Олигодезокситионуклеотиды, проявляющие матричные свойства в рнк-полимеразной системе из еsснеriснid coli

Союз СоветскихСоииалистическихРеспублик ОПИСАНИЕИЗОБРЕТЕНИЯК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ и 899571(22) Заявлено 130779 (21)2798760/23-04с присоединением заявки Мо(31) М. Кл. С 07 Н 21/04 Государственный комитет СССР ио делам изобретений и открытий(71) Заявитель Институт цитологии и генетики Сибирск 54) ОЛИГОДЕЗОКСИТИОНУКЛЕОТИДЫ,ПРОЯВЛЯЮЩ 1 Е МАТРИЧНЫЕ СВОЙСТВА В РНК-ПОЛИМЕРАЗНОЙ С 1 СТЕМЕ ИЗ Е 5 СНЕйСН 1 А СО. Изобретение относится к новым биологически активным олигодезокситионуклеотидам общей Формулы 0 5 СН(1)О О О в-О р-СНО О о оп.Ой где В - тимин, цитозин, аденин,гуанин,йЛ. - Н, остаток тиофосфата 5-/-цианили 1,К-дифенилкарбомоил)зтилфосфотиоата; и щ 1,2 3проявляющие матричные свойства в РНК- полимераэной системе иэ Гзспегст 1 а со 1.Соединения Формулысоставляют новую группу класса тиоаналогов природных полидеэоксирибонуклеотидов,отличаясь от последних типом связимежду составляющими их мононуклсотидами,а от известных соединенийналичием новых структурных Фрагментов остатков гуаниловой и цитидиловой кислот,Известные 2 -дезоксигексатиотимидилаты и олигодеэокситионуклеотидывследствие малой длины и неполногонабора составляющих их мономерныхнуклеотидов не являются полноценнымианалогами ДНК и не проявляют матричные свойства при транскрипции в РНК 15 полимеразной системе из Еснег)сеасо 111 и ,2 Д.цель изобретения - получение новыхолигодезокситионуклеотидов, близкихпо своим биологическим свойствам при 2 О родным ДНК и расширяющих арсеналсредств воздействия на живой организм.Поставленная цель достигается но"выми олигодезокситионуклеотидами общей формулы 1, проявляющими матрич 25 ные свойства в РНК-полимеразной системе иэ Евспег 1 сЬ 1 а со 11.Способ получения новых олигодезокситионуклеотидов основан на реакцииполучения 2 -деэоксигексатиотимиди 30 латов, исходя из литиевой соли тн 899571мидил(или олиготимидил)3-Фосфотиоатов и 2 ,5-дидеэокси-иод произ (водного тимидина, и состоит во взаимодействии производных деэоксинуклеозид-Фосфотиоатов общей формулы РрбСН (35( )0 -Ьк 1Оф 0 Кс с 5 -иод-производными тионуклеотидовобщей формулы ЗСН О ф() где В - тимин; М -анизоилцитозин;М-изобутирилгуанин; М -бен 2эоиладенин; 20В 2 - Н; олигодезокситионуклеотидилкатион натрия или лития;:;йметилформамида в течение 4 ч, Конец реакции определяют иодметрическим титрованием свободных тиофосфатных групп или ионообменной хроматографией, По окончании реакции смесьобрабатывают 15 мл ацетона осадокцентри 5 угируют промывают ацетоном,5 х 5 мл) и сушат в вакууме, Получают0,095 г осадка, содержащего0,046 ммоль 5-(-(М,М-дифенил)карбомоилэтильного производного (2 ).Полученный осадок растворяют в 2 мл,0,5 н, гидроокиси лития, выдерживают1 ч, экстрагируют толуолом (Зх 2 мл)и водный слои нейтрализуют катионообменной смолой дауэксом 50(Н -фор+ма) до рН 7,5, Смолу.