Способ получения большого фрагмента днк-полимеразы i еsснеriснiа coli фрагмента кленова

СОЮЗ СОВЕТСНИХСОЦИАЛИСТИЧЕСНИХРЕСПУБЛИН 125 С 12 И 15 ИОАНИ ТЕН смолекулярэ еннс пнос й би ии в частрментов ных раос нер бо Цель изобретения повышение выости и качеств способа и ег г есотличительную ту,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИНМПРИ ГКНТ СССР(71) Научно-производственное объединение Фермент и Всесоюзный научноисследовательский институт особо читых биопрепаратов(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БОЛЬШОГО ФРАГМЕНТА ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ 1 ЕБСНЕК 1 СН 1 АСОЫ-ФРАГМЕНТА КЛЕНОВА(57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, вчастности к способам получения фер-.ментов для обеспечения геннс-инженерных работ, Целью изобретения является повышение выхода, удельной активности и качества очистки фермента.Отличительная черта предложенного бретение относитсяологии и биотехнолк способам получеииеснечения генно-инж хода, удельной активочистки фермента.Основу предложены 1541256 А способа получения фрагмента Кленова,обеспечивающая достижение цели,новая совокупность методических приемов на стадии хроматсграфическойочистки ферментного препарата. Хроматографию проводят в 2 этапа: сначала на колонке с ион-гидрофобнымсорбентом - солозой КГ 8/24 и элюцией активного белка линейным градиентом КС 1 от 0 до 1 М в буферном растворе; затем на колонке с красителемкрасно-коричневым 2 К, иммобилизованным на СЬ-сефароэе 6 В через декстрани тем же, что к в первом случае, способом элюции. Выход препарата составляет 65 Е, удельная активность (приопределении с ДНК тимуса теленка)15000 ед,/мг, чистота 96,2%. Фрагмент Кленова, полученный новым способом, может быть использован длявсех видов генно-инженерных работ.Применение изобретения имеет большоезначение в решении задачи обеспечениябиотехнологических исследований в нашей стране необходимым количествомфермента высокого качества. 2 э.п.ф-лы, 1 табл. печивающую достижение поставл й цели, составляет новая совоку ть методических приемов на стадии хроматографической очистки ферментного препарата.После фракционирсвания фермента сульфатом аммония проводят хроматографию на колонке с ион-гидрофобным ссрбентом - сслоэой КГ 8/24 с элюци- . ей активного белка линейным гради 1541256, растворе, После этой стадии выходфрагмента Кленова достигает 75-80%,а очистка - 30 раз, На втором этапе5хромато графической очистки используют колонку с красно-коричневым 2 К,иммобилизованном на С 1.-сефарозе 6 Вчерез декстран, и тот же принцип элюции, что и на первой стадии, Послевторого этапа хроматографическойочистки выход фермента составляет60-65%, а очистка - 150 раз,Чистота препарата по данным электрофореза в ПАА-геле составляет96,2%. Полученный препарат имеетудельную активность 15000 ед./мг(при определении с ДНК тимуса теленка) и 90000 ед./мг (при определении с ДНК лосося), что в 2-3 разавыше, чем при получении Фермента из-вестным способом. Фрагмент Кленова,очищенный предложенным способом, отвечает современным требованиям кэтому препарату и может быть использован в секвенировании ДНК методомСэнгера и в сайт-специфическом мутагенезе при решении задач белковойинженерии.П р и м е р 1. Получение сорбента - солозы КГ 8/24.Приготовление дисперсионной среды.В реактор, снабженный мешалкой, обратным холодильником и термометром,вводят 325 мл,тридекана и стабилизаторы суспензии (9 ии) Брапи(0,7 мл) Тюееп, перемешивают прикомнатной температуре в атмосфереаргона,Приготовление дисперсной Фазы.40В отдельной емкости проводят растворение в смеси (30 мл) диметилформамида и (42 мл) воды следующих компонентов: метакриловая кислота 4,1 мл;метиленбисакриламид 2,7 мл; пероуиьФит аммония 1,03 г и бутилметакрилат1,1 мл, Перемешивают при комнатнойтемпературе. Полученный раствор представляет собой дисперспую Фазу,Формирование эмульсии и полимеризация, В дисперсионную среду при перемешивании и барботаже аргоном вводят дисперсную фазу, включают обогревреактора и проводят полимеризацию при70 С в течение 5 ч. Далее гранулы 55сорбента отделяют Фильтрованием, отмывают водой и детергентом, и далее -дистиллированной водой. Фракционируют мокрым рассевом на ситах, выделяя фракцию 80-120 мкИ.