового эфира - -Ь-аспартил-Ь-фе-нилаланина 98,6.П р и м е р 35. Аналогичен примеру 34, но реакцию проводят при 90 фСв течение 20 мин (вместо 60 С в течение 1 ч)Выход метилового эфира 3-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина 88,53,88-92 С, Выход 75,6 в виде продукта П р и м е р 36. Аналогичен примеприсоединения метилового эфира ц-Р- ру 34, но используют 4,5 диоксана и0,5 мл диоксанового раствора 5,3 н,НС 1 вместо 4 мл и 1 мл вышеуказанныхнилаланина 1;1). После перекристал- веществ соответственно, а также провоОлизации из смеси этилацетата и н-гек" дят реакцию при 90 вместо 60 С, Выходметилового эфира 4 -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина 84,й,логичны продукту присоединения, полу П Р и м е Р 37 Аналогичен пРимеру 34, но используют 3 мл диоксана и2 мл диоксанового раствора 5,3 н.НЫвместо 4 мл и 1 мл указанных веществсоответственно, а также проводят реакометилового эфира Ь-фенилаланина раст 45,цию при 30 С в течение 120 мин вместо60 фС в течение 1 ч. Выход метиловогоэфира - -Ь-аспартил "Ь-фенилаланина98,64.П р и м е р 38. Аналогичен примеводным раствором УНСО и циклогек- ру 34, но используют 4,5 мл диоксанаи 0,5 мп 60 хлорной кислоты вместо4 мл диоксана и 1 мл диоксановогораствора 5,3 н.НИ соответственно.подверждено получение метилового эфи- Выход метилового эфира 3- -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина.55П. р, и м е р 39. Аналогичен приме"ру 34, но используют 4,85 мл диоксанаи О, 15 мл концентрированной сернойкислоты вместо 4 мл диоксана и 1 мп27 9101 диоксанового раствора 5,3 неНС. Выход метилового эфира Ф, -Ь-аспартил- -Ь-фенилаланина.П р и и е р 40. 0,3 г продукта присоединения метилового эфира И-Р- -метоксибенаилоксикарбонил"Ь-аспартил" -Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-Фенилаланина (1:1), полученного в примере 30, растворяют в 2 мл диоксана и добавляют 3 мл трифторуксусной 10 кислоты. Реакцию проводят при 60 С в течение 1 ч. Реакционную смесь упа" ривают под пониженным давлением, а затем к части этого вещества добавляют воду, триэтиламин. и циклогексанон 5 в качестве внутреннего стандарта, по" лученный образец анализируют высокоскоростной жидкостной хроматографией,. Выход метилового эфира А -Ь-аспартил- -Ь-фенилаланина 96,М 20П р и м е р 41. Смесь 1,000 г продукта присоединения метилового эфира И-Р-метоксибензилоксикарбонил- -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метило" вого эфира Ь-Фенилаланина (11), по лученного в примере 30, 14 мл диок" сана и 4 мл диоксанового раствора 5,3 н,НС 3, загружают в 650 мл колбу и,.перемешивают при 60 фС в течение 1 ч, Диоксан отгоняют из реакционной смеси при пониженном давлении, добавляют б мл воды и 29 мл диэтилового эфира к оставшемуся маслянистому продукту, перемешивают, смесь разделяют на две фазы, К водной фазе добавляют 1 0 мл диэтилового эфира, продукт экст 3 рагируют трижды таким же образом. Эфирные экстракты объединяют, дважды промывают 5 мл 54-ного водного раствора бикарбоната натрия и сушат над40 безводным сульфатом магния. Эфир отгоняют при пониженном давлении, получает 0,176 г (выход 81,2 Ж) неочищенного анисового спирта. Водную фазу нейтрализуют 74-ным водным раствором гидрата окиси до рН 6, выдерживают45 примерно при 5 С в течение ночи. Полученные кристаллы отфильтровывают и промывают 2 мл воды, сушат, получают 0,316 г (выход 68,54) неочищенного метилового эфира Ь-аспартил-Ь-фенил 50 аланина. Иаточник и водные промывки объединяют и подщелачивают 74-ным водным раствором гидрата окиси натрия до рН, продукт экстрагируют дихлорметаном (3 х 15 мл), объединенные экстракты промывают 5 мл воды, сушат над безводным сульфатом магния. Дихлорметан отгоняют при пониженном 17 28давлении, получают 0,234 г (выход83,44) неочищенного метилового эфираЬ-фенилаланина.П р ии е р 12. 1,189 гф ммоиь)И-Р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 1,837 г(8 ммоль) хлоргидрата этилового эфи"ра Ь-фенилаланина растворяют в 1 н.водном растворе ИаОН, рН 6,0. Доводятобъем реакционной смеси водой до.15 мл. Полученный раствор смешиваютс 100 мг термолизина. Смесь переме;шивают при 38"40 С в течение 7 ч,оОсадок отфильтровывают, промывают30 мл воды, сушат, получают 2,401 г(выход 90,2 Ц продукта присоединенияэтилового эФира И-Р-метоксибензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланинаи этилового эфира Ь-Фенилаланина(1; ), что подтверждено нижеприведенными результатами анализа.