отфильтровыва Оют и Фильтрат лиофильно высушивают.Получают 0,087 г осадка, содер(ащего 0,046 ммоль производного (2 )(92 по результатам микрохроматограФии на аминохроме). 65 Стадия (. 0,043 г продуктастадии, содержащего 0,023 ммоль(0,046 ммоль), встряхивают в 1 млдиметилформамида в течение 4 ч,раствор выдерживают еще 1 ч и продуктосаждают 10 мл ацетона. Осадок промывают ацетоном (Зх 5 мл) и высушивают в вакууме, Затем его растворяютв 5 мл 25-ного водного растворааммиака, выдерживают 4 ч при 50(С,упаривают в вакууме и остаток растворяют в 1 мл 0,1 М бикарбоната аммония (рН 7,5), содержащего 10 этанола. Этот раствор наносят на кол 6 нку с сефадексом 6-25 (5 х 100 см) иэлюируют тем же буфером. Первый пиксобирают и упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 10 мл смеси вода - спирт (1:5) и упаривают досуха.Эту процедуру повторяют еще два раза и затем продукт лиофильно высушивают, Получают 0,04 г (90) пентааммонийной соли соединения 1(82,5 в расчете на исходный.(6 -соли соединения 2 и 0,15 г литие,+вой соли 2, 5-диез окси(-иод- М 4- -анизоилцитидин-5-)5-цианэтилфосфотиоата (0,024 ммоль), встряхиваютв 1 мл диметилформамида 4 ч, выдерживают еще 1 ч и продукт выделяюткак встадии примера 1, Защиту стиофосфатной группы проводят так же,но без экстракции толуолом, Получают 0,05 г осадка, содержащего0,0215 ммоль .(+-соли соединения 4(94), которую очищают хроматографией на аминохроме.Стадия (. 2(-Дезокси(тимидилил(-5-(-(М,М-дифенил)карбомоиЛэтилфосфОтиоата (0,0227 ммоль), встряхиваютв 2 мп диметилформамида, содержащего2 воды, в течение 5 ч, выдерживаютеще 2 ч и продукт выделяют как в1 стадии примера 1,промывая осадок вконце смесью этанол - ацетон (1:1,3),Защиту с тиофосфатной группы снимают как в 1 стадии примера 1,используядля экстракции толуол (Зх 3 мп). Получают 0,054 г неочищенного продукта1 Осодержащего 0,020 ммоль соединения5 (93), который очищают ионообменной хроматографией на аминохроме.Стадия 11. 0,027 г соединения 5,содержащего 0,01 ммоль .1-соли соединения с и 0,01 в 2 ,5 -дидезокси-иод-М -бензоиладенозина6(0,02 ммоль), встряхивают в 1 млдиметилформамида, содержащего 2 воды, в течение 5 ч, выдерживают еще2 ч и продукт выделяют как встадии примера 1,промывая осадок этанолом - спиртом (1:1,1). Снятие защитс оснований нуклеотидов и гель-хроматографию проводят как во 11 стадиипримера 1 используя вместо сефадекса р 56-25 сефадекс 6-50 суперфайн. Выходгептааммонийной солИ соединения 30,023 г (89 или 72 в расчете на(ТРь)4 1-5 ).Копия радиоавтограммы, полученнойпри определении первичной структуры,приведена на фиг. 1.-тиоцитидилил)-3 ,5-ди-(5 -дезоксис -тиоаденилил)-3,5 в (5 -дезокси,-тиотимидилил)-3,5 в (5 -дезокси-тиогуанозин)1,40 ТреТрвТрэ СрвТРвТрсТрв Срв (9 ).