C12N 15/31 — гены, кодирующие микробные белки, например энтеротоксины

Номер патента: 1615181

Опубликовано: 23.12.1990

Авторы: Булгакова, Попов

МПК: C12N 15/31, C12Q 1/68

Метки: бактерий, днк, днк-зонда, еsснеriснiа, иде, идентификации, конструирования, микроба,несущих, пестициногенности, плазмидная, плазмиду, продуцент, рек-7-днк-зонд, рекомбинантная, чумного, штамм, штаммов

...Злюат экстрагиру ют Фечолом, хлороформом и обрабатываю эфиром. ДНК плазмиды рАТ 153(10 мкг) подвергают гидролизу рестриктазами Ипд 111 и ВапН 1 по методике, описанной ныше. Больший 15 (3,3 т.п,н,) из двух полученных в результате гидролиза фрагментов извлекают из геля. электроэлюцией. Злюаточищают от примесей агарозы и смешивают с злюатом, содержащим Нлпс 1 111- 20 "ВапН 1 - ррагмент рРзс, ДНК осаждают 96 Е-ным этаколом, промывают 70 Еньм зтанолом и подсушивают, Осадокрастворяют н буфере для легирования(5 ец,), Легирование проводят 1012 ч при 16 С.В. Анализ рекомбннактных плазмид 30 и получение штамма - продуцента Р 1- зонда для диагностики штаммов чумногомикроба,хлорамфениколом (С = 20 мкг/мл).ДНК плазмид рРзС и рАТ вьделяют.Клетки...

Номер патента: 1616991

Опубликовано: 30.12.1990

Авторы: Бобков, Бобкова, Гараев, Комбарова, Мазурова, Маркина

МПК: C12N 15/31

Метки: дифтерии, индикации, коринебактерий, токсигенных

...1 явя, г/л: М 880 225; ф-аланин 1,15; цц 161699110 30 50 котиновая кислота 1,15, биотин 0,075;СцБО 4 5 НО 0,5; ЕйБ 0,1 7 НО 0,8;МпС 1 4 Н О 0,3 р НС 1 ци, 60 мп. Клетйки вйращивают до титра 107 кл/млв течение 24 ч, затем осаждают центрифугированием (4000 я, 10 мин,+4 С) и ресуспендируют в 50 мл09 01 М трис- НС 1, рН 8,0, Клетки повторно осаждают и ресуспендируют в8 мл буАера, содержащего 0,5 М сахарозы, 0,01 М трис-НС 1, рН 8,0. Ксуспензии клеток добавляют лизоцимдо конечной концентрации 2 мг/мл иинкубируют в течение 2 ч при 37 С.Клетки осаждают центрифугированием,ресуспендируют в 8 мл буАера, содержащего 0,01 М трис- НС 1, рН 8,0,0 01 М ЭДТА, добавляют ЛСН до 1 Х и9йинкубируют ггри 65 С в течение 15 мин, 20Для гибридизации полученные...

Номер патента: 1669981

Опубликовано: 15.08.1991

Авторы: Мишанкин, Павлович, Романова

МПК: C12N 15/31, C12Q 1/68

Метки: coli, francisella, бактерий, днк, еsснеriснiа, зонда, источник, плазмидная, плазмидную, представителей, рrд, рекомбинантная, рекомбинантную, рода, содержащий, тестирован, тестирования, штамм

...смеси трансформируют штамм Е,со 1 М 103,Выбор штамма обусловлен тем, что вприсутствии рО С 19 он способен синтезировать фермент /3-галактоэидаэу эа счет комплементации дефектного хромосомальногогена Й-концевым фрагментом гена, находящегося на плазмиде, Эта способность штаммане проявляется в присутствии рекомбинант 5 ной плаэмиды со встроенным по ЕсоВ 1 сайтуфрагментом ДНК, длина которого не кратнатрем, вследствие сдвига рамки считывания,В-галактозидаэы. Клоны с такими рекомбинантными плазмидами, не обладающие /310 галактозидаэной активностью, могут бытьотобраны на индикаторной среде с хромогенным субстратом Х-ца по отсутствию голубой окраски,Клетки культуры Е,со 11 М 103, транс 15 формированные лигазной смесью, высеивают на чашки с...