Продукт перекристаллизовывают изсмеси метуола и эфира. Т. пл. 8287 С. И 31) + 6,О. (С = 1, метанол)Найдено, Ж: С 63,52; Н 6,57; И 6,54с,н,И,о 1 оРассчитано, Ж С 63,14; Н 6,51;И 6,31.Спектры инфракрасного поглощенияи ЯИР дают следующие характеристические максимумы,Инфракрасный спектр: 3300 см(колебание растяжения И-Н); от 2900 до3050 см(колебание растяжения С-Н);720, 1730 и 1740 (С = О сложные эфиры и уретан); 1650 см=ф(1-ое амидноепоглощение); от 1510 до 1540 см (2-оеамидное поглощение); 1440 см " (деформационное колебание С-.Н); 1390 ем(12) 6,8-7,4 ррах (14 Н). Результаты показывают, что продуктпредставляет собойприсоединение формулыЯ, где Й, Й 2, Й и 11 означаетр-метоксибензилоксикарбонил, бензил,этокси и 1, соответственно,Повторяют процесс аналогично примеру 34, но используют полученный про31 9101 .промывают водой, высушивают, Скоростной жидкостной хроматографией показывают, что выход продукта 92,7, считая на взятую И-бензилоксикарбонил-Е-, -аспарагиновую кислоту. ЭП р и м е р 46. Процесс и анализ продукта реакции проводят аналогично примеру 45, но используют 161,8 г (0,75 моль)",хлористоводородного метипового эфира В-фенилаланина, 500 мл о раствора едкого натрия,. рН 6,7, 1,0 г термоазы и 0,88 г моногидрата ацетата кальция, вместо соответственно 107,8 г, 6,4, ОЗ г и 0,26 г при 25 фС в течение 100 ч, вместо 20 С и 2 Я ч. Вы ф ход 93,3, считая на взятую И-бензи" локсикарбонил.-аспарагиновую кислоту.П р и м е р 47, Процесс проводят в условиях примера 45, но используют 149,2 г (0,65 ммоль) метилового эфира ло 1 Х-Фенилаланина гидрохлорида, 500 мп водного раствора гидроокиси натрия, рН 6,6, 0,7 г термоазы и 0,62 г ацетата кальция моногидрата вместо 107,8 г, 300 мл, 6,4, О,З г и 0,26 г соответственно,при 13 фС в течение 195 ч вместо 20 фС и 218 ч. Выход 90,9 исходя иэ И-бензилоксикарбонила-аспартата.П р и м е р ,48, 0,534 г (2 ммоль) зо И-бензилоксикарбонил."аспартата и 0,863 г (4 ммоль) метилового эфира 1.-фенилаланина гидрохлорида помещают в 30 мл колбу и туда же добавляют 7 мл гидроокиси аммония для растворе- з ния и доведения рН раствора до 6,0. В раствор вводят 50 мг термолизина. Раствор перемешивают при 60 С в течение 2 ч до выпадения продукта.присо" единения из метилового эфира И-бензи о локсикарбонил-Е-аспартил.-фенилала " нина и метилового эфира Е-фенмлаланина. Большое количество воды добавляют в реакционную смесь, содержащую выпавшие кристаллы примесного соедине- . м ния для их растворения. Полученный в результате этого гомогенный раствор анализируют с помощью высокоскоростной жидкостной хроматографии; выход примесных. соединений 5 М.П р и м е р 49. 0,534 г (2 ммоль) И-бенэилоксикарбонил-Е-аспартата и 0,853 г (4 ммоль) метилового эфира Ш,-фенилаланина гидрохлорида помеща 17 32ют в 30 мл колЬу и туда же добавляют 5 мл воды вместе с триэтиламином для растворения и доведения рН до 5,0. В раствор вводят 50 мг термолизина. Раствор перемешивают при 33-40"С в течение 16 ч. Выпавшие кристаллы продукта присоединения, состоящего иэ метилового эфира И-бензилоксикарЬонил- "1.-аспартил.-фенилаланина и метилового эфира В-фенилаланина, отделяют фильтрацией, сушат. Получают 0,836 г кристаллов, т. пл. 96-113 фС. П р и м е р 50, 0,534 г. (2 ммоль) И-бензилоксикарбонил.-аспартата и 0,863 г (4 ммоль) метилового эФира Х-фенилаланина гидрохлорида помещают в 30 мя колбу и туда же добавляют 6 мл аммиачной воды, для растворения и доведения рН до 7,2. В раствор вводят 50 мг термолизина и перемешивают при 38-40 ФС в течение 4,5 ч, Выпавшие кристаллы продукта присоединения, состоящего из метилового эфира И-бенэилоксикарбогил.-аспартил-Е-Фенилаланина и метилового эфира И,-фенилаланина, отфильтровывают и сушат. Полу- . чают 0,630 г кристаллов. Выход 51,8 Ф.П р и м е р 51 10,7 г (40 ммоль) И-бензилоксикарбонил.-аспартата и 28,0 (130 ммоль) метилового эфира 1, - Фенилаланина гидрохлорида помещают в 200 мл колбу и туда же доЬавляют 10 мл водйого раствора гидроокиси натрия для растворенйя и доведения рН до 6,6 . В раствор вводят 32 мг термолиэина. Раствор выдерживают до выпадения кристаллов продукта присоединения, состоящего из метилового эфира И-бензилоксикарбонил,-аспартил.-фенилаланина и метилового эфира "1,-фенилаланина. Иолученные кристаллы отфильтровывают и сушат. Высокоскоростная хроматография показала выход 82,Я, исходя из И-бензилоксикарбонил.-аспартата.