Стадия 1. 2 -Дезокситимидилилс-3 , 5 в (5 -дезокси-тио-М 4-анизоилсцитидин)1-3 -фосфотиоат (10).с0,05 г тетралитиевой соли 2 -де-, зокситимидилил- ,5 в (5 -дезокси-тиотимидилил)-3 ,5 в (5-дезокси- -5 -тиотимидин-фосфотиоата ТрТрТръТрь рсрь КрзТрз Сон (6)Стадия 1. 2 -Дезокси 1 тимидилил- -3,5 -три-(5 -дезокси-тиотимидилил)-3 ,5 в ,5 -дезокси-тио-Мгс с г -изобутирилгуанилил)-3 ,5 в (5 -де зокси-тио-М 4-ан 4 зоилцитицилил) - -3 ,5 в ,5 -дезокси-тио-М-бензоиладенилил)-3 с,5 в (5 с -дезокси- -тио-Мб-бензоиладенозин)3 - 3 -фосфотиоат 7).500,027 г неочищенного продукта, полученного на1 стадии примера 2,содержащего 0,01 ммоль 8-соли соединения 5 и 0,087 г литиевой соли 2 5 -дидезокси-иод-М -бензоиладеносзин-5-Р -(М,М-дифенил -карбомоил этилфосфотиоата 0,011 ммоль,встряхивают в 1 млдиметилформасида,содержа-. щего 2 воды,в течение 4 ч,выдерживают еще 2 ч, Продукт выделяют как в стадии примера 1, проводя промывку щ осадка 2 мл смеси этанол - ацетон (1:1). Защиту с тиофосфата снимают так же как Ф примере 1, Получают 0,031 г неочищенного продукта, содержащего 0,0091 ммоль (91) соеди ненни 7, который очищают ионообменной хроматографией.Стадия 11. 2 с-Дезокси( тимидилил,5 -три(5 -дезокси-тиотимидилил)-3,5 в (5 -дезокси-тио-М2(0,01 ммоль), встряхивают в 1 мл диметилформамида, содержащего 2 воды,б ч, раствор затем выдерживают 2 чи продукт выделяют как в 1 стадиипримера 1, промывая осадок дополнительно этанолом (2 х 2 мл). Снятие защитыс тиофосфата проводят аналогичностадии примера 1. Получают 0,031 гнеочищенного продукта, содержащего0,0082 ммоль (90) соединения б,который очищают ионообменной хроматографией.Стадия 11, 0,031 г соединения 8,содержащего 0,0082 ммоль его-сос с ,оли и 0,0072 г 2 ,5 -дидезокси-иод-М -изобутирилгуаноэина ,0,016 ммоль),встряхивают в 1 мл диметилформамида,содержащего 3 воды, в течение б ч,выдерживают,еще 3 ч и продукт выделяют как встадии примера 1,промывая осадок в конце этанолом (2 х 2 мл).После снятия защит с оснований аммиаком продукт выделяют гель-хроматографией как в11 стадии примера 2. Затем продукт рехроматографируют нааминохроме с(колонка 2,3 хх 25 см в линейном градиенте 0-0,2 Ибикарбоната аммония, рН 7,0), используя резервуар и смеситель объемомпо 1 л, скорость элюции 300 мл/ч.Продукт элюируется 0,18 М бикарбонатом аммония. Пик собирают, упаривают, удаляют бикарбонат аммония упариванием трижды с 30 мл смеси водыспирт (1:5) и продукт лиофильно высушивают. Выход соединения б в виденонааммонийной соли 0,023 г (86)или 51 в расчете на (Трь)4 .5).П р и м е р 4. 