Номер патента: 1677059

Опубликовано: 15.09.1991

Авторы: Мишанкин, Подладчикова

МПК: C12N 15/31

Метки: бактерий, возбудителя, днк, еsснеriснiа, зонда, идентификации, источник, конструирования, плазмидная, плазмиды, продуцент, рекомбинантная, рекомбинантной, чумы, штамм

...геле,Лигазной смесью (1/10 ч) трансформируют штамм Е.со. После трансформации культуру высеивают на агаризованную средуВ, содержащую 50 мкг/мл ампицилли 1677059на, 40 мкг/мл индикатора Р -галактозидазной активности Хца 1 и 240 мкг/мл индуктора 3-галактозидазы ИПТГ (изопропил- /3-Д-тиогалактопиранозид). Через 14 - 20 ч на чашках вырастают колонии трансформантов. Рекомбинантные клоны отбирают по отсутствию Р -галактозицазной аос, поскольку у них нарушается способность синтезировать Р-галактозидазу из-за сдвига рамки считывания фермента при встраивании в векторную плазмиду фрагмента ДНК длиной 280 п.,о.Из клеток рекомбинантных клонов была выделена плазмидная ДНК, Анализ плаэмидных ДНК осуществляют с помощью рестриктаз Мзр 1 и Есой 1....

Номер патента: 1678837

Опубликовано: 23.09.1991

Авторы: Злобин, Плетнев, Шаманин

МПК: C12N 15/31, C12Q 1/68

Метки: выделения, зонд, идентификации, кислот, нуклеиновых, флавивирусов, фрагмент

...6000 об/мин, Осадок растворяют вбуфере 7,5 Ф формальдегид - 1 О мй натрий фосфат, рН 7,0, и определяютконцентрацию РНК спектрофотометрически, принимая 1 о.е. Аь= 40 мкг РНК,Иммобилизация РНК на нитроцеллюлозных фильтрах. РНК денатурируютпрогревом в 7,5 ь-ном растворе формальдегида 15 мин при 56 фС, затемдобавляют раствор 20ЯЯС (3,0 Инатрий хлорид - 0,3 М натрий цитрат,рН 7,0) го концентрации 1 ОЯЯС и образцы РНК наносят на нитроцеллюлозные Фильтры. Фильтры сушат при комнатнсй температуре 15-30 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу 2 чпри 80 фС.Мечение олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды метят с помощью полинуклеотидкиназы Т 4 (13) в присутствии= зР-АТР (1000 Ки/ммоль) до удельной активности 500-1000...

Номер патента: 1738856

Опубликовано: 07.06.1992

Авторы: Артюшин, Бортюк, Коромыслов, Косенко, Овдиенко, Фомин

МПК: C12N 15/31, C12Q 1/68

Метки: видов, воvis, дифференциации, днк, других, зонд, мuсовастеriuм, микобактерий, плазмидная, рекомбинантная, рмб-01, тuвеrсulоsis

...как описано в примере 1,Результаты исследований приведенына фиг, 2. Кэк видно из представленных данных, положительные сигналы, свидетельствующие о гибридизации клонированкойпоследовательности с ДНК микобактерий,отмечены в местах нанесения М. Ьочз (точки А 1 и А 2), М, Ьоч 1 з ВСО (точки С 1-С 4). Приэтом не отмечалось положительных сигналов в точках нанесения ДНК микобактерийдругих видов.Полученные данные свидетельствуют, оспецифичности используемого зонда по отношению к ДНК М. Ьог 1 з.П р и м е р 3. Использование выделенного фрагмента ДНК М. Ьоч 1 з ВСО для дифференциации культур М. Ьоч 1 з, М. 1 цЬегсц 1 оз 1 з от культур микобактерий других видов,Для приготовления препаратов культурмикобактерий культуры микобактерий (39 .5...