П р и м е р 52. Процесс проводят в условиях примера 49, но используют 15 мл аммиачной воды вместо воды и триэтиламина, рН раствора доводят до 6,0 вместо 5,0. Получают 0,800 г примесных соединений. Выход 65,8,Изобретение иллюстрируется табл. 1 и 2.1 1 с3 ХыЕха Е Еео хаюх Рао ощ еФ х 3 РЗ т 8 о %2 аХ о3 Ч 3 Ч М Чц й Х о й л л Ч0 Ф Ч еФ М Ф а фе о о о о 1 .3 ОО. ЕС 1 ВЕ1 О) 3Р 11 3О 1 ЕЕ03 5)О1 Е ЕЮО.3 3 о о о о а ао о м м а ао о о о о о 3 ЦФ о о о а о ч чоа .ч а3 Ч ммм а аЧ ЧРцо ол Ео Ех Е1- Ъ9Е а сэ а 011а 3 аха о оо о а 3 Чо о о о а а о о 1 О аЕХ а "т о хФ Ч о о аВ а л,л О оВл ол аЩ а Э РМ + -ФЧо оФо о о о оЭ а а1Ф Ф Ф 20 Фм м м м м 33 1 Ф Ф М Сее а ал (ча ам М 99, (Ч сч аСЧ (ЧеМ е еее ееее ео л р л О СО О О. Ф (О м сча а а о о о м л мО а ее а а О СЧ м м а а о о оО. ,О М а а о о о о о о а м о о о о О Ф Ч,3 (3 Ъа о о а Ю(ССЧ( 1 3 ОЪ а - СЧа а а а а а м сч сч сч а аСЧ СЧ+о ол оо аа о оа ао л а (о ъ 3 Р О а о о оаа о лееа 3 (3 ф О о Зо о аоеа3 22а аа3 о о (чо а а м а о оо а;й.с тО еыя1агеффхЗ О З3-ООы(а1 СЧ СЧ СЧ (Ч СЧ СЧ СЧ (Ч (1 л о о чо о м О м о а о о Ф о м о м (Ч со 4 4 (Ч Ф М Ф а а а а,а, а а о о о о о р оо ое (О О О СЧ (Оа ааа Ю ОО Ч 3 О еоОООО а О (О3 9101 где В - бензилоксикарбонил, пара-ме=токсибенэилоксикарбонил;Й - бензил;Йъ - метокси, этокси"группы;й - 1 или 25 М-замещенную аминодикарбоновую кислоту общей Формулы,101нос-сн,- ск- сокгде значения Я. и и указаны выще, подвергают взаимодействиф со сложным эфиром аминокарбоновой кислоты общей формулыОН 2 О - СК- С - ВЗ Щ) .202где значения К и К указаны выше.При яолярном соотношении исходныхсоединений Формул 11. и Н 1 1:1 - 1:;3,75, в водной среде, в присутствииметаллопротеазы при рН 5,07,2, температуре 10-90 С. Продукты, полученные в процессе реакции, мало растворимы в воде и выпадают в осадок. Кроме30того, предлагаемый способ позволяетполучить оптически активный продуктприсоединения дипептида и сложногоэфира аминокислоты из рацематов, поскольку реакция образования пептиднойсвязи при этом происходит только наЬ"изомерах. С другой стороны, сложныеэфиры аминокислот, используемые дляпроведения реакции присоединения собразованием продуктов присоединения,могут быть либо, в Ь-форме, либо в1)-форме, либо их смесью.При использовании 1)Ь-формы сложного эфира аминокарбойовой кислоты 1.изомер 1)Ь-Формы сложного эфира аминокарбоновой кислоты расходуется в процессе пептидного синтеза при получении продукта присоединения, остающийся сложный эфир аминокислоты имеет1)"ФормуЕсли концентрации исходных веществ 50высоки, процесс проходит с количественным выходом, При использовании двухмолей 1)Ь-формы сложного эфира аминокарбоновой кислоты на 1 моль Ь-формы,И-эамещенной моноаминодикарбоновой 55кислоты получают продукт присоединения, состоящий в основном из ЬЬ-дипептидного сложного эфира и сложного 17 4эфира 1)-аминокарбоновой кислоты. Полученный продукт присоединения может быть легко разделен на два частичных компонента, т. е. на ЬЬ-дипептидный эфир и сложный эфир 1)-аминокислоты. Таким образом, предлагаемый способ может одновременно обеспечить получение дипептидного эфира и оптическое разделение сложного эфира 1)Ь-аминокарбоновой кислоты,Отделенную 1)-Форму или обогащенную Б"форму сложного эфира аминокислоты можно рацемизовать обычным способом, и полученный продукт использовать в качестве исходного вещества в описываемом способе.При использовании 1)Ь-Формы И-заме- щенной моноаминодикарбоновой кислоты и Ь"формы сложного эфира аминокислоты 1)-изомер из Е,-формы М-эамещзннпй моноаминодикарбоновой кислоты, явля" ясь инертным, остается в водной среде, в результате чего может быть получен продукт присоединения ЬЬ-дипептидного сложного эфира и сложного эфира Ь-аминокарбонэвой кислоты. Соответственно, если 1)-форму И-замещенной моноаминодикарбоновой кислоты выделяют из водной среды, то это может одновременно обеспечить получение продукта присоединения и оптическое разделение 1 М-замещенной ВЬ-моноаминодикарбоновой кислоты. Если выделенную И-замещенную 1)-моноаминодикарбоновую кислоту рацемизировать известным способом, то полученный продукт может быть использован в качестве исходного вещества. При использовании 1)Ь-Формы Х-замещенной моноаминодикарбоновой кислоты и 1)Ь- формы сложного эфира аминокарбоновой кислоты из водной среды может быть получена И-замещенная ВЬ-моноаминодикарбоновая кислота, а также продукт присоединения ЬЬ-дипептидного сложного эфира и сложного эфира Р-аминокарбоновой кислоты, причем укаэанный продукт присоединения