2 -Дезокситимидилил,5 -ди-(5 -деэокси-тиотимидилил)-3,5 в (5-дезокси-тиоцитидилил) -3 ,5-три-(5 -дезокси-тиос стимидилил)-3 ,5 в (5 -дезокси-тиоцитидин)-3 -фосфотиоат, 899571(0,05 ммоль) и 0,033 г литиеной соли 2 ,5 -дидезокси-иод-й(-анизоил( ( Пцитозин(-5цианэтилфосфотиоата (0,0525 ммоль) растворяют при встряхивании в 2 мл диметилформамида и ныдерживают 2 ч. Затем обрабатынают 10 мл ацетона, осадок центрифугируют, промывают ацетоном (5 х 4 мл) и высушивают в накууме. Получают 0,075 г бесцветного порошка, содержащего 0,046 ммоль (92) цианэтильного производного соединения 10, Этот осадок растворяют в 2 мл 0,5 н. гидроокиси лития, выдерживают 1 ч и нейтрализу- ют избыток щелочи катионообменной ;. смолой дауэкс(Н+-форма), Смолу отфильтровывают, а фильтрат лиофильно высушивают. Получают 0,072 г неочищенного продукта, содержащего 0,046 ммоль (92) пенталитиевой соли соединения 10, а также следы исходных веществ. Продукт очищают ионооб менной хроматографией на аминохроме с.Стадия 1, 2-Дезокси тимидилил- -3 ,5 -ди-(5 -дезокси-тиотимиди( (лил)-3,5 в (5 -дезокси-тио- -анизоилцитидилил)-3,5 в (5 -дезокси- -5 -тиотимидин Ц -3 -фосфотиоат,(11) .0,072 г соединения 10, содержащего 0,046 ммоль его-соли и 0,0245 г литиевой соли 2 ,5 -дидезокси-иодтимидин-5- -цианэтил(фосфотиоата (0(0485 ммоль , встряхивают в 2 мл диметилформамида 1 ч, выдерживают раствор еще 1 ч н обрабатывают как в 1 стадии, дополнительно промывая осадок 2 мл смеси этанол ацетон (1:1) .После аналогичного снятия защиты и высушивания получают 0,082 г неочищенного продукта, содержащего 0,0415 ммоль (90) гексалитиевой соли соединения 11, которую очищают 40 ионообменной хроматографией.Стадия 11. 2(-Дезокситимидилил- -3 ,5 -ди-(5 -дезокси-тиотимиди( ( (лил) -3 .5 - (5 -дезокси-тио-й 4- -анизоилцитидилил)-3(,5 в (5-деэокси -5,-тиотимидилил) -3 ,5 в (5 -дезокси- -5 -тиотимидин ) -3 -Фосфотиоат (12).0,082 г соединения 11, содержащего 0,0415 ммоль его .+ -соли и( 0,022 г литиевой соли 2 ,5 -диде- у 0 эокси-иодтимидин- 5-Р-цианэтилфосфотиоата (0,044 ммоль), н 2 мл диметилформамида, содержащего 1 воды, встряхивают 2 ч, выдерживают еще 2 ч и обрабатывают как настадии, промывая осадок 2 мл этанола, После снятия защиты с тиофосфата и высушивания попучают 0,082 г бесцветного порошка, содержащего 0,0375 ммоль (91) гепталитиеной соли соединения 12, которую очищают 60 ионообменной хроматографией.Стадия 1 Ч. 2(-Дезокситимидилил- -3 ,5 -ди-(5 - дезокси-тиотимиди(лил)-3 ,5 в (5 -дезокси-тио-(4- -анизоилцитидилил)-3,5 -ди-(5-де- у эоксиф -тиотимидилил;)-3,5-(5 - -дезокси-У -тиотимидин)1-3 -фосфотиоат (13).0,082 г соединения 12, содержащего 0,0375 ммоль 1.+-соли 0,02 г7( литиевой соли и 2 ,5 -дидезокси-иодтимидин-5-5-цианэтилфосфотиоата (0,040 ммоль)встряхивают н 3 мл диметилформамида( содержащего 1 воды, 3 ч, выдерживают раствор еще 2 ч и затем обрабатывают как на 1 стадии, промывая осадок в конце 2 мл этанола, После снятия защиты с фосфотиоатной группы и. высушинания получают 0,082 г порошка, содержащего 0,034 ммоль (91) окталитиевой соли соединения 13, которую очищают ионообменной хроматографией.