Способ выделения и очистки внеклеточной гуанилрибонуклеазы тriсноdеrма наrziаnuм

(51 РЯТ:Я У АБ 5,ляв0 с вия сорбцииммобилиобами,ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОЫИТЕТ СССР ПО ДЕЛМЯ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТ САЙКЕ ИЗОБ ОРЛИНОМУ СЗИДЕТЕЛЬ(71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов и Ин титут биохимии им. А.Н,Баха(56) Безбородова С.И., Бородаева Л.И., Панкова Л.Н. Способность низших грибов синтезировать внеклеточные РНК- азы". - Микробиология, 1968, т. 31, вып. 1, с. 10-14.Авторское свидетельство СССР1125982, кл. С 12 И 9/04, 1984, (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ГУАНИЛРИБОНУКЛЕАЗЫ ТК 1 СНОВЕВМА НАЕ 21 АИПМ(57) Изобретение относится к микробиологической промышленности. в частности к способу выделения гуанилрибонуклеазы, применяется в молекулярной биопогии для изучения структуры РНК и Ферментативном синтезе олигорибонуклеотидов. Сущность изобретения заключается в том, что фильтрат культуральной жидкости Тг 1 сйодеппа Ьагк 1 апшп хроматографируют непосредственно на КМ-целлюлозе при рН 12 М 9/22//(С 12 Н 9/22, С 1 К 1;885 ф Р , ль Щ,7-с. 0-7,3, при этом сорбцию осуществют в статике или динамике, а элюциюдинамике ступенчатым грациентом,2 и 0,5 М ацетата натрия рН 7,3 или 0,25 М тряс-НС 1 с 1,0 М ИаС 1, или прямолинейным градиентом 0,01- 0,5 М ацетатно-аммиачного буфера рН 5,3, после чего активные Фракции подвергают диализу против 0,01-0,02 М тряс-НС 1 буфера рН 7,3-7,7, пропускают через ДЗАЗ-целлюлозу в том же буфере и окончательно хроматографируют на КМ-целлюлозе, при этом для элюции используют ацетатно-аммиачный буфер рН 5,4 или прямолинейный градиент 0,01-0,5 М хлористого натрия в 0,02 М трис-НС 1 буфере, или последовательно два градиента: вначале прямолинейный градиент 0,01-0,05 М трисНС 1 буфера рН 7,3, а затем градиент 0,2 М хлористого натрия в трис-НС 1 буфере того же рН. Предложенный спооб позволяет получить гуанилрибонуклеазу со щелочными свойствами с выходом 48-542 и удельной активностью 2860-4500 ед/мл, которая в отличие от РНКазы С легко отделяется от кислых продуктов ее дейст ей на катионитах и легчезуется традиционными снос1 табл.Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способу выделения гуанилрибо(нуклеазы (рибонуклеат-гуанилоолигонуклеотид-гидролазы, К.Ф,З.1.27.3),5применяемой в молекулярной биологиипри изучении структуры РНК для получения нуклеозид,.3 -циклофосфатов,а также при ферментативном синтезеолигорибонуклеотидов с заданной последовательностью нуклеотидов,Изобретение заключается в том,что фильтрат культуральной жидкости,полученной в результате выращиванияТг 1 сйооегаа йагг 1 апцш 01 на комплексной питательной среде., хроматографируют непосредственно на КМ-целлюлозе,при этом сорбцию осуществляют в статике или динамике, а элюцию - в динамике градиентом ацетата натрия илиацетата аммония, или хлористого натрия в буфере, после чего активныефракции подвергают диализу против буфера, пропускают через ДЭАЗ-целлюлозу и хроматографируют на КМ-целлюлозе.Предлагаемый способ заключа.етсяв следующем.