Рекомбинантная плазмидная днк рсек 10, кодирующая синтез фрагмента кленова днк-полимеразы 1 е. coli, и способ ее конструирования

Союз СОВЕТСКИХСОЦИАЛИСТИЧЕСКИХРЕСПУБЛИК бП 4 С 1 5 00 13 ОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССРО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ(1) Всесоюзный научно-исследователский институт молекулярной биологиии Институт цитологии и генетикиСО АН СССР(54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНКРСЕК 10, КОДИРУЮЦАЯ СИНТЕЗ ФРАГМЕНТАКЛЕНОВА ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ 1 Е.С 01 1 ИСПОСОБ ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ(57) Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии.Цель изобретения - повышение уровнясинтеза фрагмента Кленова ДНК-полимеразы Т Е.со 1 д. На основе векторнойчасти плазмиды рСЕЕ 12 и фрагментаВашН 1-Рз 11 плазмиды рС 155, содержащего последовательность нуклеотидов,ЯО 1392 кодирующую синтез фрагмента КленоваДНК-полимеразы 1 Е.со 1 (ФК), сконструирована рекомбинантная плазмидарСЕК 10 размером 7,21 т.п.о, Плазмидпозволяет получить штаммы-продуценты с повышенным уровнем синтеза ФК(не менее 375000-470000 ед. акт. на1 г сырого веса биомассы клеток). Последовательность, кодирующая синтезФК, находится под контролем промоторР, регулируемого встроенным е плазмиду геном термочувствительного репрессора с 1857, Двойной селективныйконтроль обеспечивается генайи устойчивости к ампициллину (Ь 1 а) и тетрациклину (Се). Плазмида не содержитдополнительных фаговых генов, понижающих ФК, и не требует специальногоштамма Е. со 11. Правильность ориентации последовательности, кодирующейФК, относительно промотора Р и вос-.становление целостности гена Ь 1 а присборке обеспечивается направленнымклонированием фрагмента в векторе.2 с.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл.Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмидную ДНК обеспеУ5 чивающую синтез фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 Е.со 1, и способ конструирования данной рекомбинантной плазмидной ДНК.Цель изобретения - повышение уров ня синтеза фрагмента Кленова ДНК- полимеразы 1 Е.со 1.Повышение синтеза обеспечивается за счет того, что сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК рСЕК 10 15 размером 7, 21 т.п.о., состоящая из векторной части рекомбинантной плазмидной ДНК рСЕЕ 12 длиной 3,50 т,п.о. и чужеродного фрагмента рекомбинантной плазмидной ДНК рС 1 55 размером20 3,71 т.п.о., имеющая уникальные сайты рестрикции ХЬоТ, Рз 1, Яа 1 С 1, ВашН 1, С 1 а 1, ген с 1857 фага Л для автономного, штаммонезависимого синтеза термочувствительного репрессора, 25 последовательность нуклеотидов, кодирующую фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 Е.со 1 д, промоторно-операторную область Р/Р ДНК фага Л, обеспечивающую регулируемую репрессором 30 транскрипцию гена с 1857 и последовательности, кодирующей фрагмент ДНК- полимеразы 1, а также гены устойчивости к антибиотикам тетрациклину и ампициллину с собственными промотор"35 ными участками, обеспечивающие возможность двойного селективного контроля.Способ конструирования рекомби" нантной ДНК рСЕК 10 заключается втом, что плазмидную ДНК рСЕЕ 12 обрабатывают последовательно эндонуклеазами рестрикции Е соКТ, ДНК-полимеразой 1 Е.