Стадия )1, 0,082 г соединения 13, содержащего 0,034 ммоль его й -со+ ли и 0,024 г литиевой соли 2 5( -дидезокси-иод-М 4-анизоилцитидин- -3-5цианэтилфосфотиоата (0,038 мысль) встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержащего 2 воды 3 ч, выдерживают еще 3 ч и обрабатывают как на 1 стадии. После снятия защиты с тиофосфата осадок обрабатывают аммиаком как но 1стадии примера 1 и выделяют продукт, как н 11 стадии примера 3 при помощи ионообменной хроматографии на аминохроме, используя градиент 0-0,3 М бикарбоната аммония. Выход моноаммонийной соли соединения 9 85 (0,078 г или 58 н расчете на (Трь)3(. + ) . Вещество гомогенно при ионообменной н гель-хроматографии.П ( и м е р 5, 2 -Дезоксигуаниг(лил5 в (5 -дезокси-тиотимидилил)-3 ,5 -ди-(5 -дезокси-тиоцити(дилил)-3 ,5 в (5-дезокси-тиоадени-лил)-3 ,5 -гекса-,5 -дезокси-тио( ( ( ((йСтадия 1. 2 -Дезокси ( й изобутирилгуанилин-Э,5 в (5-дезокси- -тиотимидин)1-Э -фосфотиоат (15),0,048 г дигидрата дилитиеной соли 2 -дезокси-й-изобутирилгуанозин 2-Фосфотиоата 2 (сСрв (О,(нль) и1 Ь0,0532 г литиевой соли и 2 -5 -дидезокси-иодтимидин(-5-Р-цианэтилфосфотиоата (0,105 ммоль) растворяют в 2 мл днметилформамида и выдерживают 1 ч при комнатной температуре, К реакционной смеси добавляют 20 мл ацетона, осадок центрифугируют, промывают ацетоном (5 х 10 мл), высушивают в вакууме и снимают защиту с тиофосфата как встадии примера 4. Получают 0,08 г бесцветного порошка, содержащего 0,095 ммоль (95) трилитиевой соли соединения 15, которую очищают ионообменной хромлитографией.Стадия 1 2 -Дезоксий -изобу(тирилгуанилил,5 - 5( -дезоксн(0,1 ммоль), встряхивают в 2 мл диметилформамида 0,5 ч, выдерживаютраствор 1 ч и обрабатывают как настадии. После снятия защиты с тиоФосфата как настадии примера 4получают 0,119 г неочищенного продукта, содержащего 0,089 ммоль(93,5) тетралитиевой соли соединения 16,Стадия . 2 -ДезоксиГИ в изобу Ятирилгуанилил,5 в (5 -дезокси-(0,0935 ммоль), встряхивают в 2 млдиметилформамида 1 ч. Раствор выдерживают еще 1 ч и обрабатывают какнастадии. Зациту с тиофосфатаснимают как встадии примера 4.Получают 0,15 г порошка, содержащего0,081 ммоль (92) тенталитиевой соли соединения 17, которую очищаютионообменной хроматографией,Стадия Н, 2-Деэокси(й -изобутирил,5 в (5-дезокси-тиотимидилил)-3 ,5 -ди(5 -дезокси-тио-И 4 -анизоилцитидилил)-3,5 в (5-дезокси-тио-й -бензоиладенозин)( --й -бенэоиладенозин-5-(-цианэтилбфосфотиоата (0,085 ммоль), встряхивают в 3 мл диметилформамида 1,5 ч,выдерживают раствор 2 ч и обрабатывают как настадии, Снимают защиту стиофосфата как встадии примера 4и получают 0,17 г порошка, содержащего 0,075 ммоль (93) гексалитиевойсоли соединения 18.