Культуральную жидкость, полученную после выращивания на комплекснойпитательной среде гриба Тгзспос 1 егшаЬагяапцш О 1, фильтруют через бумагуна вакуум-фильтре. При сорбции в динамике пропускают через колонку с КМцеллюлозой со скоростью 100 в 5 мл/ч.35При сорбции в статике в Фильтраткультуральной жидкости вносят 1/10влажного веса КМ-целлюлозы (вес наобъем), перемешивают, фильтруют исорбент переносят в колонку. Основная масса сопутствующих белков и пигментов не сорбируется на КМ-целлюлозе. За счет этого достигается очистка в 100-500 раз. После промывки45колонки фермент элюируют ацетатомнатрия или ацетатом аммония, илисолью в буфере. Выход по активностидостигает 70%. Активные Фракции диализуют против трис-НС 1 буфера и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлю 50лозой, Рибонуклеаза проходит черезколонку, не сорбируясь, а часть сопутствующих белкоь и пигментов связывается сорбентом. При этом достигается 8 - 15-кратная очистка с100%-ным выходом по активности. Далее рибонуклеазу хроматографируют наКМ-целлюлозе в том же буфере. Для элюции используют ступенчатый или прямолинейный градиент хлористого натрия в буфере или последовательно два градиента.В результате получают гуанилрибонуклеазу с изоэлектрической точкой около 9,5, активностью 2500 4500 ед/ /Аво=1, в известных единицах, выходом 48-57%, степенью очистки в пределах от 6000 до 8000 раз.Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. 11,0 л культуральной жидкости Тг. Ьатк 1 апцш О 1 фильтруют через бумажный фильтр на вакуум-фильтре и фильтрат с активностью 14,5 ед/мл подкисляют до рН 5, 1- 5,3 2 М соляной кислотой и вносят в колонку с КМ-целлюлозой, предварительно уравновешенной 0,01 М ацетатно-аммиачным буфером рН 54, со скоростью 500 мл/ч. Затем колонку промывают 0,01 М ацетатно-аммиачным буфером рН 5,3 и элюируют фермент прямолинейным градиентом буфера (0,01- 0,5 М) того же рН со скоростью 160 мл/ч. Активные фракции концентрируют ультрафильтрацией через мембрану УМи диализуют против 0,01 М трис-НС 1 буфера рН 7,7, Затем раствор фермента вносят в колонку с ДЭАЗ- целлюлозой (4 х 16 см), уравновешенную тем же буфером, со скоростью 100 мп/ч и промывают 100 мл исходного буфера, Вся активность фермента находится во фракциях, выходящих из колонки. После подкисления до рН 5,0 0,5 М уксусной кислотой раствор фермента, вносят со скоростью 60 мл/ч в колонку с КМ-целлюлозой (2 х 7 см), уравновешенной 0,01 М ацетатно-аммиачным буфером, рН 5,4. Фермент элюируют 0,5 М ацетатно-аммиачным буфером того же рН, Получают 7 мл раствора фермента с удельной активностью 2860 ед/А ь =1 и степенью очистки в 6000 раз с выходом по активности 50%.П р и м е р 2. 27 л фильтрата культуральнойжидкости с активностью 15 ед/мл, полученного в результате выращивания гриба Тг. Ьагядапцш О 1, после подкисления до рН 5,5-6,0 2 М соляной кислотой вносят в 4 парал- лельные колонки с КМ-целлюлозой (3 колонки 6,8 х 30 см и одна 7,7 х х 30 см), Перед сорбцией колонки уравновешивают 0,01 М ацетатным буфером рН 5,5. Затем колонки промывают ис"ходным буфером и элюируют фермент последовательно ступенчатым градиентом 0,2 и 0,5 М ацетата натрия рН 7,4. Активные Фракции концентрируют ультрафильтрацией через мембрану УМ,5 концентрат диализуют против 0,01 М трис-НС 1 буфера рН 7,3 и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой(бх 12,5 см), уравновешенной этим же буфером. Затем раствор ферментавносят в колонку с КМ-целлюлозой (4 х 10 см), уравновешенной 0,02 М трис-НС 1 буфером, рН 7,3, Элюируют рибонуклеазу прямолинейным градиен том хлористого натрия (0-0,5 М) в 0,02 М трис-НС 1 рН 7,3 со скоростью 85 мл/ч. Получают 140 мл раствора фермента с удельной активностью32000 ед/Аю =1, степенью очистки в 20 8000 раз и выходом по активности 573,П р и м е р 3. К 15,7 л фильтрата культуральной жидкости Тг. Ьагг 1 аппш 01 с активностью 30 ед/мл после подкисления до рН 5,0 2 М соляной кислотой для сорбции в статических условиях прибавляют 0,75 кг влажной КМ- целлюлозы, предварительно уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером, рН 5, 1, перемешивают 30 мин при комнатной температуре и отделяют сорбент фильтрованием на вакуум-фильтре, К полученному таким образом фильтрату прибавляют еще 0,75 кг влажной КМ- целлюлозы, перемешивают 30 мин и35 фильтруют. Обе порции сорбента взмучивают в 0,01 М ацетатном буфере рН 5, 1 и вносят в колонку (7,8 х 60 см) .