Номер патента: 1761806

Опубликовано: 15.09.1992

Авторы: Вакуленко, Навашин, Фомина, Энтина

МПК: C12N 15/31

Метки: днк, фрагмент

...Проводят в стандартных условиях гидролиз плазмидной ДНК эндонуклеазной рестрикции Н 1 пб 11 и в присутствии маркеров молекулярной массы устанавливают, что детерминанта резистентности к гентамицину, сизомицину, тобрамицину и нетилмицину находится в составе Н 1 пб 111 фрагмента размером 2,3 т.п,н,При помощи метода Сэнгера определяют нуклеотидную последовательность клонированной детерминанты резистентности. В результате компьютерной обработки результатов ген отнесли к типу аасС 2 а,Из лабораторного штамма Е.со 11, содержащего рекомбинантную плазмиду рЯИ 1, щелочным методом выделяют плазмидную ДНК в препаративных количествах. Проводят рестрикцию плазмидной ДНК эндонуклеаэой Есо Ю. Фрагмент размеров 537 п,н. вырезают из геля, проводят...

Номер патента: 1761807

Опубликовано: 15.09.1992

Авторы: Вакуленко, Навашин, Фомина, Энтина

МПК: C12N 15/31

Метки: бактерий, еsснеriснiа, штамм

...фермент ААС(3)- а, выращивают в :бульоне в течение ночи при 37 С, Иэ бактериальной суспензии изолируют ДН К Я-плазмиды, имеющую мол.м. 70 Мд и содержащую детерминанту резистентности к гентамицину, тобрамицину, сизомицину и нетилмицину. Выделенную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Нпб и лигируют с ДНК векторной плазмиды рОС 19, гидролизованной эндонуклеазой Нпб, Смесью, содержащей лигированные молекулы, трансформируют реципиентный штамм Е,со ЗМ 101, Трансформанты, содержащие рекомбинантные плазмиды, отбирают на агаризованных средах, содержащих гентамицин в концентрации 10 мкг/мл, Отобранные трансформанты рассевают до отдельных колоний на агаризованной средеВ, содержащей 10 мкг/мл гентамицина. Отдельную колонию выращивают в...

Номер патента: 1768639

Опубликовано: 15.10.1992

Авторы: Каримова, Михайлова, Панферцев, Степаншина, Черепанов

МПК: C12N 15/31

Метки: g824, j-антиген, j-антигена, бактерий, днк, еsснеriснiа, кодирующая, конструирования, микроба, плазмидная, продуцент, рекомбинантная, чумного, штамм

...100 мкг/мл,Из сконструированного таким образом банка генов У.ремз отбирают клон, дающий положительную реакцию диффузионной преципитации с моновалентной анти- сывороткой (4), Рекомбинантная плазмидная ДНК, выделенная из этого клона, получает наименование р 67 (фиг. 1),Рекомбинантную плазмидную ДНК р 07 используют в качестве донора при создании плазмиды р 682. В качестве вектора при этом используют предварительно созданную плазмиду рР - делеционнь 1 й вариант малой плазмиды рРа 1 У,резбв, в которой фрагмент ЕсоВ - Нпб заменен на фрагмент ДНК, кодирующий ген сас (устойчивости к хлорамфениколу) из плазмиды рВВ 325, 1 мкг ДНК плазмиды р 67 смешивают с 1 мкг ДНК плазмиды рР 1 и инкубируют с рестриктазой Крп (5 ед.) в буфере 1 (трис-НС....

Номер патента: 1787165

Опубликовано: 07.01.1993

Авторы: Берит, Берн, Бритт, Дэвид, Мари, Микаэль, Фредерик, Ян

МПК: C12N 15/31

Метки: адгезивными, антигенного, обладающего, препарата, свойствами, фимбрий

...лигирование ВцИ-ЗаИ) фрагмента - произ 40 водных плазмиды с вектором рМС 874, последовательно обработанным эйдонуклеазами ВцИ и ЗаИ, трансформацию рекомбинантными плазмидными ДНК штамма бактерий ЕзспегсЫа соИ, выра 45 щивание, выделение и очистку целевого продукта с помощью аффинной хроматографии.35 1787165 36 Таблица 1 Характеристики плазмид, используемых для составления карты и функционального анализа рарА, рэрЕ, рарГ и рарбПлазм ида Релевантный генотипГемаггл ютинация рарР Тп 5-002 рарР;: Тп 5-0 21 рарб Тп 5-026 рарб Тп 5-042 Неупорядоченного типа р 5 й 002 рЯЙ 021 10 рЮ 026рЗИ 042 рРАР 5 рРАР 15 рРАР 14 15 рРАР 7рРАР 20 рРАР 19 Таблица.2 Характеристики штаммов Е.со 1 и Т и плазмидных клонов, кодирующих соответствующий...