Стадия Н. 2 -Дезокси й -изобу 2тирилгуанилил,5 в (5 -дезокси. --анизоилцитидилил) в3 ,5 в (5 -дезукси-тио-й -бензоиладенилил)-3 ,56в (5-дезокси-тиотимидин)-3-фосфотиоат (19),0,017 г соединения 18, содержащего 0,075 ммоль его " -соли и0,042 г литиевой соли 2 ,5 -дидеэокси-иодтимидин-5цианэтилфосФотиоата (0,082 ммоль), встряхиваютв 3 мн диметилформамида 2 ч, выдерживают еще 1 ч и обрабатывают как настадии, промывая дважды осадок2 мл смеси этанол - ацетон (1:1).Защиту с Фосфата снимают как встадии примера 4. Получают 0,179 г осадка, содержащего 0,0685 ммоль (91)пепталитиевой соли соединения. 19,которую очищают ионообменной хроматографией.Стадия Н. 2 -Дезокси( й -изобутирилгуанилил,5 в (5 -дезокси-тиотимидилил)-3,5 -ди-(5 -дезокси-"тиевую соль 2 ,5 -дезокси-иодтимидив-5-(-цианэтилфосфотиоата,встряхивают в 3 мл диметилформамида,20 содержащего 1 воды, в течение 4 ч,выдерживают 2 ч и обрабатывают какнастадии, промывая осадок этанолом (2 х 2 мл). Защиту с фосфата снимают как встадии примера 4 и получают 0,188 г осадка, содержащего0,061 ммоль (89) окталитиевой соли соединения 20.Стадия Н, 2 -Дезокси)й -изобу 2тирилгуанилил,5 в (5 -дезокси--тиотимидилил)-3,5 -ди-(5 -деэокси-тио-й -анизоилцитидилил)-3 ,5 -в (5 -дезокси-тио-й-бензоиладенилил)-3 ,5 -ди-(5 -дезокси-тиотимидилил)-3 ,5 в (5 -дезокси-тиоlтимидин-фосфотиоат (21).0,183 г соединения 20, содержащего 0,061 ммоль его .+-соли и0,034 г литиевой соли 2 ,5 -дидезок 8си-тиотимидин-5-Р-цианэтилфосфотиоата (0,067 ммоль), встряхи 40 вают в 3 мл диметилформамида, содержащего 2 воды,в течение 4 ч, выдерживают еще 2 ч и обрабатывают как настадии. Защиту с Фосфата снимаюткак встадии примера 4 и получают45 после высушивания 0,19 г осадка,содержащего 0,055 ммоль (90) нонал- тиевой соли соединения 21, которуюочищают ионообменной хроматографией.Стадия Н). 2 -Дезокси(й -иэобу 50 тирилгуанилил,5 в (5 -дезокси-(2 х 2 мл). Защиту с фосфата снимают как встадии примера 4 и получают 0,18 г осадка, содержащего0,0485 ммоль (88) декалитиевойсоли соединения 22, которую очищаютионообменной хроматографией,Стадия 1 Х. 2 -Дезокси 1 й -изобутирилгуанилил,5 в (5 -деэокси-тиотимидилил)-3,5 -ди-(5 -дезокси--деэокси-тио-й -бензоиладенилил)-3 ,5 -тетра-(5 -деэокси-тиотимиУ г30дилил)-13 ,5 в (5 -дезокси-тиотимидин)-3 -фосфотиоат (23).0,18 г порошка неочищенного соединения 22, содержащего 0,0485 ммольего .+ -соли и 0,028 г литиевой соли(о2 ,.; -дидезокси-иодтимидин-5-/-цианэтилфосфотиоата (0,053 ммоль)встряхивают в 3 мл диметилформамида,содержащего 4 воды, в течение б ч,выдерживают раствор еще 4 ч и обрабатывают как описано встадии, промывают осадок в конце этанолом (2 х 2 мл),Снятие защиты с фосфата проводят какв 1 стадии примера 4, Получают0,178 г бесцветного порошка, содержащего 0,0435 ммоль (90) унцекалитиевой соли соединения 23, которую очищают ионообменной хроматографией.