Получение аффинного сорбентаС 1.-сефарозы бВ - красно-коричневый2 К. К 180 мл С 1,-сефарозы 6 В производства фирмы Фармация (Швеция) прибавляют 40 мл воды, нагревают доо60 С и при перемешивании механическоймешалкой прибавляют небольшими порциями 478 мг красно-коричневого 2 К,растворенного в 20 мл воды. Послеперемешивания в течение 30 мин прибавляют 24 г ИаС 1 и перемешивают при60 С еще 1 ч. Смесь нагревают до80"С, прибавляют 2,1 г ЫаСОэ, перемешивают 2 ч, фильтруют и отмываютхолодной и горячей (80 С) водой дополучения бесцветного Фильтрата. Получается сорбент, содержащий ,7 мкМкрасителя красно-коричневого 2 К на1 мл СЬ-сефарозы 6 В. Приготовленныйсорбент СЬ-сефароза бВ - красно-коричневый 2 К имеет ФормулуОНИХаО,В-( -Юн-ынЯ. ы 80,ХаО-СЕРдРОЗА С 1. - 6 ВДия определения концентрации крас-но-коричневого 2 К на сефарозе в элюэнте измеряют оптическую плотностьпри 525 нм и согласно молярному коэффициенту экстинкции красителя(13500 м " л см -), находят количество непрореагировавшего красно-коричневого 2 К. Из разницы между взятым количеством красно-коричневого2 К и найденным в элюэнте находятколичество лиганда в микромолях на1 мл сефарозы,Выделение и очистка ФрагментаКленова, Получение ферментного экстракта. 50 г клеток Е.со 1 суспендируют в 200 мл 0,05 М трис НС 1 рН7 9 5 буфера, содерж дщего О, 002 М ЭДТА0,001 М дитиотрейтола, 0,02 мМ фенилметилсульфонилфторида и 1 мг/мллизоцимаСуспензию выдерживают15 мин в ледяной бане и разрушаютультразвуком на дезинтеграторе УЗДН 2 Т. Обломки клеток осаждают центрифугированием при 48000 ц в течение 1 ч.Выпавший осадок отбрасывают, центриФугат (215 мл) используют для выделения Фермента,Фракционирование ферментного экстракта полимином Р и сульфатом аммония. К центрифугату (215 мл), полу5 15412 ченному на предыдущей стадии, при постоянном перемешивании в течение 30 мин добавляют 107.-ный (13,7 мл) раствор полимина Р до конечной концентрации 0,67, После добавления 5 всего объема полимина перемешивание продолжают еще 30 мин. Экстракт центрифугируют в течение 15 минпри 4000 Полученный осадок используют для получения фрагмента Кленова. Фермент экстрагируют из осадка 100 мл 0,1 М калий-фосфатным буфером рН 7,0, содержащим 0,001 М /ь-меркаптоэтанол, 0,002 М ЭДТА, 0,1 М ЯаС 1. Процедуру повторяют еще раз. Супернатанты объединяют, Экстракт центрифугируют в течение 15 мин при 4000 я. К супернатанту (230 мп), медленно перемеши вая, добавляют сухой сульфат аммония 20 до 607. насыщения смесь перемешивают. на магнитной мешалке в течение 30 мин. Раствор центрифугируют в течение 15 мин при 21000 а. Осадок отбрасывают, а к супернатанту добавляют су хой сульфат аммония до 857.-ного насыщцнияя. Осадок собирают, растворяют в 20 мл О, 01 М калий-фосфатного буфера рН 7, О, содержащего 0,001 М в-меркаптоэтанола, помещают в диализ .ную трубку и диализуют в течение 18 ч против 2 л указанного буфера. Получают 34 мл диализата.Хроматография фрагмента Кленова на колонке с солозой КГ 8/24. Диализат фермента (34 мл) подвергают хроматографии на колонке (1,523 см) с солозой КГ 8/24, уравновешенной диализным буфером. После нанесения ферментного раствора колонкупромыва ют 150 мл исходного буфера, Элюирование фермента осуществляют линейным градиентом (450 мл) КС от 0 до 1, 0 М в исходном буфере. Собирают фракции по 9 мл. Фрагмент Кленова элюируется в пределах 0,4-0,6 М КС 1, Активные фракции объединяютПолучают 50 мл ферментного раствора, который диали- зуют в течение 18 ч против 2 л 0,01 М трис-С буфера рН 7,5, содержащего 0,01 М МяС 1, 00 М /Ь-меркаптоэтанола и 67. глицерина. Получают 50 мл диализата.Хроматография фермента на колонке с СЬ-сефарозой 6 В - красно-корич 55 невый 2 К, Диализат фрагмента Кленова (50 мл) подвергают хроматографии на колонке (1,5 х 14 см) с СЬ-сефарозой 6 В - красно-коричневый 2 К,56 6уравновешенной диализным буфером.