со 1 в присутствии дезоксирибонуклеотидтрифосфатов для достройки липких концов ДНК до тупых, и после удаления этих ферментов из смеси фенольной экстракцией, эндонуклеазой рестрикции Рв 1. Из полученной смеси выделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле и электроэлюции векторную часть плазмидной ДНК рСЕЕ 12 размером 3,50 т.п.о. Рекомбинантную плазмидную ДНК рС 1 55 обрабатывают последовательно эндонуклеазой рестрикции Ваш Н 1, ДНК полимеразой 1 Е.со 1 х в присутствии дезоксирибонуклеотид трифосфатов, чем достигается достройка образовавшихся липких концов до тупых, и после удаления ферментов иэ смеси фенольной экстракцией, эндонуклеазой рестрикции Рз 1, и из полученной смеси выделяют методом электрофореза и электроэлюции фрагмент рекомбинантной плазмидной ДНК рС 155 размером 3,71 т.п.о. Затем полученные векторную часть плазмидной ДНК рСЕ 212 и фрагмент плазмидной ДНК рСЕ 55 сшивают ДНК-лигазой фага Т 4 в присутствииЮ АТР, при этом ковалентная сшивка фрагмента и векторной части происходит по тупым концам ДНК с одной стороны и липким концам, образуемым рестрик" ционной эндонуклеазой Рз 1, с другой стороны, чем достигается направленная встройка фрагмента в векторную часть, обеспечивающая правильную ориентацию последовательности, кодирующей фрагмент ДНК-полимеразы Т, относительно промоторно-операторной области Р/Р, и восстановление устойчивости к ампициллину, служащей селективным маркером при отборе целевой рекомбинантной ДНК рСЕК 10. Полученной смесью трансформируют СаС 1 г-обработанные клетки и из клонов, устойчивых к ампициллину и тетрациклину, выделяют целевую рекомбинантную плазмиду рСЕК 1 О.Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рСЕК 10 (фиг. 1). 10 мкг плазмидной ДНК рСЕЕ 12 гидролизуют 20 ед, рестрикционной эндонуклеазы Е соК 1 в 10 мкл ( буфета для гидролиза, содержащего 20 мМ трис-НС 1 рН 7,8, 10 мМ М 8 С 1 я, 50 мМ НаС 1, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, при 37 С 1 ч. В полученную рестрикционную смесь добавляют ЙАТР, ЙСТК и ТТР до 0,05 мМ каждого, 10 ед. ДНК- полимеразы 1 и инкубируют 30 мин при 12 С. Реакцию останавливают добавлением Ба ЭДТА до концентрации 20 мИ, белок удаляют экстракцией водным фенолом, рН 8,0, а ДНК трижды переосаждают 967.-ным этиловым спиртом из раствора 0,3 М ацетата натрия, рН 7,0. Полученный препарат ДНК растворяют в 100 мкл буфера для гидролиза, содержащего 20 мМ трис-НС 1 рН 7,8, 10 мМ М 8 С 1, 50 мИ НаС 1, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, .и гидролизуют 20 ед. рестрикционной эндонуклеазы Рз 1 при 37 С 1 ч. Реакцию останав 392094ливают добавлением Иа ЭДТА до концентрации 20 мМ, белок удаляют экст-. ракцией водным фенолом, рН 8,0, ДНК трижды переосаждают 96%-ным этиловым спиртом из раствора 0,3 М ацетата натрия, рН 7,0, Полученный препарат ДНК растворяют в 50 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НС 1 рН 7,8, 40 мМ Ба ЭДТА, 0,027. красителя бромфенолового синего, и разделяют рестрикционные фрагменты ДНК электрофорезом в 47.-ном полиакриламидном геле. Гель окрашивают в растворе бромистого этидия 2 мкг/мл, вырезают из геля зону, содержащую векторную часть ДНК плазмиды рСЕЕ 12, и выделяют ДНК из геля методом электроэлюции. 