разделяют на компоненты, как указано выше. Одновременно может быть достигнуто обра" зование дипептидного сложного эфира и оптическое разделение Я-замещенной 1)Ь"моноаминодикарбоновой кислоты и сложного эфира 1)Ь-аминокарбоновой кислоты. Предлагаемый. способ позволяет исключить стадии введения и удаления защитных групп в боковой цепи, которые считаются неизбежными в известных, 39 910117 40Формула изобретения динения дипептидного производного и Способ получения продуктов присое- аминокислоты общей формулы 1 Составитель В. Волкова Редактор И, Ковальчук Техред 3. Фанта Корректор Г. РешетникЗаказ 3734 Тираж 448 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Иосква, Ж, Раушская наб., д. 4/5Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 где К,1 - бензилоксикарбонил, и -метоксибензилоксикарбонилВ - бензил;В - метокси, этокси-группы;и - 1 или 2,15о т л и ч а ю щ и й с я тем, чтоМ-замещенную аминодикарбоновую кисло"ту общей Формулы П,1О Ж ОаИПкос- сн,1- ск - соигде. значения Й и п указаны выше,подвергают взаимодействию со сложнымэфиром аминокарбоновой кислоты общейФормулы 1 П ОПж,-а- с-я,Зфгде значения К и В указаны выше,при молярном соотношении соединенийформулы 11 и 111 1:1 - 1 й 3,75) в водной среде, в присутствии металлопротеазы при рН 5,0-7,2, температуре10-90 С.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе1, дозеЕ Я. РпЕоп АсЬапсез хпРгойе 1 п скрепи.рггу, Асайепйс Ргеы,Зпс, Иеы дог 1 с, Н. У. 1949, чо 1. 5,с337 9101воды. Полученный раствор смешивают с50 мг термолизина, смесь встряхиваютпри 38-40 С в течение ночи. Выпавшийосадок отфильтровывают и промывают %0 мп воды и сушат. Получают 1145 мг з.тонких игольчатых кристаллов, имеющи т. пл. 117"120 С (продукт присоедине,ния метилового эфира И-бензилоксикарбонил Ь-аспартил.-фенилаланина и метилового эфира Ь"фенилаланина (1: 1); 10выход 75,54 в расчете на хлоргидрат метилового эфира"фенилаланина).После перекристаллизации из смеси растворителей этилацвтата и н-гексана физические свойства и результаты; 1 элементарного анализа продукта следующие: т. пл, 120-124 С; (4 )в = + + 7,1 (С=1, метанол).Йайдено, 4: С 63,15; Н 6,15; И 7,00С Нът яО эоРассчитано, 4: С 63,24; Н 6, 13; И 6,97.Сняты ИК-спектр и спектр Н-ЯИР продукта.1145 мг полученного продукта раст воряют в 40 мл 1 н. НС 1 и трижды экстрагируют 30 мл этилацетата. Экстракты объединяют и промывают еодойу беряпорции по 20 мл (3 раза), и сушат над безводным сульфатом магния. Раст- зовор концентрируют и продукт перекрис"таллизовывают из н-гексана, получают640 мг. Физические свойства и резуль"таты элементарного анализа Продуцаследующие: т. пл. 115"125 фС; (4-)1 "153 (С=1 метанол)Найдено, 4: С 61,52; Н ,65; Ж 6,57СаНаЦОуРассчитано, 4: С 61,67; Н 5,65; И 6,54.Результаты инфракрасного спектра и ЯИР-спектра дают характеристики,ожидаемые в метиловом сложном эфире И-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-Фе,нилаланина.Полученные результаты совпадают с результатами исследования соединения, полученного при бензилоксикарбонилировании аминогруппы метилового эфира Ь-аспартил-Ь-фенилаланина.Метиловый эфир Ь-фенилаланина вы- фО деляют из смеси солянокислой фазы и Фракции промывочной воды, отделенной при экстракции из этилацетатной фазы. Подтверждено, что соединение, полученное посредством первой реакции- продукт присоединения метилового эфира Х-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь" -Фенилаланина и метилового эФира Ь 17 8фенилаланина. Спектром Н-ЯМР подтверждено, что их молярное отношение составляет 1:1.П р и м е р 2. 1335 мг (5 ммоль) И"бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 1078 мг (5 ммоль) хлоргидрата метилового эфира Ь-фенилаланина загружают в 30 мл колбу и к смеси добавляют 10 мл воды, до их растворения и рН раствора доводят до 6 с помощью 74-ной аммиачной воды. Полученный раствор смешивают с 50 мг тер" молизина, и смесь непрерывно встряхивают при 38-40 С в течение ночи. Осадок отфильтровывают, сушат, получают 1504 мг продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил- -Ь-аспартил-фенилаланина и метилового эфира 1.-фенилаланина (1: 1); (выход 99,1 в расчете на хлоргидрат метилового эфира Ь-фенилаланина, т, пл. 104- 1 ЗфСП р и м е р 3. Получение продукта и обработку реакционной массы проводят аналогично примеру 2, но изменяют количество И-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и метилового эфира Ь-Фенилаланина на 534 мг (2 ммоль) и 863 мг (4 ммоль) соответственно, получают 1068 мг продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-Фенилаланина (1:1), Выход 70,М в расчете на М-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновую кислоту, т. пл. 116-119 ОС.