После нанесения ферментного раствор;колонку промывают 75 мл исходногобуфера, Элюирование фермента осуществляют линейным градиентом (250 мл)КС 1 от 0 до 1,0 М в исходном буфере, Собираот фракции по 5 мл. Фрагмент Кленова элюируется в пределах0,25-0,6 М КС 1Активные фракцииобъединяют и используют для концентрирования.Концентрирование конечного препаратаОбъединенные фракции диализуютпротив 50 мл 0,05 М калии-фосфатногобуфера рН 7,0, содержащего 0,5 мМдитиотрейтола и 50% глицерина (пообъему). Диализ продолжают в течение12 ч. Препарат помещают в предварительно охлажденную емкость и хранятпри -20 СВыход фрагмента Кленоваосоставляет 6000 ед,/г биомассы судельной активностью 15000 ед./мгбелка,Активность фрагмента Кленова определяют по включению в активированную тимусную ДНК (обработанную панк"реатической дезоксирибонуклеазой),За единицу активности принимаетсято количество фрагмента Кленова, которое при температуре 37 С за 30 минвключает 10 нмоль дезоксирибонуклеозидфосфатов в ДНК-матрицу,П р и м е р 2. Способ полученияфрагмента Кленова осуществляют аналогично примеру 1, однако при хроматографии на колонке с солозой КГ8/24 используют исходный буфер, содержащий 0,005 М калий-фосфат рН 6,5и 0,0005 М -меркаптоэтанол, а прихроматографии на колонке с СЬ-сефарозой 6 В - красно-коричневый 2 К используют сорбент, содержащий 1,2 мкМкрасителя/мл сефарозы, а исходный буфер содержит О, 005 М трис-НС 1-буферрН 7,0; 0,005 М МяС 1 р-меркаптоэтанол и 57-ный глицерин. Выход фермента составляет 5000 ед./г биомассы судельной активностью 13000 ед./мгбелка,П р и м е р 3. Способ полученияфрагмента Кленова осуществляют ана-логично примеру 1, однако при хроматографии на колонке с солозой КГ8/24 используют О, 05 М калий-фосфатрН 7,5 и 0,005 М -меркаптоэтанол,а при хроматографии на колонке сСЬ-сефарозой 6 В - красно-коричневый2 К используют сорбент, содержащий1541256 Способ поКонцент"рацияФермента,ед./мкл ВыходФермента, Е Удельнаяактивлуче ни яфрагментаКленова ность, ед,/мг белка по примеру 65 15000 17,0 60 13000 15,0 63 14000 16, 0 Составитель О. СкуратовскаяТехред М.Ходанич Корректор О. Кравцова Редактор А, Мотыль Подписное Тираж 501 Заказ 264 ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж, Раушская наб., д. 4/5Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 2,4 мкМ красителя/мл сефарозы, а исходный буфер содержит О, 05 М трисНС 1-буфер рН 7,8; 0,05 М МяС 1 д0,05 М р-меркаптоэтанол и 10 -ныйглицерин. Выход Фермента составляет5470 ед./г биомассы с удельной активностью 14000 ед./мг белка.Результаты получения фермента попредлагаемому способу представленыв таблице,Таким образом, преимущество предложенного способа заключается в возможности получения высокоочищенногопрепарата с более высокими выходоми удельной активностью, чем при использовании известных способов,Применение изобретения имеет боль.шое значение в решении задачи обеспечения генно-инженерных работ в нашейстране необходимым количеством фраг.мента Кленова высокого качества,Формула изобретения1. Способ получения большого Фрагмента ДНК-полимеразы 1 ЕзсЬег 1 сЫа со 11 фрагмента Кленова, включающий разрушение бактериальных клеток, осаждение нуклеиновых кислот и связанныхс ними белков полимином Р, экстракциюосадка раствором хлористого натрия,фракционирование сульфатом аммонияи хроматографическую очистку конечного продукта, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения выхода, удельной активности и качестваочистки Фермента, хроматографическуюочистку проводят в две стадии: на колонке с солозой КГ 8/24 и элюцией 15 ,пикейным градиентом КС 1 от 0 до 1 Мв буферном растворе, а затем на колонке с СЬ-сефарозой 6 В, связаннойс красителем красно-коричневым 2 К, иэлюцией линейным градиентом КС 1 от 20 0 до 1 М в буферном растворе.2. Способ по п. 1, о т л и ч а -ю щ ч й с я тем, что в качестве буфера при хроматографии на колонке ссолозой КГ 8/24 используют 0,0050,05 М К-фосфатный буфер с рН 6,57,5, содержащий О, 0005-0,005 М д-меркаптоэтанол.3. Способ по п, 1, о т л и ч а ю.30щ и й с я тем, что в качестве буфера при хроматографии на колонке сСЬ-сефарозой - красно-коричневым 2 Киспользуют О,005-0, 05 М трис-НС 1- буФер с рН 7,0-7,8, содержащий 0,005- 35 0,05 М МРС 1, 0,005-0,05 М р-меркаптоэтанол и 5-107.-ный глицерин,