Стадия Х, 2 -Дезокси( й -изобутирилгуанилил,5 в (5 -дезокси 30,тилформамиде, содержащем 4 воды, втечение 7 ч, выдерживают еще 4 ч иобрабатывают как настадии, промывая осадок в конце этанолом (2 х 2 мл),Снятие защиты с фосфата проводят как 45встадии примера 4.Получают 0,182 госадка, содержащего 0,0388 ммоль(88) дедекалитиевой соли соединения 24, которую очищают ионообменной хроматографией. 50Стадия Х. 0,182 г соединения 24,содержащего 0,0388 ммоль его .1 -соли и 0,0395 литиевой соли 2 ,5 -диде.зокси-иодтимидин-5-3-цианэтилфосфотиоата (0,078 мйоль), встряхивают в 3 мл диметилформамида, содержащего 4 воды, в течение 8 ч, выдерживают 2 ч и обрабатывают как настадии. Защиту с фосфата снимаюткак встадии примера 4, а защитыс оснований нуклеотидов - как во 60стадии примера 1 и продукт выделяют при помощи ионообменной хроматографии на аминохроме как встадиипримера 3, используя градиент 0-0,3 Мбикарбоната аммония. Выход тридека аммонийной соли соединения 14 86(25),0,051 г дигидрата динатриевой соли 2 -дезокси-изобутирилгуанозин-фосфотиоата (0,1 ммоль) и 0,055 гнатриевой соли 2,5 -дидезокси--иодтимидин-5-(-цианэтилфосфотиоата (0,105 ммоль) растворяют в2 мл диметилформамида и,выдерживают1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь обрабатывают так жекак встадии примера 5. Получают0,083 г бесцветного порошка, содержащего 0,094 ммоль (94) тринатриевой соли соединения 25, которую очищают ионообменной хроматографией.Характеристики образцов соединений, полученных в примерах 1-6, привецены в таблице.Правильность структуры полученных олигодеэокситионуклеотидов основывается на:а) количественном протекании реакции образования 3 ,5 -фосфотиодиэфирной связи,б) наблюдении молекулярного весаи отрицательного заряда, что следует из данных гель- и ионообменнойхроматографии,в) образовании при неполном фосфодиэстеразном гидролизе набора олигонуклеотидов, число которых соответствует числу мономерных звеньевв исходном олигонуклеотиде, что свидетельствует о природном (3 , 5)типе связей между нимиг) полном расщеплении окислителями фосфотиодиэфирных связей с образованием набора окисленных мономеров,д) соответствии Уф-спектров полученных олигодезокситионуклеотидов расчетным данным.П р и м е р 7. Определение матричной активности октануклеотида 14,Реакционную смесь (0(5 мл), содержащую 0,16 мкмоль ГТФ;0,16 мкмоль 4 С-АТф. (удельная радиоактивность 0,84 /мкмоль);с0,01 моль меркаптоэтанола, 0,04 моль трис-НС 1 (рН 7,9); 0,01 моль М 9 С 1 436 мкг/мл РНК-полимеразы ЕьсЬег 1- сЬ 1 а со 11; октануклеотид - 2 о.е,/мл и г(А-А-А) - 2,7 о.