П р и м е р 4. 534 мг (2 ммоль) И-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 863 мг (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира 1.-фенилаланина загружают в 30 мп колбу, растворяют в 8 мл воды, рН доводят до 6,2 с помощью -ной аммиачной воды. Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина, и смесь встряхивают при 38-40 вС в течение ночи. Осадок отфильтровывают, отделяют от раствора и сушат, получают 1099 мг продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил- -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-Фенилаланина (1:1). Выход 90,54 в расчете на Ж-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновую кислоту.ЪПример 5, 267,2 мг (1 ммоль) И-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 537 6 мг (3 ммоль). метилового эфира Ь-фенилаланина растворяют в 5 мл буферного раствора Мак-Илвай117 .1.0 9 ,910 на (рН 7,0), Полученныи раствор смешивают с 100 мг термоазы,и 100 мгкартофельного ингибитора, и смесь встряхивают в течение 20 ч при 38 СОсадок отфильтровывают и промывают водой и сушат, получают 580 мг неочищенного кристаллического продукта присоединения метилового эфира И- -бензилоксикарбонил"Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-фе- о нилаланина (1:1). Выход .95,53 в расчете на И-бензилоксикарбонил-Ь-аспаргиновую кислоту, т. пл. 123-125 С.Продукт растворяют в 40 мл смеси диметилформамид и вода (1: 1), и к 15 раствору добавляют при перемешивании Н-форму сильнокислотной катионообменной смолы, которую затем отделяют и фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Остаток растворяют в диме тилформамиде и к раствору добавляют воду, в осадок выпадает 330 мг метилового эфира И-,бензилоксикарбонил,"-аспартил-Ь-Фенилаланина, выход 77,0 в расчете на И-бензилоксикарбонил-Ь -аспарагиновую кислоту, т. пл. 123125 фС.П р и м е р 6. 267,2 мг (1 ммоль) Ч-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой , кислоты и 537,6 мг (3 ммоль) метилового эфира Ь-фенилаланина растворяют в 5 мл буФерного раствора Мак-Илвайна, (рН 7,0). Полученный раствор сме" шивают со 100 мг тациназы И и со 100 мг картофельного ингибитора,ф.Э 5 смесь встряхивают в тецение 6 ц при 38 С. Осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат. Получают 120 мг неочищенного кристаллического продук.та присоединения метилового эфира И- -бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина (1: 1) выход -19,4, т. пл.119-123 оССогласно примеру 5,продукт обрабатывают сильнокислотной катионообменной смолы в Н-форме, получают 50 мг метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь"аспартил-Ь-фенилаланина. Выход 11,74, т, пл. 95".105 фС.П р и м е р 7. 1335 мг (5 ммоль)50 И-бензилокси карбонил-Ь-аспара гиновой кислоты и 1078 мг (5 ммоль) метило" вого сложного эфира Ь-фенилаланина загружают в 30 мл колбу, добавляют 4 мл воды, рН полученного раствора доводят до 6,8 с помощью триэтиламийа, добавляют 20 мг термолизина смесь"встряхивают йри 38-40 фС в течение 2 дней. Осадок отфильтровывают, промывают 40 мл воды, сушат, получа" ют.475 кг продукта присоединения иетилового эфира И-бензилоксикарбонил- -Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метило" вого эфира Ь"фенилаланина (1: 1), Выход 31,34 в расчете на хлоргидрат ме" тилового эфира Ь-фенилаланина. После перекристаллизации из смеси этилаце" тата и н-гексана получают продукт с т. Пл. 120-124 фС, (4.) щ + 7,2(С-1, метанол)Элементарный анализНайдено, о: С 63,52; Н 6,22; И 7,04Рассчитано, 4: С 63,24 у Н 6,13; И 6,97П р и м е р 8. Процесс ведут аналогично примеру 7, но рН доводят до 5,2, получают 753 мг продукта присоединения метилового эфира И"бензи- локсикарбонил-Ь-аспартил-Ь-Фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина (1:1). Выход 49,5 Ф в расчете на метиловый эфир Ь-фенилаланина.П р и м е р 9 К раствору 133,6 мг (0,5 ммоль) И-бензилоксикарбонил-Ь" -аспарагиновой кислоты и 89,2 мг (0,5. ммоль) метилового эфира Ь-фенилаланина в 2,5 мл буферного раствора,Мак-Илвайна (рН 7,0) с 0,07 мл триэтил" амина, имеющему рН 6,7; добавляют 50 мг термоазы и 50 мг картофельного ингибитора, смесь встряхивают при 38 С в течение 20 ч. Осадок отфильт"йровывают, промывают водой, получают130 мг неочищенного продукта присое динения метилового эфира И-бензилок" сикарбонил-Ь-аспартил-Ь-Фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина (1:1). Выход 85,54 в расчете на метиловый эфир Ь-фенилаланина, т. пл, 115- 124 фС.