Номер патента: 1807081

Опубликовано: 07.04.1993

Авторы: Власов, Вуцан, Монахова, Седых

МПК: C12N 15/31, C12Q 1/68

Метки: pes78vcs, pes78vcs-источник, бактерий, вибрионов, днк, еsснеriснiа, зонда, идентификации, плазмидная, плазмидной, продуцент, рекомбинантная, рекомбинантной, холерных, штамм

...отбирали по признакуАр Тес,Из 12 различных по размерам встроенных фрагментов ДНК вибриона рекомби 40 нантных плазмид (случайная выборка) спомощью эндонуклеазы Нпб В были получены соответствующие фрагменты и испытаны на видоспецифичность в качествемолекулярных зондов, Радиоактивную мет 45 ку (32 Р-АТР или 32 Р-СТРг. Ташкент, межреспубликанское объединение В/О"Изотоп") вводили с помощью ник-трансляции,Гибридизацию проводили на нитроцел 50 люлозных фильтрах после получения на нихотпечатков колоний Ч.стоегае 01 ине 01(150 штаммов), и 12 других видов рода Ч 1 Ьг 1 о(всего 37 штаммов), а также шигелл, сальмонелл, аэромонад, алломонад, псевдомонэд55 и Е,соИ (всего 25 штаммов) и их соответствующей обработки с использованием модифицированного...

Номер патента: 2000331

Опубликовано: 07.09.1993

Авторы: Алимов, Фаизов, Хазипов, Шилова

МПК: C12N 15/31, C12Q 1/68

Метки: выявления, микобактерий

..."Регк 1 пЕп 1 ег" определяли концентрацию выделенных ДНК,2. Фрагментация видов микобактерий рестриктазой Есо 91,1, дающей широкий спектр гибридиэирующих полос, электрофорез и блоттинг.Очищенный от белков ДНК микобактерий в количестве 5 мкг переносили в пробирки эпиндофора. Туда же добавляли до 18 мкл бидистиллированной воды, 2 мкл 10 х буфера рестрикции (50 мМ йаС 1, 10 мМ трисНС 1, рН 7,5, 10 мМ МоС 2, 5 мМ 2-меркаптоэтанол) и осторожно перемешивали. Затем вносили 3 мкл рестриктаэы Есо 91 1, перемешивали и помещали на 3 ч в термостат при температуре 37 С. Реакцию останавли 2000331вали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.Полученные Фрагменты ДНК подвергали электрофорезу в горизонтальном блоке0,8-ного агарозного...

Номер патента: 1524485

Опубликовано: 20.11.1995

Авторы: Добрица, Дубовая, Михайлов, Носков, Такаева

МПК: C12N 1/21, C12N 15/31

Метки: aureus, bacillus, staphylococcus, subtilis, бактерий, белка, днк, кодирующая, конструирования, плазмидная, продуцент, рекомбинантная, рмм, синтез, штамм

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pMM 9, кодирующая синтез белка A Staphylococcus aureus, размером 6,7 т. п. н. содержащая: Pst I-EcoR I-фрагмент векторной плазмиды pPL 608 размером 4,7 т. п. н. EcoR I-Pst I-фрагмент хромосомы Staphylococcus aureus Cowani размером 2,0 т. п. н. несущий ген белка A с собственным промотором; cat-ген хлорамфениколацетилтрансферазы без промотора; Kmг-ген устойчивости к канамицину; уникальные сайты рестрикции EcoR I; Pst I; круг хозяев - грамположительные бактерии.2. Способ конструирования плазмиды pMM 9, кодирующей белок A, заключающийся в том, что смесь ДНК Staphylococcus aureus Swant I и плазмиды pBR 327 гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой Pst I, фрагменты соединяют ДНК-лигазой, смесью...