10 мкг плазмидной ДНК рС 155 гидролизуют 20 ед. рестрикционной эндонуклеазы ВашН 1 в 100 мкл буфера для гидролиза, содержащего 20 мМ трис-НС 1 рН 7,8, 10 мМ МяС 1, 50 мМ МаС 1, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, при 37 С 1 ч. В полученную реакционную смесь добавляют 25 ЙАТР, ВСТР, ЙСТР и ТТР, до 0,05 мМ каждого, 10 ед. ДНК-полимеразы 1 и инкубируют 30 мин при 12 С. Реакцию останавливают добавлением Иа ЭДТА до концентрации 20 мМ, белок удаляют экстракцией водным фенолом, рН 8,0 и ДНК трижды переосаждают 96%-ным этиловым спиртом из раствора 0,3 М ацетата натрия, рН 7,0. Полученный препарат ДНК растворяют в 100 мкл буфера для гидролиза, содержащего 20 мМ трис-НС 1 рН 7,8, 10 мИ МдС 1, 50 мМ БаС 1, 2 мМ 2-меркаптоэтанола, и гидролизуют 20 ед. рестрикционной эндонуклеазы Рз 1 при 37 С 1 чРеак цию останавливают добавлением НаЭДТА до концентрации 20 мМ, белок удаляют экстракцией водным фенолом, рН 8,0, ДНК трижды переосаждают 967-ным этиловым спиртом из раствора 45 0,3 М ацетата натрия, рН 7,0. Полученный препарат ДНК растворяют в 50 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-НС 1 рН 7, 8, 40 мИ На ЭДТА, 0,027 красителя бромфенолового сине 50 го, и разделяют рестрикционные фрагменты ДНК электрофорезом в 4%-ном полиакриламидном геле. Гель окрашивают в растворе бромида этидия 2 мкг/ /мл, вырезают из геля зону, содержащую фрагмент ДНК плазмиды рС 155, и выделяют ДНК из геля методом электроэлюции. 0,5 мкг полученного препарата векторной части ДНК-плазмиды,. рСЕЕ 12 и 0,5 мкг препарата Фрагмента ДНК плазмиды рС 155 растворяют в 30 мкл буфера для лигирования, содержащего 20 мМ трис-НС 1 рН 7,5, 10 мИ МяС 1, 10 мМ 2-меркаптоэтанола и 0,5 мМ АТР, и обрабатывают 2 ед, ДНК-лигазы фага Т 4 при 12 С в течение 12 ч. Полученную реакционную смесь используют для трансформации СаС 1 - обработанных клеток Е,со 1 д, которые затем высевают на 1,57 агар 1,В, содержащий 20 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина, и инкубируют при 30 С 16 ч. Из выросших индивидуальных колоний выделяют плазмидную ДНК известным методом.Полученную целевую рекомбинантную плазмидную ДНК рСЕК 1 О анализируют с помощью эндонуклеаз рестрикции с последующим электрофорезом в 4%-ном полиакриламидном геле (фиг. 2).П р и м е р 2. Использование рекомбинантной плазмидной ДНК рСЕК 1 О для создания штаммов Е.со 1 д - продуцентов фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 Е.со 1.0,02 мк рекомбинантной плазмидной ДНК рСЕК 10. берут для трансформации СаС 1 - обработанных клеток Е.со 1 д каждого из трех исследуемых штаммов У 1089, ИК 3 110 и И 4830, Индивидуальные колонии каждого из штаммов, выросшие при 30 С на чашках с 1,57 агаром ЬВ, содержащим ампициллин - 50 мкг/мл и тетрациклин - 20 мкг/мп, пересевают и выращивают в 50 мл среды 1,В с антибиотиками ампициллином 50 мкг/мл и тетрациклином 20 мкг/мл до плотности 0,8-1,0 о.е./мл, затем растят еще 2 ч при 42 С. Клетки осаждают центрифугированием, промывают буфером, содержащим 50 мМ трисНС 1 рН 7,5, замораживают в жидком азоте и хранят при -70 С.Из 1 г биомассы клеток Е.со 1 каждого штамма выделяют фермент. Фермент характеризуют по Ферментативной активности, гомогенность препарата доказывают анализом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия.Данные по определению количественного содержания уерментативно активного фрагмента ДНК-полимеразы 1 в различных штаммах Е.со 1 приведены в таблице.Из данных таблицы видно, что предлагаемая плазмида рСЕК 10 обеспечивает почти десятикратное по сравнениюс прототипом рС 1 55 увеличение выходане отличающегося по удельной активности от прототипа активного Фермен."та, при этом плазмида не требует специального штамма, содержащего профаг5(либо его Фрагмент)с 1857,Суммарное количество фермента вединицах активности.Изобретение позволяет получитьштаммы-продуценты фрагмента КленоваДНК-полимеразы 1 Е.со 1 х, Уровень синтеза Фермента в полученных штаммахЕо со 13. У 1089, ЫК 3 1 10 и Б 4830, содержащих плазмиду рСЕК 10, не менее375000-471)000 ед. сырого веса биомассы клеток, что в 7,5 - 9 раэ вышеуровня синтеза этого Фермента в сравнении с лучшими из известных штаммов -Е.со 1 Н 4830, содержашим плазмидурС 1 55. Полученный положительный эффект изобретения достигается за счетсвойств сконструированной новым способом плазмиды рСЕК 10,25Формула изобретения 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рСЕК 10, кодирующая синтез фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 Е.со 1, с мол. мас. 4,75 мО и размером 7,21 т.п.о., содержащая Ряг.1-ЕсоК 1 - Фрагмент плазмидной ДНК рСЕЕ 12 размерой 3, 50 т. и. о., Ваш Н 1-Ря 1 - Фрагмент рекомбинантной плазмидной ДНК рС 1 55 с последовательностью, которая кодирует Фрагмент Кленова ДНК- полимеразы 1 Е,со 1, размером 3,71 Штамм Е.со 1 з. ферВыход фермента, е.а/г клеток, (И+ш) 10д 1 лаэмида Пр едла- гаемая 47,014,1 44 213,8 9,6+0,89 8+1,0 У 1089ИК 3110 рСЕК 10 37,8+5,2по методу, изго из 1 г клеток.единицах акщенног ыделен ента ивности. 1392094 6т,п,о., уникальные сайты эндонуклеаэрестрикции Ряс 1. Нпй 111 - два сайта Хпо 1. С 1 а 1, Ваш 1, Яа 1 С 1, генетические маркеры плазмиды: Ь 1 а - ген,обеспечивающий синтез я-лактамазы,ес - ген, обеспечивающий устойчивость к тетрациклину, л ро 1 А - последовательность, кодирующую синтезфрагмента Кленова ДНК-полимераэы 1Е.со 1, с 1 - ген репрессора Фагас 1857, и промоторы Р 1,Р, Р ,.2. Способ конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рСЕК 10,заключающийся в том, что рекомбинантную плазмидную ДНК рСЕЕ 12 обрабатывают последовательно эндонуклеазойрестрикции Е соК 1, ДНК-полимеразой 1Е.со 1 и эндонуклеазой рестрикцииРя 1 и из полученной смеси выделяютметодами электрофореза и электроэлюции векторную часть плазмидной ДНКрСЕЕ 12 размером 3,50 т.п.о., рекомбинантную плазмидную ДНК рС 1 55 обрабатывают последовательно эндонуклеаэой рестрикции ВашН 1, ДНК-полимераэой 1 Е,со 11 и эндонуклеазой рестрикции Ря 1, из полученной смеси выделяют Фрагмент рекомбинантной плазмидной ДНК рС 1 55 размером 3,71т.п.о., затем векторную часть плазмидной ДНК РСЕК 12 и фрагмент плаз"мидной ДНК рС 1 55 сшивают ДНК-лигазой фага Т 4, полученной смесью трансФормируют клетки Е.со 1 и из клонов,устойчивых к ампициллину и тетрациклину выделяют целевую рекомбинантную плазмидную ДНК рСЕК 10.1392094 дщ У/Р. УЯ оставитель Т ехред М,Диды оикина Корректор С Шекмар ор Н.Киштулине аказ 18 о 8/3 Тираж 520осударственнога коми ам изобретений и атк ква, Ж, Раушская одпис дприятие, г. ужгород, ул, Проектная, 4 оизводственно-полиграфическо ВКИИПИ по д 13035 М