е/мл инкубируют при 20 С, отбирая аликвоты по 0,05 мл. Их помещают на ватман 3 мм, высушивают, отмывают 5-ной -рихлоруксусной кислотой, содержащей 0,05 моль пирофосфата натрия, (3 х х 5 мл) при 0 С, затем этанолом, высушивают и определяют радиоактивность на счетчике ИагК 1. По полученным данным строят график зависимости ко253 (13,6) 224 (3,9) 0,046 1,06 100 99 257 (21,2) 236 (6,8) 0,058 0,96 15 807 99 269 (27,4) 231 (14,2) 0,071 0,88 270 (36,1) 234 (20,9) 0,087 0,79 1252 16 1697 98 0,103 0,70 264 (46,3) 231 (23,5) 265 (54,2) 232 (26,5) 2136 2462 О,119 0,62 98 266 (60,7) 232 (28,1) 0,130 0,54 267 (68,3) 233 (30,5) 0(142 0,45 267 (75,1) 234 (31,1) 0,153 0,38 2738 20 3114 3440 личсства продукта транскрипции от времени (фиг. 1).П р и и е р 8. Определение матричной активности додекануклеотида 15.Реакционную смесь, содержащую 0,16 мкмоль ГТФ; 0,48 мкмоль С-АТФ .(удельная радиоактивность 0,84 ф /мкмоль); 0,84 моль трис,-НС 1 (рН 7,9); 0,01 моль меркаптоэтанола;0,01 моль МОС 1, 262:лкг/мл РНК-полимеразы БьсЬег 1 сЬ 1 а со 11; додеканук 1002 267 (28,8) леотид - 2 о.е. и статистический тририбонуклеотид - 7,2 о.е., инкубируют 60 мин при 20 фС, отбирая аликвоты по 0,05 мп. Выделение продукта просводят как в прилере 7. Данные представлены на фиг. 2.Таким образом, испытуемые соединения 14 и 15 проявляют матричные своиства в РНК-полимеразной системе из- ЕьсЬег(сЬ 1 а со 11 и, следовательчо, являются биологически активными соединениягли.15 899571 Продолжение таблицы УФ-данныеб) Содержание концевых тиофосфатных групп )% Молекулярный веса рН 7 зЕ 10псих рН 7 Хюц)нм)мю нм рН 7 з с)Е,10 КНРО 1В 1 И 2 4м Соединение 23 267 83,4) 234 (33,7) 0,163 0,32 . 98,267 (91,2) 234 (35,0) 0,175 0,27 97 3766 24 4092 25 267 (97,8) 234 (36,8) 0,190 0,23 97 4115Соединения 2,5,8,14 и 15 - аммонийные соли, остальные - в виде литиевых солей,После снятия защит с аминогрупп оснований нуклеоотидов концентрированным аммиаком при 50 С в течение 4 ч,Ионообменная хроматография нааминохроме С-Зколонка40 мкл, градиент 0,25 М КН, РО 4 в 7 М мочевине(0,49 х 30 см),КО = -= в -" в , где Ч е - объем выходаЧ -Човещества с колонки; Чо "(свободныи объем) = 4 мл;У;,=5 мл,дачные иодометрического титрования раствором иодав метаноле,Примечания,а) в)с) е) ЗО Формула изобретения 35 40 Олигодезокситионуклеотиды общейформулы 5-С"г 0 ВО 00 5 СНЕГО+-10 о 0 5-сн0 00 9011 где В - тимин, цитозин, аленин,гуанин;Р - Н, остаток тиофосфата5-(-циан(или М,М-дифенилкарбомоил)этилфосфотиоатаи = 1,2,3,проявляющие матричные свойства вРНК-полимеразной системе из бьсЬег 1 сЬ(а со 11.Источники информации,принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССРпо заявке М 2414492/23-04,кл, С 07 Н 19/06, 28.06.77.45 2. СЬ 1 аде 1 5., МауумагуМис 1 еорЬ 111 с геасй 1 оп оГ воще пос 1 еов 1 де ойоьрЬогоСпоасеь - "1. Ящ.СЬещ,5 ос", 1972, Я 4, р. 2079.899571 60 РОремя фра 2. 1 О 1, миг У УО ремя Риа 1 Составитель В.Криворучко Редактор Г,Кацалап Техред З.фанта Корректор О. БилаЗакаУюоЕа гаоо Е 460 ф 30 Ъс у ь1 ЯЮ 2054/31 Тираж 389 ПодписноеВНИИПИ Государственного комитета СССРпо делам изобретений и открытий113035, Мосина, Ж, Раушская наб., д. 4/5 илиал ППП "Патент", г, Ужгород, ул. Проектная, 4