Раствор продукта растворяют в20 мл смеси из диметилформамида и воды (1: 1), обрабатывают сильнокислот ной катионообменной смолой в Н-форме согласно примеру 5, получают 75 мг метилового эфира И-бензилоксикарбонил-ь"фенилаланина, полный выход 70 ь в расчете на 50 количества исходного метилового эфира Ь-фенилаланина.П р и м е р 10. Реакцию проводят аналогично примеру 9, но используют 0,05 мл И-метилморфолина вместо 0,07 мл триэтиламина при начальном рН 6,4. Получают 120 мг неочищенного кристаллического продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикар- бонилгЬ-аспартил-Ь-фенилаланина и11 91 метилового эФира Ь-Фенилаланина (1:1), фиход 78,93 в расчете на метиловый эфир Ь"Фенилаланина, т. пл. 118-124 С,Продукт обрабатывают сильнокислотной катионнообменной смолой в Н-форме согласно примеру 9, получают 70 мг кристаллического метилового эфира И- -бензилрксикарбонил-Ь"фенилаланина. Полный выход 664 в расчете на 503- ное использование количества исходного метилового эфира Ь-фенилаланина.П р и м е р 11. Проводят реакцию аналогично примеру 4, но реакцию проводИт при рН 6,5 при встряхивании в течение 1 ч, получают 920 мг продукта,присоединения метилового эфира И- -бензилоксикарбонил-Ь"аспартил-Ь-Фе нилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина (1:1), Выход 75,83.П р и м е р 12. 524 мг (2 ммоль) И-бензилоксикарбонил-Ь"аспарагиновой кислоты и 863 мг (4 ммоль);хлоргидрата метилового эфира Ь-Фенилаланина растворяют в 2 мп воды, к раствору добавляют 5,5 мг 1 н. ИаОН до:рН 7.Полученный раствор смешивают с 50 мг термолизина и смесь встряхивают при 38-40 дС в течение 2 н. Осадок отфильтровывают, высушивают, получа-. ют 734 мг продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил- -Ь"аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь"фенилаланина (1:1). Выход 60,51 т, пл. 106-118 дС.П р. и м е р 13. 540 мг (2 ммоль) И-бензилокси карбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 863 мг (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира Ь-Фенилаланина растворяют в 7 мл воды, рН раствора доводят до 6 с помощью 73-ной аммиач" ной воды, к раствору добавляют 100 мг термоазы, смесь встряхивают при 38" 40 фС в течение ночи. Осадок отфильтровывают, промывают 70 мл воды, сушат, получают 550 мг продукта присо-. единения метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-.аспартил-Ь-.фенилаланина (1:1). Выход 45,3 Ж, т, пл. 113-116 фс,П р и м е р 14. 270 мл (1 ммоль) И"бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 432 мг (2. ммоль) метилового эфира Ь"Фенилаланина растворяют в 4 мл воды, рН раствора доводят до б с помощью 7-ной аммиачной воды.К полученному раствору добавляют 50 мг термоазы, смесь непрерывно встряхивают при 38-40 дС в течение 40.ч. Осадок отфильтровывают, сушат, получают 177 мг продукта присоедине 0117 12ния метилового эфира Ы-бензилокси"карбонил-Ь-аспаргил-Ь-фенилаланинаи метилового эфира Ь-Фенилаланина(1: 1). Выход 29, 13 т. пл. 103-112 С,П р и м е р 15Процесс проводятаналогично примеру 14, но в раствордобавляют дополнительно еще 50 мг кар"тофельного ингибитора. Получают 381 мгтого же самого продукта. Выход 62,",1 о т. пл. 105-117 дС,П р и м е р 16. 534 мг (2 ммоль)И-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновойкислоты и 863 мг (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира РЬ-фенилаланина15 растворяют в 7 мл воды, величину рНдоводят до 6,2 с помощью 74-ной аммиачной воды.Полученный раствор смешивают с50 мг термолизина и встряхивают в те 2 в чение ночи при 38-40 С. Осадок отфильотровывают, сушат, получают 1045 мг .продукта присоединения метиловогоэфира И-бензилоксикарбонил-аспартил-.-фенилаланина и метилового эфира Фенилаланина (1:1), Выход 86,13 в рас"чете на И-бензоилкарбонил-Ь-аспаргиновую кислоту, т. пл. 104-108 С.После перекристаллизации из смесиэтилацетата и н-гексана полчают про 30 дукт с т. пл. 127"135 С,7.4.11 = - 6,4(С = 1, метанол).Найдено, 4: С 63,521 Н 6,19; И 6,92ЕС 5 Нд ИОз 2У Рассчитано, 4: С 63,24; Н 6,131И 6,97.