Далее сорбент промывают 5 л буфера и элюируют фермент 0,25 М трис-НС 1 буфером рН 7,3, содержащим 1 М хлористого натрия. Раствор фермента диалиэуют против 0,01 М трис-НС 1 буфера рН 7,3 и пропускают через колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (4 х 17 см) со ско, 45 ростью 500 мл/чЗатем проводят хроматографию на КМ-целлюлозе в колонке (1,8 х 7,6 см). Элюцию осуществляют двумя градиентами со скоростью70 мл/ч. Вначале используют прямолинейный градиент буфера (0,01-0,05 М, объем сосудов 150 мп), а затем градиент хлористого натрия (0,0-0,2 М) в 0,05 М трис-НС 1 буфере рН 7,3. Фермент элюируют 0,1 М раствором хлористого натрия, Получают 33 мл раствора55 Фермента с удельной активностью 4500 ед/А ю =1 и выходом по активности 547.В таблице приведены результатыочистки, описанные в примерах 1-3,а также еще двух очисток (опыты 5,6),н которых использовались иные усл. -вия, и результаты оказались значительно хуже.Преимущество предлагаемого способа заключается в получении достаточно простым методом гуанилрибонуклеаэысо щелочными свойствами высокойудельной активности от 2860 до4500 ед/мл и выходом от 48 до 547,включающем всего три этапа. очистки,причем первый этап очистки при использовании сорбции в статике значительно сокращается, а хроматографияна ДЭЛЭ-целлюлозе сводится к простойФильтрации путем пропускания раствора фермента через соответствующуюколонку.Гуанилрибонуклеаза, являющаясящелочным белком, в отличие от РНКазы С легко отделяется от кислыхпродуктов ее действия сорбцией на катионитах и легче иммобилизуется традиционными способами,Формула изобретенияСпособ выделения и очистки внеклеточной гуанилрибонуклеазы ТгсЬойегша Ьагк 1 апцш 0 1, заключающийпя в хроматографии фильтрата культуральной жидкости на КМ-целлюлозе при рН 5,0-7,3, сорбции фермента в статике или динамике и элюции фермента с КМ- целлюлозы ступенчатым градиентом 0,2-0,5 М ацетата натрия или 0,25 М трис-НС 1 с 1,0 М хлористым натрием, или градиентом 0,01-0,5 М ацетатноаммиачного буфера, полученные активные фракции подвергают диализу против 0,0 1-0,02 М трис-НС 1 буфера с рН 7,3- 7,7 и очистке на ДЭАЭ-целлюлозе в том же буфере, с последующей хроматографией на КМ-целлюлозе, при этом для элюции используют 0,5 М ацетатноаммиачный буфер или линейный градиент 0,01-0,5 Г 1 хлористого натрия в 0,02 М трис-НС 1 буфере, или последовательно два градиента: вначале линейный градиент трис-НС 1 0,0 1-0,05 М, а затем линейный градиент хлористого натрия 0,01-0,2 И в трис-НС 1 буфере.13)1)93 3 ю м Ь М2 4нам ю Перенй 3 яронеторрефдлне МИ-деллолозе Алетер+ Фефет ней ьзефетняе Дцечотчо" еиюечнИ йдететноеоейнъоч 0,01 0,01 Цолл "цое,сорд, рредн".о,т Стулен-.ч етний Второй: дропуененне через дЗАВ-делличозу 7,Э трос-БС 1 0,01 0,07 О,о: третий 1 нронетотрефннне КН деллюлозе Сороцна7,3 6,5 трио-ИС 1 Бус.ео лцететноеммнечиьйО,О) 0,01 0,02 О,О) О,О 1 Оро) Иоллрлоеть Сор 11 е РЙГднр 1 те Студенчетьй Студенфчетйй НрнйолннейнййПренолинейнйй Сочтен 0,5 Иедет-ещ. Иес 1 (О"0,5 И) втрнс"НС 1 6 е с.д,1:л Э 2 ОО Составитель В.СоинаТехред И. Дидьд . Корректор С,1 Иекмар Редактор Н. Кишту 71 инец Заказ 18 о 8/30 Тираж 520 Подписное В 11 ИИПИ Государственного комитета СССР во делам изобретений и открытий 11303" Иосква, Ж, Раушская наб, д, А/5