Иетодом ЯИР показана тождественность полученного продукта с продуктом присоединения метилового эфираИ-бензилоксикарбонил"Ь-аспартил-Ь 40"фенилаланина и метилового эфира Р-фенилаланина (1: 1), т. е. соединениепо примеру 1.800 мг продукта растворяют в 40 мг1 н. НС 1 и экстрагируют дихлорметаном,(30 мл х 3), органическую Фазу отде.ляют, промывают водой, сушат над безводным сульФатом, упаривают, остатокперекристаллизовывают из смеси этил-,ацетата и н-гексана, получают 450 мгкристаллического продукта, т. и. 124132 дС, 1 А.3 = - 15,3 (С = 1 метанол).Найдено, 3: С 61,38; Н 5,58; И 6,29Са 114 ИОтРассчитано, 4: С 61,67;.Н 5,65;И 6,54.55Продукт представляет собой метиловый эфир И"бензилоксикарбонил-Ь-аспаргил-Ь-фенилаланина.13 910Водную фазу после отделения слоВ дихлорметана смешивают с бикарбонатом натрия, значение рН доводят до 8,7, продукт трижды экстрагируют 30 мл хлористого метиленаЭкстракт . 5 сушат над безводным сульфатом магния, в экстракт подают газообразный хлористый водород в течение 1 О мин, затем упаривают досуха. Остаток перекристаллизовывают из этилового эфира, по лучают 29,0 мг хлоргидрата метилового г - ИгЬ-Р 3 а -ИЕ 61,84 в расче.-бензилокси О кислоту, т. После пе этилацетата продукт с т 7,2 (С = 1,5 Из оставш выделяют И-б гиновую кисл ме) .си сиарафор спользуют оба.немета Ж - РЬ амер аепгя ПКЦИЧИРР 1 даргяРореяв Ь-РЬе -Ию -Остать Процесс про еру 17, но иЬ-фенилалани 1069 мг Ь ммоль) И-бензилокси- карбонил-РЬ-аспарагиновой кислоты и 863 мг 4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира Ь-Фенилаланина растворяют в 2 мл воды, значение рН доводят до 6 с помощью 71-ной аммиачной воды.Полученный раствор смешивают с 50 .мг термолизина и встряхивают при 38-40 С в течение 2 ч. Осадок отфильтровывают, промывают 20 мл воды,. сушат, получают 787 мг продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспаргил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина дят аналогично при"ользуют метиловый эфирвместо метилового 117 Цэфира Р-фенилаланина, . пл, 1 б 9- 151 С,ГЦ р = 1;1 (С =" 1, метанол); (инфракрасный спектр и-спектр ЯИР совпадают со спектрами Ь"формы). Таким образом, полученный продукт- продукт присоединения метилового эфира М-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил"Ь- -фенилаланина и метилового эфира Р- фенилаланина 1: 1) .П р и м е р 17. карбонил-Ь-аспа рагин.л, 10 Бфс.рекристаллизации изи н-гексана, получщпл, 121-125 фС 11 М)метанол)ейся реакционной смеензилоксикарбониласпоту (в основном в Рэфира Ь-фейилаланина. Получают756 м 1 продукта присоединения мети вого эфира И-бензилоксикарбонил-Ь"аспартил,-фенилаланина и метилового эфира О-фенилаланина (1: 1). Выход62,3 в расчете на Ж-бензилоксикар"бонил-Ь-аспарагиновую кислоту,т. гщ. 105-111 С.5Продукт перекристаллизовывают изсмеси этилацетдта и н-гексана, т.пл.126-134 С, ОЛ 1 = - 6,5 (С = 1, метанол). Из оставшейся реакционной смесивыделяют И-бензилоксикарбониласпарагиновую кислоту (в основном в В-Форме),П р и м е р 19. 5,34 г (20 ммоль)И-бензилоксикарбонил-Ь-аспарагиновойкислоты и 7,32 г (42 ммоль) метилового эфира Ь-Фенилаланина растворяют в70 мл воды, Получают раствор с рН6,2-6,3.К раствору добавляют 200 мл термолизина и смесь непрерывно встряхивают щв течение 4 ч при 38-40 С. Осадок отфильтровывают, промывают 70 мл воды,сушат, получает 10,11 г продукта,(1:1), после перекристаллизации изсмеси ацетта и н-гексана, т. пл, 120 Зо124 С, С 3 щ + 7,2 (С = 1, метанол).Найдено, : С 63,16; Н 6,14 р Иб)99СЯДУ АзуРассчитано, : С 63,24) Н 6,13И 6,97, 55Инфракрасный спектр и спектр ЯЙРпоказали те же характеристики, которые указаны выше для продукта присое-.. динения (1:1) метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-Фенил"40аланина и метилового эфира Ь-фенил"аланина, После обработки полученногопродукта сильной кислотой экстракцииэтилацетатом, последующей отганки ор-.ганического растворителя получают ме",тиловый эфир Ы-бензилоксикарбонил"Ь-аспартил-Ь-фенилаланина.1,00 г (1,65 ммоль) полученногопродукта присоединения метиловогоэфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспар 50тил-Ь-фенилаланина. и сложного эфираЬ-фенилаланина загружают в 30 мл колбу и добавляют 2 мл воды и 2,0 мп 1 н.Н 2, смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин.Суспензию Фильтруют, осадок промы"55вают 4 мл воды, сушат, получают0,72 г метилового эфира И-бензилок 17 , 16 сикарбонил-Ь-аспаргил-Ь-Фенилаланина. Выход 98,84. После растворения в этилацетате продукт осаждает н-гексаном, т. пл. 121-124 фС, 1,3 1 Р -15,4 (С = 1, менол).Найдено, Ф: С 61,58; Н 5,64; И 6,56. сйи,о Рассчитано, 4: С 61,67; Н 5,65; И 6,54.Инфракрасный спектр продукта совпадает со спектром стандартного продукта.Идентичность продукта подтверждена сравнением водного раствора полученного продукта с водным раствором стандартного соединения методом высокоскоростной жидкостной хроматографии. Чистота, измеренная этим способом, составляет 1003, Устройство для проведения высокоскоростной жид- костной хроматографии и условия ее проведения указаны ниже. Этот способ также использован для оценки чистоты продуктов разложения, продуктов присоединения в примерах, если это не оговорено иначе. То же устройство и те же условия использованы в примерах, если речь идет об этом способе.Устройство для высокоскоростной жидкостной хроматографии (ТИК-НЬС 801) .Колонка: внутренний диаметр 7,5 мм длина 30 см; наполнитель: крахмальный гель, размер частиц 5 мкм (ТЯКЯ":Ь Ьо 1,70) ;Элюент; 0,54"ный водный раствор ацетата натрия. Скорость потока 0,8 мл/мин перепад давления 20 кг/см,. температура измерения комнатная, де- тектор -. дифференциальный рефрактометреП р и м е р 20. 1,00 г (1,65 ммоль) продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбанил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфи" ра Ь-фенилаланина, полученного в примере 19, растворяют в смеси 2 мл воды и 1,32 мл 1 н. НСс . Реакционную массу перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин и обрабатывают в условиях по примеру 19, Получают 0,70 г продукта в виде тонких призматических кристаллов. Содержание метилового эфира Х-бензилоксикарбонил"Ь-аспартил-Ь-фенилаланина 96,8 В т. пл. 100-,126 фС.Пример 21.(0,82 ммоль) продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового,эфира Ь-фенилаланина, полученного в примере 19, добавляют 4 мл во" ды и 0,24 г (1,2 ммоль) и-толуолсуль" фокислоты моногидрата, обрабатывают смесь по примеру 19, получают 0,33 г кристаллов метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспаргил-Ь-фенилалани" на. Чистота 1003; выход 93,64.П р и м е р 23. К смеси 0,45 г(0,82 ммоль) 853 муравьиной кислоты и 8 мл воды добавляют 0,50 г(0,82 ммоль) продукта присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбо" нил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-фенилаланина, полученного в примере 19, смесь перемешивают в течение 20 мин при комнатной температуре, продукт отфильтровывают, промывают 10 мп воды, сушат,. получают 0,312 г белых кристаллов метилового эфира, И-бензилоксикарбонил", -Ь-аспартил-Ь-Фенилаланина. Чистота Ч)ОЖ; выход 88,64. исталловсикарбо"на, Чисто" иБ-РЬе-Ме не реагирует с М-Ь-А 5 р, в реакции с протеазой связывается с дипептидом и осаждается как аддитивное, соединение.0,534 г (2 ммоль) Х-бензилоксикар" бонил-Ь-аспарагиновой кислоты и 0,863 г (4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира РЬ-Фенилаланина растворяют в 10 мп воды, рН раствора доводят до 6,0 с помощью 74-ной аммиачной во" 5 ды. К раствору добавляют с 50 мг термолизийа и смесь встряхивают в течение ночи при 38-40 С. Осадок отфильтровывают, промывают 10 мл воды и сушат, получают 0,90 г кристаллического зо продукта. Т. пл, 120-126 С. После перекристаллизации из смеси этилацетата и н"гексана, получают продукт с т,пл.128-134 С и Г 44 = - 6,3 (С = 1, ме 0танол). Инфракрасный .спектр и спектр35 ЯИР продукта идентичны спектрам присоединения метилового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Ь-Фенилаланина (1:1).Найдено, 4: С 63,42; Н 6,17; И 6,95Рассчитано, Г: С 63,24; Н 6,13 1 Ч 6,97.Продукт обрабатывают кислотой, получают метиловый эфир И-бензилокси" карбонил-Ь-аспартил-Ь-фенилаланина и метиловый эфир Р-Фенилапанина в мольном отношении 1:1. Из полученных результатов сделан вывод, что соедине" ние есть продукт присоединения мети"5 О лового эфира И-бензилоксикарбонил-Ь- -аспартил-Ь-фенилаланина и метилового эфира Р-фенилаланина (1: 1).Смесь 0,50 г (0,82 ммоль) продукта присоединения с 4 мл воды и 0,26 г 55 лимонной кислоты перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин и обрабатывают в условиях приП р и м е р 24. 0,47 г(0,82 ммоль) ледяной уксусной кислоты и 8 мл воды помещают в 30 мл колбу, 0,50 г (0,82 ммоль) продукта присоед нения метилового эфира Ы-бензилокси" карбонил-Ь-аспартил-Ь-ФенилаПанина и метилового эфира Ь-фенилаланина, смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 10 мин, продукт отфильтровывают, промывают 10 мл во-, ды, сеат, получают 0,308 г белых кристаллов метилового эфира И-бензи,